董彥莉，劉卉閔，李超，馬晶軍，崔曉娜

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，河北 保定 071000；2.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院 食品藥品科技系，山東 濰坊 261061)

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磁性石墨烯-液質(zhì)聯(lián)用測(cè)定雞肉中萬古霉素和喹諾酮

董彥莉1，劉卉閔1，李超1，馬晶軍1，崔曉娜2

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，河北 保定 071000；2.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院 食品藥品科技系，山東 濰坊 261061)

建立了雞肉中萬古霉素和喹諾酮類藥物殘留的磁性石墨烯固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法.樣品采用乙腈提取，磁性石墨烯粉分散固相萃取凈化，經(jīng)Agilent ZORBAX SB-C18(3.0 mm ×100.0 mm，1.8 μm)色譜柱分離，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè).目標(biāo)物在2.0～50.0 μg/L內(nèi)線性關(guān)系良好(r2>0.99).雞肉基質(zhì)中目標(biāo)化合物在5、10、25 μg/kg加標(biāo)水平的回收率為71.2%～98.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為6.8%～14.3%.該方法凈化效果好，回收率高，精密度好，可用于雞肉中萬古霉素和喹諾酮類藥物殘留檢測(cè).

磁性石墨烯固相萃取(MSPE)；液質(zhì)聯(lián)用法；萬古霉素；喹諾酮類

萬古霉素(vancomycin)是由鏈霉菌產(chǎn)生的、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的糖肽類抗生素，由于萬古霉素具有嚴(yán)重耳毒性及腎毒性[1]，因此只宜在其他抗生素對(duì)病菌無效時(shí)才會(huì)被短期使用于搶救，農(nóng)業(yè)部560號(hào)公告規(guī)定萬古霉素為禁用獸藥.喹諾酮類(quinolones，QNs)藥物是一類抗菌作用強(qiáng)的人工合成抗菌藥.近年來，該類藥物在動(dòng)物源性食品中殘留的現(xiàn)象普遍存在，從而危害人類健康.為了對(duì)QNs類獸藥殘留實(shí)施監(jiān)控，許多國(guó)家紛紛制定出喹諾酮在動(dòng)物性食品中的限量[2].美國(guó)FDA規(guī)定了家禽肉中的部分QNs的限量.日本批準(zhǔn)使用的QNs僅有恩諾沙星、二氟沙星、奧比沙星、達(dá)氟沙星、馬波沙星、氧氟沙星和噁喹酸[3].中國(guó)農(nóng)業(yè)部發(fā)布的235號(hào)和236號(hào)公告亦對(duì)QNs的限量作了規(guī)定[4].目前檢測(cè)萬古霉素和喹諾酮類藥物的方法很多，包括高效毛細(xì)管電泳、高效液相色譜及液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)等.質(zhì)譜檢測(cè)器具有高靈敏度和選擇性，定性、定量準(zhǔn)確，適合進(jìn)行多組分獸殘的快速檢測(cè).

磁性石墨烯由氧化石墨烯化學(xué)制備而成，不僅保持了氧化石墨烯優(yōu)越的吸附性能，同時(shí)具有磁性，能在外加磁場(chǎng)的作用下快速?gòu)臉悠啡芤褐蟹蛛x，因此，非常適合作為固相萃取的吸附劑[4-6].

本文采用實(shí)驗(yàn)室制備磁性石墨烯最常用的共沉淀法(氧化還原法)和溶劑熱法，并進(jìn)行了綜合改進(jìn)來進(jìn)行磁性石墨烯的制備[7-10]，采用制備的磁性石墨烯進(jìn)行前處理凈化，建立了雞肉中萬古霉素和10種喹諾酮類藥物的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，方法簡(jiǎn)便，快速，靈敏度高，重現(xiàn)性好，為打擊獸藥非法添加提供了技術(shù)支持.

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

1.1.1 試劑

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)萬古霉素、麻保沙星、伊諾沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、洛美沙星、雙氟沙星、沙拉沙星、環(huán)丙沙星-D8，均購(gòu)自DR.公司，純度大于99%.

乙腈、甲醇均為色譜純(Fisher)；無水硫酸鈉，分析純(煙臺(tái)市雙雙化工)；甲酸，色譜純(TEDIA)；水，GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水；磁性石墨烯，實(shí)驗(yàn)室制備；硫酸銅，優(yōu)級(jí)純(天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司)；1-(2-吡咯偶氮)-2-萘酚(PAN)，分析純(北京化學(xué)試劑有限公司).

