張靜，黃建安,2,3，蔡淑嫻，易曉芹，劉建軍，王英姿，田麗麗，劉仲華,2,3*

1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2. 國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3. 植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128

茶黃素與EGCG抑制體內(nèi)外β-淀粉樣蛋白1-42水平及其誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷

張靜1，黃建安1,2,3，蔡淑嫻1，易曉芹1，劉建軍1，王英姿1，田麗麗1，劉仲華1,2,3*

1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2. 國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3. 植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128

通過(guò)模擬生理?xiàng)l件體外實(shí)驗(yàn)，將β-淀粉樣蛋白1-42（Aβ42）與EGCG和4種茶黃素單體分別按照1∶1和1∶5比例進(jìn)行孵育，采用硫黃素T熒光檢測(cè)β-折疊結(jié)構(gòu)的生成量，結(jié)果表明，EGCG與茶黃素均能明顯降低β-折疊結(jié)構(gòu)生成，從而抑制Aβ42聚集；此外，通過(guò)建立20μmol·L-1Aβ42誘導(dǎo)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞損傷模型，將不同濃度的EGCG或茶黃素（10、50、100μmol·L-1）處理后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，同時(shí)，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）及丙二醛（MDA）等抗氧化指標(biāo)，結(jié)果表明，EGCG與茶黃素可抑制因Aβ42誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞活力下降及氧化損傷。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)10mg·kg-1·d-1的EGCG或茶黃素處理快速老化模型小鼠（SAMP8），10周后檢測(cè)小鼠血清Aβ42及晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）含量，結(jié)果表明，EGCG和茶黃素可顯著降低SAMP8小鼠血清中Aβ42及AGEs含量。本研究表明了茶黃素和EGCG可抑制Aβ42聚集纖維化及Aβ42導(dǎo)致的神經(jīng)氧化損傷，從而對(duì)阿爾茨海默病具有一定保護(hù)作用。

EGCG；茶黃素；β-淀粉樣蛋白1-42；晚期糖基化終末端產(chǎn)物；SH-SY5Y細(xì)胞；SAMP8小鼠

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s desease，AD）作為最常見(jiàn)的老年癡呆病，早在一個(gè)世紀(jì)前已被歸為神經(jīng)退行性疾病，AD的發(fā)病率僅次于心血管疾病及癌癥，成為第三大流行病[1]。AD致病因子的作用機(jī)制較為復(fù)雜，因此有不同假說(shuō)解釋其發(fā)病機(jī)制，如基因假說(shuō)、淀粉樣蛋白假說(shuō)、氧化應(yīng)激假說(shuō)、炎癥機(jī)制學(xué)說(shuō)、膽堿能學(xué)說(shuō)等；雖然有關(guān)AD的細(xì)胞分子機(jī)制未完全明確，但大量基因、生物化學(xué)及分子生物學(xué)研究支持淀粉樣蛋白假說(shuō)，淀粉樣蛋白假說(shuō)認(rèn)為，β-淀粉樣蛋白（Amyloid-β，Aβ）才是造成AD的罪魁禍?zhǔn)?，腦內(nèi)Aβ生成與清除之間失去平衡將使Aβ大量積累，這將是AD最主要的發(fā)病機(jī)理[2]。Aβ聚集將導(dǎo)致一系列問(wèn)題，如炎癥、突觸損傷、tau蛋白聚集、氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡等[3]。Aβ聚集過(guò)程中將產(chǎn)生具有毒性的寡聚體和淀粉樣纖維，其富含穩(wěn)定的β折疊（β-sheet）結(jié)構(gòu)。同時(shí)，有研究表明糖基化終末產(chǎn)物（Advancedglycation end products，AGEs）可促進(jìn)Aβ聚集并增強(qiáng)其穩(wěn)定性[4]，從而加劇AD的主要病理特征。

