王 強(qiáng) 劉智斌 牛文民 楊曉航 王 淵 朱先偉 劉思洋 王衛(wèi)剛

陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽 712046)

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·實驗研究·

電針迎香穴對嗅覺障礙大鼠嗅粘膜Ki-67、IGF-1R及嗅球IGF-1表達(dá)的影響*

王 強(qiáng) 劉智斌△牛文民 楊曉航 王 淵 朱先偉 劉思洋▲王衛(wèi)剛■

陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽 712046)

目的:觀察電針迎香穴干預(yù)嗅覺障礙大鼠嗅粘膜Ki-67、IGF-1R及嗅球IGF-1表達(dá)的影響。方法: 取SD雄性大鼠40只，隨機(jī)分為空白組，嗅覺障礙組，嗅覺障礙+電針迎香穴組，嗅覺障礙+眶下神經(jīng)切斷+電針迎香穴組，每組10只。除空白組外，其余各組均用灌注TritonX-100的方法建立嗅覺障礙，造模成功后進(jìn)行電針干預(yù)10d，用免疫組織化學(xué)法及Westernblot法測定組織中Ki-67、IGF-1和IGF-1R的表達(dá)水平。結(jié)果: 嗅覺障礙模型中嗅黏膜Ki-67、IGF-1R和嗅球IGF-1表達(dá)減少(P<0.05)，電針迎香穴可以顯著增加嗅黏膜Ki-67、IGF-1R和嗅球IGF-1的表達(dá)水平 (P<0.05)，而電針迎香穴+眶下神經(jīng)切斷組則無顯著干預(yù)效應(yīng)。結(jié)論 :電針迎香穴干預(yù)可以改善TritonX-100誘導(dǎo)的大鼠嗅覺功能障礙，其機(jī)制可能與提高嗅覺神經(jīng)相關(guān)細(xì)胞因子Ki-67和IGF-1、IGF-1R在嗅黏膜及嗅球的表達(dá)有關(guān)，且迎香穴的干預(yù)效應(yīng)與三叉神經(jīng)通路的完整性密切相關(guān)。

嗅覺功能減退與多種疾病有密切聯(lián)系，譬如神經(jīng)退行性疾病或鼻黏膜炎癥相關(guān)疾病[1]。神經(jīng)解剖學(xué)表明，鼻黏膜神經(jīng)上皮層是中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元和環(huán)境直接相連的部位之一，所以通過嗅覺傳導(dǎo)通路異?？赡軙?dǎo)致中樞神經(jīng)病變的發(fā)生,其可以分為嗅覺部分或完全性減退或異常[2]。而嗅感覺神經(jīng)元(Olfactory receptor neurons,ORNs)的損傷可以導(dǎo)致不同程度的嗅覺障礙[3]。有文獻(xiàn)表明，Ki-67與胰島素樣生長因子-1(Insulin-like growth factor 1,IGF-1)及其受體胰島素樣生長因子-1R(IGF-1R)在嗅感神經(jīng)元的發(fā)生中有重要作用[4]。本實驗應(yīng)用免疫組化及蛋白質(zhì)印跡法，通過觀察嗅球及嗅黏膜中嗅覺相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的變化，來探討Triton-100經(jīng)鼻滴入對大鼠嗅覺功能的影響，以及電針迎香穴對于嗅覺功能障礙大鼠的效應(yīng)機(jī)制，之前的實驗我們應(yīng)用動物行為學(xué)證明了電針迎香穴對于嗅覺功能障礙大鼠的改善效果，所以本實驗擬進(jìn)一步闡明迎香穴對嗅覺障礙的干預(yù)效應(yīng)是基于三叉神經(jīng)通路完整性而發(fā)揮作用的。

1 材料及方法 1.1 動物及分組 清潔級SD大鼠雄性大鼠40只，隨機(jī)分為空白組(Sham)，嗅覺障礙組(Model)，嗅覺障礙+電針迎香穴組(YXX)，嗅覺障礙+眶下神經(jīng)切斷+電針迎香穴組(KXSJ+YXX)，每組10只。

1.2 試劑與儀器 小鼠胰島素樣生長因子1(IGF-1)、小鼠胰島素樣生長因子1R(IGF-1R)、Ki-67免疫組化試劑盒(Sigma公司)；生物素化山羊抗兔IgG(中山金橋生物有限公司)；BA200Digital數(shù)碼三目攝像顯微攝像系統(tǒng)(麥克奧迪實業(yè)集團(tuán)有限公司)；2015型轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)；PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀(常州市中威醫(yī)療儀器有限公司)；Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)(美國Media Cybernetics公司)。

