芪歸四逆散抗大鼠肝纖維化的作用機制研究*

馬羽萍 張殿增 郭雅玲 王裕云 吳 超 西安市第八人民醫(yī)院(西安710061 )

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芪歸四逆散抗大鼠肝纖維化的作用機制研究*

馬羽萍 張殿增△郭雅玲 王裕云 吳 超 西安市第八人民醫(yī)院(西安710061 )

目的：用肝纖維化大鼠觀察芪歸四逆散對實驗性肝纖維化的影響。方法：用四氯化碳(CCl4)復制肝纖維化大鼠模型，設(shè)秋水仙堿為陽性對照，觀察芪歸四逆散對肝纖維大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST) 和白蛋白(ALB)水平以及透明質(zhì)酸(HA)、層粘連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、IV型膠原(C-IV)含量及肝臟組織病理學和超微結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果：與模型對照組比較，芪歸四逆散組大鼠血清的AST、ALT 以及HA、LN、PCⅢ、C-IV水平明顯降低，但ALB明顯升高。肝臟的組織病理損害明顯改善，膠原沉積減少，纖維增生顯著減輕。超微結(jié)構(gòu)研究顯示，芪歸四逆散組動物的肝竇纖維蛋白沉積明顯減少。結(jié)論：芪歸四逆散可以恢復肝功能，抑制星狀細胞的活性，減少肝內(nèi)纖維蛋白的合成與沉積，促進膠原降解，改善纖維化肝臟的病理學超微結(jié)構(gòu)，具有確切的抗大鼠肝纖維化作用。

四逆散為漢·張仲景《傷寒論》中的和解劑，具有調(diào)和肝脾、透邪解郁、疏肝理脾之功效。主治陽郁厥逆證。近年來，在臨床上用加味四逆散治療慢性乙型肝炎性肝纖維化，并獲得了明顯的療效[1]。既往實驗研究也對加味四逆散拮抗、預防和逆轉(zhuǎn)肝纖維化的作用進行了肯定[2-3]。我們在臨床上用芪歸四逆散治療肝纖維化，并獲得了顯著的臨床療效。本研究主要觀察了芪歸四逆散對CCL4大鼠肝纖維化的影響。

1 實驗材料 1.1 動物及飼料 清潔級(SPF)SD大鼠45 只，雄性，體重200± 20g。動物使用許可證號：SCXK(陜)2012-003，由西安交通大學實驗動物中心提供。

1.2 藥物及試劑 芪歸四逆散劑由柴胡、枳殼、白芍、黃芪、當歸、紅花、桃仁、川芎、甘草等藥組成。實驗用其濃縮液(含生藥2g/ml)。秋水仙堿，廣東彼迪藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號：20150001。四氯化碳(CCl4)，天津市天力化學試劑有限公司產(chǎn)品，批號：20111006。橄欖油，山東魯花集團有限公司產(chǎn)品，批號：20150803LB。大鼠透明質(zhì)酸(HA)、層粘連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、IV型膠原(Collagen IV)Elisa試劑盒均為上海廣銳生物科技有限公司產(chǎn)品，批號2015012。大鼠肝臟TGF-β1的一抗和二抗為Pioneer Biotechnology，Inc產(chǎn)品。血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和白蛋白(ALB)試劑為全自動生化分析儀專用試劑。

1.3 主要儀器 超薄切片機、H7650型透射電子顯微鏡(日本日立公司)，圖像采集與分析系統(tǒng)(德國萊卡公司)，AU5431型全自動生化分析儀(美國貝克曼公司)，POLARstar OPTIMA微板儀(德國BMG Labtechnologies Pty. Ltd)。

2 實驗方法 2.1 動物分組與造模 在適應性喂養(yǎng)1周后，對所有動物進行編號并隨機分為4組：正常對照組10只，模型對照組15 只，秋水仙堿組 10只，中藥治療組 10只。除正常組外，其余各組動物在第一天皮下注射CCl4原液3 ml/kg，隨后每隔三天皮下注射40% CCl4橄欖油溶液3ml/kg，1次，連續(xù)6周。在末次注射后次日，從模型對照隨機殺死一只大鼠行肝臟病理學檢查，按照2000年中華醫(yī)學會傳染病與寄生蟲病學分會肝病學分會聯(lián)合修訂的肝纖維化分級標準對實驗結(jié)果進行評定[4]，直到形成II級以上肝纖維化，即確定肝纖化模型復制成功。