表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（Epigallocatechingallate，EGCG）和茶黃素（Theaflavins，TFs）分別是綠茶和紅茶中的主要功能成分。兒茶素占茶葉干重12%～24%，EGCG是兒茶素的主要成分之一，占兒茶素總量的50%～80%[5-6]；紅茶中茶黃素一般以茶黃素（Theaflavin，TF）、茶黃素-3-沒(méi)食子酸酯（Theaflavin-3-gallate，TF-3-G），茶黃素-3'-沒(méi)食子酸酯（Theaflavin-3'-gallate，TF-3′-G）和茶黃素雙沒(méi)食子酸酯（Theaflavin-3, 3'-digallate，TF-DG）4種為主體成分，紅茶中茶黃素含量通常不超過(guò)2%，甚至低至0.3%[7]。較多研究表明[8-11]，以EGCG為主的綠茶多酚類化合物以及紅茶提取物能直接與松散無(wú)折疊的淀粉樣蛋白相結(jié)合，從而促進(jìn)其形成無(wú)毒性單體結(jié)構(gòu)，而不是形成具有毒性的β-sheet結(jié)構(gòu)；同時(shí)，茶多酚等功能活性成分對(duì)AD的神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用[12]，表明了EGCG和茶黃素具有防治AD的潛能[13]。茶黃素和EGCG含有較多酚羥基結(jié)構(gòu)，眾多研究已證實(shí)茶黃素及EGCG具有清除超氧陰離子、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化損傷等抗氧化功能[14-16]；同時(shí)，有研究表明茶黃素與綠茶中EGCG抗氧化能力相當(dāng)[17]。

本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)構(gòu)建Aβ42聚集化模型以及Aβ42誘導(dǎo)SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷模型，探討EGCG及茶黃素單體抑制蛋白聚集過(guò)程中毒性β-sheet結(jié)構(gòu)生成，以及拮抗Aβ42神經(jīng)毒性的作用。以茶黃素和EGCG干預(yù)快速老化模型小鼠（Senescence accelerated mouse-prone 8，SAMP8），進(jìn)一步探究這些茶葉功能成分對(duì)AD模型小鼠體內(nèi)Aβ42及AGEs抑制作用，以期為將茶葉開(kāi)發(fā)成有效防治AD相關(guān)神經(jīng)退行性疾病的藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1儀器與材料

SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞購(gòu)自上海生命科學(xué)研究院，SAMR1和SAMP8小鼠購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部，茶黃素單體（TF、TF-3-G、TF-3′-G、TF-DG，含量＞98%，北京工商大學(xué)提供，EGCG（純度≥98%）購(gòu)自長(zhǎng)沙飛拓植物制品公司，茶黃素混合物（＞68%）由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，Aβ42蛋白（純度≥95%）購(gòu)自上海吉爾生化，胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone，MTT、DMSO、硫磺素-T（Thioflavin T，ThT）、六氟異丙醇（Hexafluoroisopropanol，HFIP）購(gòu)自Sigma，DCFH-DA活性氧（ROS）探針、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒、BCA法蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成科技有限公司，小鼠Aβ42檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京樂(lè)博生物科技有限公司。

SKY-200B搖床、水浴鍋、Christ ALPHA 1-2 LD冷凍干燥機(jī)、Thermo Scientific Varioskan Flash光譜掃描多功能酶標(biāo)儀，LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器、Nuaire CO2培養(yǎng)箱、SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)、MIKRO-22R型冷凍離心機(jī)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1ThT熒光檢測(cè)EGCG和茶黃素抑制Aβ42聚集

ThT與含β-sheet結(jié)構(gòu)的分子相結(jié)合后可發(fā)出熒光，發(fā)射光譜呈現(xiàn)紅移特點(diǎn)，通過(guò)ThT檢測(cè)的熒光強(qiáng)度可得知被測(cè)分子中β-sheet結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量，ThT熒光探針?lè)ㄊ菣z測(cè)蛋白質(zhì)聚集纖維化過(guò)程中產(chǎn)生的β-sheet結(jié)構(gòu)較為理想的方法[18]。

每0.5 mg Aβ42加入250μL HFIP溶解過(guò)夜后預(yù)凍2～3 h，冷凍干燥，Aβ42干粉用少量DMSO溶解。本試驗(yàn)各組Aβ42終濃度為30μmol·L-1，藥物干預(yù)組分別加入濃度為30μmol·L-1（1×）和150μmol·L-1（5×）的EGCG、TF、TF-3-G、TF-3′-G、TF-DG，各組由PBS（pH7.2）配成1.5mL總體系，置于180 r·min-1，37℃搖床進(jìn)行孵育；于0、2、4、8、12、24、48、72 h不同時(shí)間點(diǎn)取樣檢測(cè)，96孔板中每孔40μL樣品+160μL 40μmol·L-1ThT（用50mmol·L-1甘氨酸溶解配制，pH8.5），激發(fā)波長(zhǎng)440nm（band pass 5nm），發(fā)射波長(zhǎng)485nm于全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光值[19]。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)