1.1.2 儀器

液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent1290-6460)；分析天平：感量0.1 mg和0.01 g各1臺(tái)；離心機(jī)(5810型、Eppendorf公司)；均質(zhì)器(T25型，IKA公司)；振蕩器(MMV-1000 W，ETELA公司)；氮吹儀(N-EVAP)；渦流混勻器(IKA MS basic).

1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

萬古霉素、麻保沙星、伊諾沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、洛美沙星、雙氟沙星、沙拉沙星：用乙腈溶解，按純度標(biāo)示折算配制成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液.

環(huán)丙沙星-D8(內(nèi)標(biāo)): 用乙腈溶解，按純度標(biāo)示折算配制成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品提取

準(zhǔn)確稱取(2.00±0.02)g待測(cè)雞肉樣品置于50 mL離心管中，加入2 g氯化鈉(NaCl)和10 mL乙腈，均質(zhì)2 min，10 000 r/min離心10 min，待凈化.

1.2.2 樣品凈化

稱取10 mg磁性石墨烯于10 mL離心管中，取6 mL上清液(1.2.1)入離心管中，置于振蕩器上振蕩2 min.用磁鐵將磁性石墨烯聚集到離心管底部，將上清液轉(zhuǎn)入5 mL離心管中，氮?dú)獯蹈?，流?dòng)相定容至1 mL，過0.22 μm濾膜，進(jìn)行HPLC-MS/MS測(cè)定分析.

1.2.3 液相色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18(1.8 μm,3.0 mm×100 mm)；柱溫：40 ℃，流速：0.3 mL/min，進(jìn)樣量：20 μL；流動(dòng)相(體積分?jǐn)?shù))：A.0.1%甲酸水，B.乙腈，梯度洗脫程序(體積分?jǐn)?shù))：0→3.0 min，由10%B→30%B；3.0→5 min，由30%B→70%B；5.0→7.0 min，由70%B→90%B；7.01 min，10%B，平衡3 min.

1.2.4 質(zhì)譜條件

電離方式：ESI+；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流速：10 L/min；噴霧針壓力：0.2758 MPa；電子倍增器電壓：4 000 V；碰撞氣：高純氮，99.999%，12種化合物質(zhì)譜參數(shù)見表1.

表1 12種化合物的質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

喹諾酮類藥物在極性方面相近，色譜分離方面要盡可能選擇合適的色譜柱，以提高色譜柱分離速度和靈敏度，在色譜柱的選擇性方面，選用粒徑1.8 μm填料的色譜柱，分別比較Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 系列1.8 μm填料，柱長(zhǎng)分別為2.1 mm×50 mm、2.1 mm×100 mm、3.0 mm×100 mm，以及C18與C8(1.8 μm，3.0 mm×100 mm)2種相同規(guī)格，不同性質(zhì)的色譜柱，綜合比較了分離效率、靈敏度，柱長(zhǎng)為3.0 mm×100 mm C18更好一些.同時(shí)選用1.8 μm的填料，使得柱體單位體積內(nèi)的表面積大大增加，柱效顯著提高，使用0.3 mL/min的柱流速與電噴霧離子化方式所要求的流速具有良好的匹配.

2.1.2 流動(dòng)相的選擇

2.1.2.1 流動(dòng)相組分的選擇

為獲得最佳的分辨率和靈敏度，分別選用甲醇/水、乙腈/水、甲醇/0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸水溶液、乙腈/0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸水、乙腈/10 mmol/L乙酸銨、甲醇/10 mmol/L乙酸銨溶液作為流動(dòng)相，在電噴霧源ESI+方式下，在乙腈/0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸水溶液組成的流動(dòng)相中，質(zhì)譜的離子化效率優(yōu)于其他試劑，因此本文選擇乙腈/0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸水作為流動(dòng)相.

2.1.2.2 梯度洗脫條件的選擇

分別將初始流動(dòng)相比例調(diào)整為40∶60、30∶70、20∶80、10∶90，經(jīng)多次進(jìn)樣分離結(jié)果表明：初始流動(dòng)相中有機(jī)相的體積分?jǐn)?shù)占10%，梯度變化有機(jī)相漸變，目標(biāo)物峰形較好，分離時(shí)間較短，梯度變化過快會(huì)導(dǎo)致麻保沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、達(dá)氟沙星、環(huán)丙沙星出峰出現(xiàn)重疊.在本文的梯度洗脫條件下，12種化合物的出峰情況見圖1.