2.2 給藥方法 實驗開始時，正常對照組和模型對照組大鼠灌胃給予生理鹽水，每次2 ml，1次/d；給藥組灌胃給予芪歸四逆散溶液7.8ml/kg(15.6g/kg)，1次/d，陽性組灌胃給予秋水仙堿溶液0.01 mg/kg，1次/d，連續(xù)6周。

2.3 標本采集 于造模和給藥結(jié)束后，動物用25%烏來糖(20ml/kg)麻醉，經(jīng)腹主動脈采血，分離血清，用全自動生化分析儀測定血清ALT、AST水平和ALB含量，用Elisa法測定血清HA、LN、PC-Ⅲ、C-IV水平。同時剪取近肝門處的新鮮肝組織兩份。一份切成1mm3的小塊，用2.5%戊二醛(pH 7.3-7.4)固定，供電子顯微鏡檢測用，另一份用10%甲醛固定，用于病理學和免疫組化檢測。

3 結(jié) 果 3.1 對血清轉(zhuǎn)氨酶與白蛋白水平的影響 于實驗末，動物用25%烏來糖(20ml/kg)麻醉，經(jīng)腹主動脈采血，分離血清，用全自動生化分析儀測定血清ALT、AST水平和ALB含量，結(jié)果如表1所示。

表1 芪歸四逆散對肝纖維化大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶、白蛋白的影響

表1中的結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型對照組動物的ALT和AST水平均明顯提高(P<0.01)，ALB則明顯降低(P<0.01)。與模型對照組比較，芪歸四逆散給藥組和秋水仙堿陽性對照組的ALT、AST水平均明顯降低(P<0.01)，而ALB明顯提高(P<0.05)。

3.2 血清纖維化指標的影響 用Elisa法測定血清HA、LN、PC-Ⅲ、C-IV水平，結(jié)果如表2所示。

表2 芪歸四逆散對肝纖維化大鼠血清HA、LN、C-IV和PCⅢ水平的影響

表2中的結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型對照組動物的血清HA、LN、C-IV和PcⅢ水平均明顯提高(P<0.01)。與模型對照組比較，芪歸四逆散給藥組和秋水仙堿陽性對照組的血清HA、LN、C-IV和PcⅢ水平均明顯降低(P<0.01)。

3.3 肝臟病理學的影響 于實驗末，剪取肝臟組織，10%多聚甲醛固定，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片后，分別用HE和Masson染色，在光鏡下觀察肝臟的組織病理學。

在光鏡下發(fā)現(xiàn)，正常對照組動物HE染色時的肝組織結(jié)構(gòu)清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝索排列整齊；Masson染色僅見中央靜脈和匯管區(qū)有少量藍染。HE染色發(fā)現(xiàn)，模型組肝板結(jié)構(gòu)紊亂，有假小葉形成，肝細胞水腫，匯管區(qū)和小葉內(nèi)可見炎細胞浸潤，并見橋接樣壞死；Masson染色見纖維間隔形成，匯管區(qū)明顯擴大，界板破壞，中央靜脈及竇周大量膠原沉積。芪歸四逆散給藥組和秋水仙堿陽性對照組的肝組織病變程度明顯比模型對照組輕，Masson染色見結(jié)締組織增生程度明顯減輕，有些形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)斷裂或消失。這些結(jié)果說明芪歸四逆散有抗肝纖維化的作用。

3.4 轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)β1表達水平的影響 免疫組化的陽性結(jié)果是細胞的漿膜出現(xiàn)棕黃色顆粒。檢測時每個圖片取5個視野，計算出陽性染色面積占總面積的百分比，結(jié)果如表3所示。

在光鏡下可見，正常對照組的TGFβ1的表達很少，且呈散在性分布，主要見于匯管區(qū)、門靜脈以及中央靜脈周圍的結(jié)締組織。與正常對照組比較，模型對照組的TGFβ1分布明顯增多，而且廣泛(P<0.01)，除了匯管區(qū)、門靜脈和中央靜脈外，在纖維間隔以及一些不規(guī)則細胞也有分布。而給藥組和秋水仙堿組TGFβ1的表達明顯低于模型對照組(P<0.01)，結(jié)果與病理學檢查結(jié)果一致。說明芪歸四逆散可以減少肝纖維化大鼠肝組織TGFβ1的表達。