SH-SY5Y細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖（4.5mmol·L-1）培養(yǎng)基培養(yǎng)于CO2培養(yǎng)箱中，CO2濃度5%，溫度37℃；兩天換液1次，當(dāng)融合度達(dá)到80%～90%，用0.25%胰酶消化后吹散成1×106mL-1細(xì)胞懸液，接種于細(xì)胞培養(yǎng)板。

1.2.3藥物濃度選擇及細(xì)胞模型的建立

Aβ42蛋白溶解于DMSO中，配制成濃度為1mmol·L-1母液，加入前用培養(yǎng)基稀釋成20μmol·L-1的Aβ42工作液。

將SHSY-5Y細(xì)胞以密度為104個(gè)/孔種于96孔板，待細(xì)胞融合率為50%～60%，加藥組先加入不同濃度EGCG、TF、TF-3-G、TF-3′-G、TF-DG（10、50、100μmol·L-1），6 h后去培養(yǎng)基加入20μmol·L-1Aβ42培養(yǎng)48 h；Aβ42模型組加入20μmol·L-1Aβ42以及Control對(duì)照組加入培養(yǎng)基同時(shí)培養(yǎng)48 h；各組均設(shè)4～5個(gè)復(fù)孔。

MTT檢測(cè)細(xì)胞活力，每孔加入5 mg·mL-1的MTT 20μL，37℃孵育4 h，吸棄MTT后加入100μL DMSO，置37℃搖床中數(shù)分鐘，待紫色結(jié)晶溶解后，于全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值，檢測(cè)波長(zhǎng)為570nm。

1.2.4細(xì)胞內(nèi)活性氧ROS檢測(cè)

參考步驟1.2.3將SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)Aβ42或藥物處理后，經(jīng)PBS洗滌3次，加入原培養(yǎng)基稀釋的10μmol·L-1DCFH-DA，37℃孵育40min，細(xì)胞經(jīng)原培養(yǎng)基洗3次后用0.25%胰酶消化并收集；PBS洗滌細(xì)胞2次（1 000 r·min-1，10min），細(xì)胞重懸于PBS中，于全自動(dòng)酶標(biāo)儀上檢測(cè)熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長(zhǎng)為488nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525nm）。

1.2.5細(xì)胞內(nèi)MDA、GSH-PX活性檢測(cè)

將SH-SY5Y細(xì)胞用PBS洗滌2～3次，胰酶消化收集后置于冰上超聲裂解（重復(fù)3次，每次5 s），將細(xì)胞懸液按照試劑盒操作說(shuō)明，分別檢測(cè)細(xì)胞中MDA、GSH-PX含量。

1.2.6快速老化模型小鼠分組給藥

快速老化模型小鼠SAMP8，對(duì)照小鼠SAMR1，雄性，12周齡。小鼠自由飲食普通飼料，在安靜、通風(fēng)、清潔環(huán)境下，飼養(yǎng)環(huán)境溫度22～25℃，相對(duì)濕度40%～60%。采用每只小鼠單籠飼養(yǎng)的方式，飼養(yǎng)1周后，將小鼠隨機(jī)分為4組（每組6只）：正常對(duì)照組（SAMR1，R1）、模型組（SAMP8，P8），EGCG組（P8+EGCG）及茶黃素組（P8+TFs），加藥組劑量為10mg·kg-1·d-1，SAMR1組和SAMP8組灌胃等量的蒸餾水，連續(xù)灌胃10周。

1.2.7實(shí)驗(yàn)取材及相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)中，定期記錄各組小鼠的體質(zhì)量、飲水量和進(jìn)食量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組小鼠禁食12 h，摘眼球取血，全血離心（3 500 r·min-1，4℃，10min）并收集血清。試劑盒檢測(cè)血清中Aβ42含量；于全自動(dòng)酶標(biāo)儀（激發(fā)波長(zhǎng)為370nm，發(fā)射波長(zhǎng)為440nm）檢測(cè)血清中AGEs含量[20-21]。

1.3數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)至少3次，所有數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用ANOVA進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1EGCG和茶黃素對(duì)Aβ42聚集過(guò)程中β-sheet生成的影響