圖1 12種化合物的總離子流譜圖Fig. 1 Chromatogram of vancomycin and quinolones

2.2 質(zhì)譜條件的選擇

萬古霉素屬于糖肽類大分子抗生素，通常以鹽酸鹽形式存在，極性較強(qiáng).分別在正離子模式和負(fù)離子模式下進(jìn)行質(zhì)譜離子優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在正離子模式下響應(yīng)值較高，流動(dòng)相中加入甲酸后質(zhì)譜離子化效率更佳.萬古霉素分子質(zhì)量為1 449.263 5，因其帶雙電荷，母離子掃描在正離子模式下724.9響應(yīng)較高，符合解離規(guī)律.子離子掃描時(shí)分別在100～1 000、1 000～1 500內(nèi)進(jìn)行，發(fā)現(xiàn)m/z144.1，m/z1 143.9響應(yīng)較高，如圖2所示.

圖2 分別在100～1 000、1 000～1 500內(nèi)子離子掃描圖Fig. 2 Daughter scan in 100～1 000 and 1 000～1 500

2.3 方法的線性、精密度、檢測(cè)限和定量限

按照本方法所確定的實(shí)驗(yàn)條件，分別在空白雞肉樣品中添加質(zhì)量濃度為2.0～50 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，其峰面積Y與對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度X(μg/L)在此范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，2種凈化方法的相關(guān)系數(shù)如表2所示.按10/1的信噪比計(jì)算最低定量限，按3/1的信噪比計(jì)算萬古霉素的檢出限(LOQ)為0.050 mg/kg，喹諾酮類物質(zhì)的最低檢出限(LOQ)為0.005 mg/kg.

表2 雞肉中萬古霉素和喹諾酮類物質(zhì)的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、回收率和變異系數(shù)

2.4 磁性石墨烯前處理方法與傳統(tǒng)方法的比較

磁性石墨烯比表面積大，相對(duì)于較傳統(tǒng)的QuEChERS方法 C18、PSA、NH2、石墨凈化方法固相萃取凈化技術(shù)用量少[11-12]，但凈化效果更佳，能夠?qū)崿F(xiàn)高通量樣品分析，溶劑消耗少，樣品制備簡(jiǎn)便、快捷.比較了同一加標(biāo)濃度下，采用磁性石墨烯凈化處理，與采用傳統(tǒng)QuEChERS方法凈化的雞肉樣品的HPLC-MS/MS測(cè)定結(jié)果，如表3所示.

表3 磁性石墨烯與QuEChERS凈化方法比較分析

3 結(jié)論

將自制的磁性石墨烯作為前處理凈化材料，建立了雞肉中萬古霉素和喹諾酮類藥物殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法.磁性石墨烯固相萃取凈化法較傳統(tǒng)QuEChERS方法，具有用量少、凈化效果好、回收率高的優(yōu)點(diǎn)，使雞肉中萬古霉素和喹諾酮類藥物的檢測(cè)限和定量限均降低.本文建立的磁性石墨烯固相萃取-液質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定萬古霉素和10種喹諾酮類藥物殘留方法，簡(jiǎn)便，靈敏度高，回收率高，精密度好，適用于雞肉中萬古霉素和喹諾酮類藥物的同時(shí)檢測(cè).

[1] 冼燕萍,陳立偉,羅海英,等.UPLC-MS/MS法測(cè)定豬肉中萬古霉素和去甲萬古霉素[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào),2013,32(2): 162-167.DOI:10.3969/j.issn.1004-4957.2013.02.004. XIAN Y P,CHEN L W,LUO H Y,et al.Quantitative determination of vancomycin and norvancomycin in pork by u ltra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].Journal of Instrumental Analysis,2013,32(2): 162-167.DOI:10.3969/j.issn.1004-4957.2013.02.004.

[2] ZHENG J，HUANG X R,LI Y P.Determination of remained enrofloxacin in eel by eLISA [J].Food Science,2004，25(10):247-250.DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2004.10.060.

[3] 王柯,王艷艷,趙東保,等.HPLC法測(cè)定金銀花不同部位中木犀草素及其苷的含量[J].河南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2011，41(1):39-43.DOI:10.3969/j.issn.1003-4978.2011.01.009. WANG K,WANG Y Y,ZHAO D B,et al.Determination of the contents of luteolin and luteoloside in different parts of lonicera japonica by HPLC[J].Journal of He nan University (Natura1 Science),2011，41(1):39-43.DOI:10.3969/j.issn.1003-4978.2011.01.009.