表3 芪歸四逆散對肝纖維化大鼠TGFβ1表達的影響

3.5 對超微結(jié)構(gòu)的影響 在透射電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，正常組大鼠的肝細胞呈多邊形，核圓，位于細胞中間，血竇面微絨毛密集而豐富；肝竇內(nèi)皮細胞(SEC)呈扁平狀，遠側(cè)胞質(zhì)不連續(xù)，細胞間有許多窗孔；庫佛細胞(KC)和肝星狀細胞(HSC)形狀不規(guī)則，Diss間隙正常，肝臟內(nèi)毛細血管通暢。模型對照組動物的肝細胞有壞死表現(xiàn)，吞噬細胞和中性粒細胞聚集，多數(shù)肝細胞內(nèi)出現(xiàn)空泡和脂肪滴；血竇面微絨毛稀疏、紊亂；毛細血管內(nèi)有微血栓形成；SEC增多，細胞間窗孔減少或消失，顯示肝竇出現(xiàn)毛細管化改變；KC染色淺。Diss間隙狹窄，且部分內(nèi)有膠原纖維沉積；HSC較多。秋水仙堿組動物的肝細胞壞死不明顯，細胞內(nèi)有少量空泡和脂肪滴，部分細胞結(jié)構(gòu)出現(xiàn)紊亂，少數(shù)SEC腫脹，胞漿內(nèi)有大量的胞飲小泡，胞間有間斷性窗孔。Diss腔和竇周間隙仍然可見有少量膠原纖維。芪歸四逆散組的超微結(jié)構(gòu)改變較病理模型組明顯減輕，結(jié)果與秋水仙堿組類似。這些結(jié)果與病理學結(jié)果一致說明，芪歸四逆散有明顯的抗肝纖維化作用。

A. 正常的對照組 B. 模型對照組 C. 芪歸四逆散組 D. 秋水仙堿陽性對照組

4 討 論 肝纖維化是一種主動進展的、可逆的基質(zhì)代謝失衡和肝臟結(jié)締組織重構(gòu)的過程，是肝星狀細胞在各種損肝因素持續(xù)刺激下被激活，大量合成細胞外基質(zhì)在肝內(nèi)沉積引起肝小葉結(jié)構(gòu)改變的病理過程[5]。當肝纖維形成之后，肝臟功能即會異常，轉(zhuǎn)氨酶水平會升高，白蛋白會下降，當肝星狀細胞被激活時，肝細胞外基質(zhì)的成分、降解產(chǎn)物及其參與代謝的酶的水平也會明顯升高。

大量研究證明，在肝纖維化形成過程中，肝星狀細胞(HSC)被活化，演變?yōu)槌衫w維細胞而迅速增殖和分泌大量的膠原纖維蛋白[6]。此外，HSC活化后還分泌TGFβ、血小板衍生因子等以維持自身的活化狀態(tài)。所以，肝組織中的TGFβ含量是星狀細胞活化的標志。

本實驗結(jié)果顯示，與正常對照組動物比較，模型對照組動物的血清ALT、AST、ALB與HA、LN、C-IV和PcⅢ水平均明顯升高，肝纖維化的病理學改變明顯，說明肝纖維化模型建造成功。加味四逆散處理組動物的血清ALT、AST與HA、LN、C-IV和PcⅢ水平明顯降低，ALB明顯升高，肝臟的組織病理學改變得到明顯地改善,說明芪歸四逆散具有明顯的抗肝纖維化作用。另外，模型對照組動物血清的TGFβ水平明顯高于正常對照組，芪歸四逆散組動物的TGFβ水平明顯降低,說明芪歸四逆散可能是通過抑制星狀細胞活化產(chǎn)生抗肝纖維化作用的。