通過(guò)構(gòu)建不同濃度茶黃素、EGCG與Aβ42共同孵育的反應(yīng)體系，孵育過(guò)程中于不同時(shí)間點(diǎn)取樣進(jìn)行ThT熒光檢測(cè)。因ThT檢測(cè)的熒光強(qiáng)度反映了Aβ42聚集水平，因此，從結(jié)果（圖1-A）可知，在72 h內(nèi)，Aβ42模型組ThT熒光值一直處于上升趨勢(shì)，表明Aβ42中β-sheet結(jié)構(gòu)在不斷生成，聚集化水平不斷增加；然而，在0～24 h之間，各加藥組聚集化水平呈加速上升趨勢(shì)，直至24 h，聚集化水平開(kāi)始進(jìn)入平穩(wěn)期。取48 h時(shí)間點(diǎn)作為代表，將各組ThT熒光值作柱形圖（圖1-B），綜合圖1-A分析可知，與Aβ42模型組相比，各加藥組均顯著降低了β-sheet結(jié)構(gòu)的生成，從而抑制Aβ42聚集纖維化；同時(shí)，5×加藥組抑制效果比1×加藥組更加明顯，其ThT熒光值約為1×加藥組的一半（圖1-B）。各個(gè)單體成分之間比較分析，可大致得出不同成分之間存在的差異，整體而言，EGCG與同濃度的TFs相比，對(duì)Aβ42聚集過(guò)程中β-sheet結(jié)構(gòu)生成的抑制效果更為顯著，甚至1×EGCG與5×TF效果相當(dāng)。4種主要茶黃素單體成分之間相比，抑制Aβ42聚集化及β-sheet結(jié)構(gòu)生成的作用大小排序大致為T(mén)F-DG＞TF-3′-G＞TF-3-G＞TF。

2.2EGCG和茶黃素對(duì)Aβ42誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響

由圖2中MTT檢測(cè)結(jié)果可知，20μmol·L-1Aβ42處理48 h能顯著降低SH-SY5Y細(xì)胞的存活率，將細(xì)胞活力下降至58.87%。用不同濃度的EGCG或TFs處理6 h后，其神經(jīng)細(xì)胞活力均存在不同程度提高。當(dāng)EGCG和TFs濃度為10μmol·L-1或50μmol·L-1時(shí)，對(duì)Aβ42誘導(dǎo)細(xì)胞損傷具有一定緩解作用，提高SH-SY5Y細(xì)胞活力的效果較為顯著，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；而當(dāng)藥物濃度高達(dá)100μmol·L-1時(shí)，其對(duì)細(xì)胞活力提升作用并不顯著，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由此推測(cè)100μmol·L-1或較高濃度的EGCG或茶黃素可能超出藥物有效濃度范圍。綜合以上結(jié)果表明，在10～50μmol·L-1這一有效濃度范圍內(nèi)，EGCG和TFs對(duì)Aβ42產(chǎn)生的神經(jīng)毒性具有一定程度的拮抗作用，從而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。

圖1　EGCG和TFs對(duì)Aβ42聚集化β-sheet生成的抑制作用Fig. 1 EGCG and TFs inhibit thegeneration of β-sheet in the aggregation of Aβ42

圖2　EGCG和TFs對(duì)Aβ42誘導(dǎo)損傷的SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響Fig. 2 The effects of EGCG and TFs on the viability of SH-SY5Y cells injured by Aβ42

2.3EGCG和茶黃素保護(hù)Aβ42致SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷

當(dāng)機(jī)體或細(xì)胞內(nèi)遭受氧化應(yīng)激損傷時(shí)，ROS和抗氧化系統(tǒng)將失去平衡。從圖3-A可知，Aβ42誘導(dǎo)的SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)ROS熒光值顯著增加（與Control組相比，P＜0.01）；經(jīng)EGCG和TFs處理后，ROS熒光值不同程度降低（與Aβ42誘導(dǎo)組相比，P＜0.01），整體而言，EGCG抑制ROS產(chǎn)生或清除ROS能力強(qiáng)于TFs，EGCG組ROS熒光值甚至低于Control組。綜上結(jié)果表明，Aβ42處理SH-SY5Y細(xì)胞將增加細(xì)胞內(nèi)ROS含量，10μmol·L-1EGCG或TFs能顯著抑制神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)ROS的生成或清除細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的ROS。

GSH-Px為廣泛存在于機(jī)體內(nèi)分解H2O2的主要氧化還原相關(guān)酶，其活性在一定程度上反映了機(jī)體內(nèi)抗氧化水平。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了各組細(xì)胞內(nèi)GSH-Px活性，圖3-B表明，Aβ42損傷組細(xì)胞內(nèi)GSH-Px活性顯著下降（與Control組相比，P＜0.01）；而經(jīng)10μmol·L-1EGCG或TFs處理后均能有效抑制GSH-Px活性下降（與Aβ42模型組相比，P＜0.01）；其中，TF和TF-3-G提高GSH-Px活性效果優(yōu)于其他加藥組。MDA為脂質(zhì)過(guò)氧化中產(chǎn)物之一，由圖3-C表明，各加藥組不同程度降低了因Aβ42誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生的過(guò)量的MDA。