1.3 嗅覺障礙模型 將大鼠用0.3%戊巴比妥鈉麻醉后，用微量注射器(注射器針頭磨鈍)對雙側(cè)鼻孔一次性灌注100μL 0.7% Triton X-100(PBS配制),灌流時間1min[5]。

1.4 眶下神經(jīng)切斷模型 常規(guī)消毒大鼠兩側(cè)眶下皮膚區(qū)域，沿兩側(cè)眶下緣做一水平切口，長約0.5cm，鈍性分離皮下脂肪，暴露眶下孔，仔細(xì)分離眶下神經(jīng)及其同名動靜脈，避開血管，切斷眶下神經(jīng)。

1.5 電針方法 迎香穴定位[6]：大鼠鼻孔外側(cè)上端，有毛與無毛交界處。電針方法：迎香穴向內(nèi)上方斜刺0.3cm，電針參數(shù)：1mA,疏密波；正極和負(fù)極各接一側(cè)迎香穴，刺激時間10min，1次/d。以上電針處理均在造模成功后第1天進(jìn)行。療程參照嗅神經(jīng)切斷對ORN的影響的文獻(xiàn)[7]制定，確定5d為1個療程，休息2d，共進(jìn)行2個療程，未行電針干預(yù)組常規(guī)飼養(yǎng)至電針療程結(jié)束。

1.6 組織取材方法 療程結(jié)束后實施組織取材。嗅黏膜采集方法：75%的醫(yī)用酒精消毒大鼠皮膚，2%戊巴比妥鈉完全麻醉后,斷頭處理。用血管鉗將鼻中隔取出,可見嗅區(qū)呈黃色的區(qū)域，將此嗅區(qū)鼻中隔(嗅黏膜和骨質(zhì))完整取下，在顯微鏡下將嗅黏膜完整刮下。參考The Rat Brain嗅球采集方法：采用電鉆在前囟前3.2mm 為后界開窗，使左側(cè)嗅球暴露，繼而從后界垂直插入取出嗅球[8]。免疫組化和電鏡分別給與不同切片處理。

1.7 嗅黏膜Ki-67、IGF-1R表達(dá)檢測方法 按照常規(guī)免疫組化方法處理，包括載玻片防脫片處理、脫蠟、熱修復(fù)抗原、山羊血清封閉液；滴加1∶200的一抗后，4℃孵育過夜。次日，PBS洗3次后滴加山羊抗鼠/兔IgG二抗，PBS洗后使用DAB試劑盒顯色；最后至蘇木素復(fù)染、脫水、透明及封片。

1.8 圖像采集 圖像采集應(yīng)用顯微攝像系統(tǒng)，對于采集組織的所有切片，先將其置于100倍鏡下進(jìn)行觀察，其次參照嗅黏膜和嗅球組織表達(dá)情況進(jìn)行圖像采集，選取1個區(qū)域進(jìn)行鏡下400倍觀察。

1.9 嗅球IGF-1表達(dá)檢測方法 采用蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行檢測，應(yīng)用試劑盒(上海眾生生命科學(xué)發(fā)展有限公司提供)進(jìn)行蛋白抽提，勻漿嗅球組織至完全裂解，將裂解液于4℃離心機(jī)中離心(10000×g，15min)。用蛋白質(zhì)定量試劑盒(BCA法,海門碧云天生物技術(shù)研究所)及酶標(biāo)儀(Synergy2)測量562nm各孔光密度值，定量待測樣品蛋白濃度。得到樣品經(jīng)電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉后加入兔抗IGF-1一抗(Millipore公司，1∶1000)4℃過夜，Tris-HCL緩沖鹽溶液(TBST)反復(fù)漂洗后加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗(美國sigma公 司，1∶5000)室溫避光孵育1h，TBST漂洗后用ECL法顯影，結(jié)果用Bio-RAD Quantity one 圖像分析軟件進(jìn)行掃描分析。以IGF-1的目的條帶與內(nèi)參GAPDH條帶的比值代表產(chǎn)物的相對表達(dá)量。

測定目標(biāo)圖像的平均光密度值，應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié) 果 2.1 各組大鼠嗅黏膜中IGF-1R的表達(dá)

圖1 各組大鼠嗅黏膜中IGF-1R陽性表達(dá)灰度值(免疫組化染色，IHC×400)

表1 各組大鼠IGF-1R蛋白表達(dá)