中醫(yī)認為將肝纖維化歸屬于 “積聚”或“積證”的范疇更為準確[7]。在肝纖維化發(fā)生后，中醫(yī)學上認為的肝藏血、主疏泄的功能失常，出現(xiàn)積聚、積證等癥候。在治療上多采用活血化瘀、散結(jié)解聚的方藥[8]。本實驗所用的芪歸四逆散中就是在四逆散和解藥的基礎(chǔ)上添加了黃芪、當歸、紅花、桃仁、川芎等活血化瘀的藥物，減少了肝纖維化大鼠肝細胞損傷、SEC水腫以及內(nèi)皮側(cè)基底膜形成，改善了肝竇毛細血管化，減少了RER膜上的多聚核蛋白體解聚及脫粒和SER膜增生，減少了微循環(huán)內(nèi)的血栓，從超微結(jié)構(gòu)上證明了芪歸四逆散的抗肝纖維化的作用。

[1] 孫守才，劉光煒. 加味四逆散治療慢性乙型肝炎肝纖維化的初步研究[J].陜西中醫(yī)學院學報，2001,24(1)：46-47.

[2] 鄭旭銳，葉建紅，周新穎,等. 加味四逆散對肝纖維化大鼠肝組織轉(zhuǎn)化生長因子β1、結(jié)締組織生長因子mRNA影響的研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2009,20(10)：2597-2598.

[3] 鄭旭銳，孫守才，李長秦. 加味四逆散治療肝纖維化量效關(guān)系實驗研究[J]. 吉林中醫(yī)藥，2008,28(5)：377-378.

[4] 中華醫(yī)學會傳染病與寄生蟲病學分會肝病學分會．病毒性肝炎防治方案[S]．中華肝臟病雜志，2000，8(6)：324-329．

[5] 王 臺.恩替卡韋聯(lián)合復方鱉甲軟肝片治療慢性乙型肝炎肝纖維化36例[J].陜西中醫(yī)，2011,32(9):1115-1116.

[6]WilasrusmeeC,SiritheptaweeS,KanchanapanjaponS,etal.Ultrastructuralchangesincirrhoticandnoncirrhoticpatientsduetohepatectomy[J].JHepatobiliaryPancreatSurg,2004,11(4) :266-271.

[7] 馬羽萍. 薛泱洪抗肝纖維化治療經(jīng)驗[J].陜西中醫(yī),2014,35(2):214-215.

[8] 雷 娜，鄭仕中，陸 茵. 活血化瘀類中藥防治肝纖維化的機制及研究進展[J]. 中華中醫(yī)藥雜志，2010,25(2): 265-268.

(收稿2016-06-28；修回2016-08-03)

The Effects and mechanism of astragalus& angelica Qigui Sinisan against hepatic fibrosis of rats

Xi’an Eighth People's Hospital(Xi’an710061) Ma Yuping Zhang Dianzeng Guo Yaling et al

Objectives: To observe the effects of Qigui Sinisan against experimental hepatic fibrosis via in rats. Methods: To establish the rat hepatic fibrosis model with CCl4,colchicine as the positive control,and observe the effect of Qigui Sinisan on rats with hepatic fibrosis,in terms of the levels of serum ALT,AST and ALB,the contents of HA,LN,PCⅢ and C-IV,as well as liver-tissue pathology & ultrastructure. Results: Compared with the model group,in the Qigui Sinisan group,the levels of serum AST,ALT,but ALB,as well as HA,LN,PCⅢ,C-IV lowered significantly, the pathological damage on liver tissue significantly repaired,the collagen deposition significantly reduced,and the fibroplasia significantly relieved. According to ultrastructure studies,hepatic-sinusoid fibrin deposition of animals decreases significantly in Qigui Sinisan group. Conclusion: Qigui Sinisan can restore liver function,inhibit the activity of stellate cell,reduce synthesis and deposition of liver fibrin,promote collagen degradation,and improve pathological ultrastructure of hepatic fibrosis,having the definite effect against hepatic fibrosis in rats.

Liver fibrosis/traditional Chinese medicine therapy @Qigui Sinisan Carbon tetrachloride Rats Animal experimentation

*西安市衛(wèi)生局重點學科優(yōu)勢?？平ㄔO(shè)項目(2015228)

肝纖維化/中醫(yī)藥療法 @芪歸四逆散 四氯化碳 大鼠 動物實驗

R575.2

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2016.11.053

△西安交通大學醫(yī)學部 (西安710061)