總之，EGCG和TFs可不同程度抑制Aβ42誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞氧化應(yīng)激。由結(jié)果可推測(cè)EGCG和TFs可能通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)ROS和MDA含量，提高GSH-Px活性，從而對(duì)Aβ42誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷產(chǎn)生保護(hù)作用，為細(xì)胞維持平衡的抗氧化系統(tǒng)并提供較為良好的氧化還原環(huán)境。

2.4EGCG和茶黃素對(duì)小鼠血清Aβ42及AGEs的影響

SAMP8小鼠是目前國(guó)內(nèi)外用來(lái)研究AD機(jī)理方面應(yīng)用較廣泛、較理想的模型小鼠，此模型小鼠具有明顯的AD病理特征。由圖4-A可知，SAMP8小鼠血清中Aβ42含量明顯高于SAMR1對(duì)照組（P＜0.01），而灌胃茶黃素或EGCG后，小鼠血清中Aβ42呈明顯下降趨勢(shì)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

現(xiàn)大量研究已證實(shí)，體內(nèi)AGEs不斷積累在AD發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用[22-23]。圖4-B表明EGCG和茶黃素均能顯著降低SAMP8小鼠血清中AGEs含量，兩者效果相當(dāng)。

3 討論

本文通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，綜合驗(yàn)證了茶葉中典型的功能成分EGCG和茶黃素4種主要單體控制Aβ42大量聚集纖維化和沉積，以及抑制Aβ42誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞造成氧化損傷，為進(jìn)一步證實(shí)茶葉功能成分具有緩解AD發(fā)病的效果提供理論依據(jù)。

圖3　EGCG和TFs對(duì)Aβ42處理的SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)ROS、GSH-Px和MDA含量的影響Fig. 3 The effects of EGCG and TFs on the contents of ROS, GSH-Px and MDA in SH-SY5Y cells injured by Aβ42

圖4　EGCG和TFs對(duì)SAMP8小鼠血清中Aβ42和AGEs含量的影響Fig. 4 The effects of EGCG and TFs on the contents of Aβ42and AGEs in SAMP8 serum

體外實(shí)驗(yàn)通過(guò)30μmol·L-1Aβ42與不同濃度EGCG和茶黃素4種單體（TF、TF-3-G、TF-3′-G和TF-DG）分別以1∶1和1∶5的比例于模擬生理?xiàng)l件下共同孵育3 d，結(jié)果表明，幾種不同茶葉功能成分能不同程度阻抑蛋白聚集纖維化過(guò)程中β-sheet結(jié)構(gòu)的生成，富含β-sheet結(jié)構(gòu)的毒性寡聚體明顯減少，Aβ42聚集化水平也相應(yīng)降低；EGCG和茶黃素對(duì)Aβ42聚集纖維化的抑制效果存在劑量依賴關(guān)系，其抑制效果從強(qiáng)到弱大致排序?yàn)镋GCG＞TF-DG＞TF-3′-G＞TF-3-G＞TF。此外，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建體外細(xì)胞模型，將20μmol·L-1Aβ42誘導(dǎo)SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞48 h后，細(xì)胞活力下降至58.87%，從而成功建立Aβ42誘導(dǎo)SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞損傷模型；10μmol·L-1或50μmol·L-1EGCG和茶黃素對(duì)神經(jīng)細(xì)胞預(yù)處理6 h后，不同程度提高了細(xì)胞活力，從而有效拮抗Aβ42導(dǎo)致神經(jīng)毒性。同時(shí)，Aβ42可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷，顯著提高ROS及MDA含量，并降低GSH-Px酶活力，EGCG和茶黃素能提高抗氧化酶GSH-Px活力并降低破壞氧化還原系統(tǒng)的ROS和脂質(zhì)過(guò)氧化終末產(chǎn)物MDA，從而暗示著EGCG和茶黃素拮抗Aβ42導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞損傷與其維護(hù)細(xì)胞內(nèi)氧化還原系統(tǒng)平衡存在一定關(guān)系。整體而言，EGCG緩解Aβ42致神經(jīng)細(xì)胞活力下降及氧化損傷的水平高于茶黃素4種主要單體，這與體外ThT熒光檢測(cè)EGCG及茶黃素抑制Aβ42聚集化的相關(guān)結(jié)果相符合。