[4] LIU Q,SHI J B,ZENG L X,et al.Evaluation of graphene as an advantageous adsorbent for solid-phase extraction with chlorophenols as model analytes[J].Journal of the Chromatography A，2011,1218(2):197-204.DOI:10.1016/j.chroma.2010.11.022.

[5] LIU Q,SHI J B,SUN J T,et al.Graphene and graphene oxide sheets supported on silica as versatile and high-performance adsorbents for solid-phase extraction[J].Angewandte Chemie International Edition，2011,50(26):5913-5917.DOI:10.1002/anie.201007138.

[6] LUO Y B,SHI Z G,GAO Q,et al.Magnetic retrieval of graphene: Extraction of sulfonamide antibiotics from environmental water samples[J].Journal of Chromatography A，2011，1218:1353-1358. DOI:10.1016/j.chroma.2011.01.022.

[7] HUMMERS W,OFFEMAN R.Preparation of graphite oxide[J].Journal of the American Chemical Society,1958,80(6):1339.DOI:10.1021/ja01539a017.

[8] STAUDENMAIER L.Verfahren zur darstellung der graphitsaure[J].Berichte der Deutschen Chemischen Gesellschaft，1898,31(2):1481-1487.DOI:10.1002/cber.18980310237.

[9] BRODIE B C.Surle poids atomique du graphite[J].Annual Review of Physical Chemistry，1860，59: 466-472.

[10] ZHOU Y，BAO Q L,TANG L A L.Hydrothermal dehydration for the green reduction of exfoliated graphene oxide to graphene and demonstration of tunable optical limiting properties[J].Chem Mater,2009,21:2950-2956.DOI:10.1021/cm9006603.

[11] 賈其娜,趙廣超.石墨烯固相微萃取纖維的制備及對(duì)多氯聯(lián)苯的檢測(cè)[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào),2015,32(5):541-546.DOI:10.3969/j.issn.1004-4957.2013.05.004. JIA Q N,ZHAO G C.Preparation of graphene-based solid phase microextraction fiber and Its determination of polychlorinated biphenyls[J].Journal of Instrumental Analysis,2015,32(5):541-546.DOI:10.3969/j.issn.1004-4957.2013.05.004.

[12] 丁葵英,許文娟,李凱,等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法研究涕滅威及其代謝物在白菜中的動(dòng)態(tài)行為[J].色譜,2016,34(2):165-169.DOI:10.3724/SP.J.1123.2015.08018. DING K Y,XU W J,LI K,et al.Dynamic behavior of aidcarb and its metabolites in cabbage by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].Chinese Journal of Chromatography,2016,34(2):165-169.DOI:10.3724/SP.J.1123.2015.08018.

(責(zé)任編輯：梁俊紅)

Determination of vancomycin and QNs residues in chicken by graphene based-MSPE-liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry

DONG Yanli1，LIU Huimin1，LI Chao1，MA Jingjun1，CUI Xiaona2

(1.College of Science，Agricultural University of Hebei，Baoding 071001，China；2.Department of Food and Drug Science and Technology, Shandong Vocational Animal Science and Vetevinary College，Weifang 261061，China)

A method for the determination of vancomycin and quinolones residues in chicken was developed using liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS).The sample was extracted with acetonitrile and purified using MSPE as the sorbent.The target compounds were separated on a Agilent ZORBAX SB-C18 column (3.0 mm×100 mm，1.8 μm) before submitting for detection by high-resolution mass spectrometry.The results showed that high correlation coefficients (r2>0.99) of the analyses were obtained within their respective linear ranges.The average recoveries and the relative standard deviations ranged from 71.2% to 98.8% and 6.8% to 14.3% respectively at the spiked levels of 5，10，25 μg/kg in chicken．This method is reliable，and suitable for the determination of vancomycin and quinolones residues in chicken.

graphene MSPE；liquid chromatography mass spectrometry；vancomycin；quinolones

10.3969/j.issn.1000-1565.2016.05.006

2015-03-15

河北省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(14227115D)；山東省濰坊市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2015GX044)

董彥莉(1981—)，女，河北鹿泉人，河北農(nóng)業(yè)大學(xué)副教授，主要從事分析化學(xué)方面的研究. E-mail:dyl19810314@126.com

O652

A

1000-1565(2016)05-0480-07