有報(bào)道稱AD患者體內(nèi)AGEs水平與同齡正常人相比升高了3倍[4]，且AGEs積累可加速Aβ聚集從而加劇AD病癥。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用快速老化模型小鼠SAMP8作為AD動(dòng)物模型，SAMR1作為對(duì)照組，SAMP8小鼠連續(xù)灌胃劑量為10mg·kg-1·d-1的EGCG和茶黃素混合物10周后，發(fā)現(xiàn)藥物干預(yù)組小鼠血清中Aβ42及AGEs水平均有所降低。因Aβ聚集為AD發(fā)病機(jī)制中較為典型的病理特征，且Aβ與AGEs在AD患者機(jī)體內(nèi)具有協(xié)同作用，因此，由此推斷EGCG和茶黃素可能通過(guò)調(diào)控Aβ42和AGEs處于正常水平，從而緩解AD的發(fā)生與發(fā)展。

近年來(lái)，AD等神經(jīng)退行性疾病嚴(yán)重影響著人們的健康生活，日益受到科研及醫(yī)學(xué)界的關(guān)注。Aβ作為AD的主要致病因子之一，成為國(guó)內(nèi)外研究AD的焦點(diǎn)。茶葉作為最受歡迎的飲料之一，因其含有多酚類化合物而具有較多藥理功效；且茶多酚類化合物不僅具備抑制蛋白質(zhì)聚集或寡聚體解聚等功能；還具有與AD發(fā)病機(jī)制相關(guān)聯(lián)的如抗氧化、清除自由基、神經(jīng)保護(hù)等功能[24-25]；因此，茶葉被開(kāi)發(fā)為防治AD的藥物具有一定的潛力，并可能成為醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。

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Theaflavins and EGCG Protect SH-SY5Y Cells from Oxidative Damage Induced by Amyloid-β 1-42 and Inhibit the Level of Aβ42in vivo and in vitro

ZHANG Jing1, HUANG Jian'an1,2,3, CAI Shuxian1, YI Xiaoqin1, LIU Jianjun1, WANG Yingzi1, TIAN Lili1, LIU Zhonghua1,2,3*
1. Key Laboratory of Ministry of Education for Tea Science, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2. National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Changsha 410128, China; 3. Collaborative Innovation Center of Utilization of Functional Ingredients from Botanicals, Changsha 410128, China

In this study, amyloid β-protein Aβ42was incubated with EGCG, TF, TF-3-G, TF-3'-G, TF-DG at the ratio of 1∶1 and 1∶5 under simulated physiological condition. The contents of β-sheets after incubation were tested by thioflavin T fluorometric assay. It was found that EGCG and theaflavins could suppress the formation of β-sheet structure, therebyinhibiting aggregations of Aβ42. In addition, an SH-SY5Y cell damage model was established and MTT assay was used to examine cell viabilities when 20μmol·L-1Aβ42was incubated with different concentrations of EGCG and theaflavins (10, 50, 100μmol·L-1). Intracellular reactive oxygen species (ROS) levels, antioxidant enzyme activities (GSH-Px) and MDA levels were also measured. The results showed EGCG and theaflavins treatments could alleviate the Aβ42induced oxidative damage to neural cells by reducing ROS and increasing the activity of GSH-Px. To study the in vivo protective effects of EGCG and theaflavins, SAMP8 mice were treated with 10mg·kg-1·d-1EGCG or theaflavins respectively bygavage for 10 weeks, and the contents of Aβ42and AGEs in mouse serum were determined. The results showed that EGCG and theaflavins significantly decreased the contents of Aβ42and AGEs in SAMP8 serum. In summary, EGCG and theaflavins could inhibit the aggregations of Aβ42and reduce oxidative injury induced by Aβ42in neural cells, thereby exerting protective effects on AD.

EGCG, theaflavins, amyloid-β 1-42, advancedglycation end products, SH-SY5Y cells, SAMP8 mice

TS272；Q946.8

A

1000-369X（2016）06-655-08

2016-08-08

2016-10-13

國(guó)家茶葉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-23-11B）、湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新項(xiàng)目（HNCR-2014003）、國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31471590）、湖南省研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（CX2015B245）。

張靜，女，博士，主要從事茶葉功能成分藥理研究。*通訊作者：larkin-liu@163.com