如圖1和表1所示，各組嗅黏膜均可見IGF-1R陽性表達(dá)，模型組和空白組比較，嗅黏膜中IGF-1R的陽性表達(dá)均顯著低于空白組(P<0.05)，電針迎香穴組顯著提高了IGF-1R在嗅黏膜中的表達(dá)(P<0.05)，而電針迎香穴干預(yù)眶下神經(jīng)切斷模型組大鼠與模型組比較沒有明顯的變化。

2.2 各組大鼠嗅黏膜中Ki-67的表達(dá)

圖2 各組大鼠嗅黏膜中Ki-67陽性表達(dá)灰度值(免疫組化染色，IHC×400)

表2 各組大鼠Ki-67蛋白表達(dá)

如圖2和表2所示，模型組和空白組比較，嗅黏膜中Ki-67陽性表達(dá)均顯著低于空白組(P<0.05)，電針迎香穴組顯著升高了Ki-67在嗅黏膜中的表達(dá)(P<0.05),而電針迎香穴干預(yù)眶下神經(jīng)切斷模型組大鼠與模型組比較沒有明顯的變化。

2.3 各組大鼠嗅球中IGF-1蛋白的表達(dá)

圖3 各組大鼠嗅球中IGF-1蛋白的表達(dá)

表3 各組大鼠IGF-1蛋白的表達(dá)

如圖3和表3所示，模型組和空白組比較，嗅球中IGF-1蛋白的表達(dá)均顯著低于空白對照組(P<0.05)，電針迎香穴組顯著提高了IGF-1在嗅球組織中的表達(dá)(P<0.05),電針迎香穴干預(yù)眶下神經(jīng)切斷模型組大鼠與模型組比較沒有明顯的變化。

3 討 論 Ki-67通常表達(dá)于人增殖細(xì)胞的各期，在有絲分裂后Ki-67抗原表達(dá)下降，所以，這種抗原被命名為Ki-67抗原，是一類與細(xì)胞周期相關(guān)的細(xì)胞核非組蛋白[9]。在我們的實驗中觀察到，對于嗅覺障礙模型大鼠嗅黏膜中的Ki-67陽性細(xì)胞，其數(shù)量較正常組顯著降低，而且基底層的這種變化更為明顯。位于嗅黏膜基底層中的基底細(xì)胞類似神經(jīng)干細(xì)胞，即可以進(jìn)行分裂增殖，文獻(xiàn)表明，在正常生理情況下，嗅感神經(jīng)元在凋亡以后，新的嗅感神經(jīng)元能夠由基底細(xì)胞分化出來，從而維護(hù)正常的嗅覺功能，在發(fā)生嗅覺障礙的時候，由于Ki-67的表達(dá)減少，會導(dǎo)致嗅感神經(jīng)元再生能力降低，最終導(dǎo)致感受嗅覺的神經(jīng)元顯著減少[10]。電針迎香穴組與模型組比較發(fā)現(xiàn)Ki-67的陽性細(xì)胞數(shù)量顯著恢復(fù)，結(jié)合之前行為學(xué)實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)嗅覺障礙同時也得到了明顯改善。

胰島素樣生長因子-1R(IGF-1R)及胰島素樣生長因子-1(IGF-1)主要在肝臟產(chǎn)生，與胰島素同源，同時也具有胰島素樣效應(yīng)，IGF-1的受體包括IGF-1R。在我們的實驗中發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠嗅黏膜IGF-1R和嗅球IGF-1中的表達(dá)量相對于空白組明顯降低，提示嗅感神經(jīng)元數(shù)量減少可能是由于IGF-1的作用減弱，進(jìn)而引發(fā)嗅覺障礙加重。結(jié)果表明，電針迎香穴可以抑制IGF-1表達(dá)減少，這可能是電針干預(yù)對大鼠嗅覺障礙改善的機(jī)制之一，而與Ki-67表達(dá)一樣，眶下神經(jīng)切斷后，電針干預(yù)組與模型組沒有顯著性差異。我們發(fā)現(xiàn)，嗅覺障礙大鼠的Ki-67和IGF-1及其受體在嗅球以及嗅黏膜上的表達(dá)具有正相關(guān)，表明二者在促進(jìn)嗅感覺神經(jīng)元的再生方面可能具有協(xié)同作用，在切斷眶下神經(jīng)后，這些因子的表達(dá)同樣具有一致性。

嗅覺障礙在中醫(yī)文獻(xiàn)中多以“鼻聾”命名，但由于病因不明，目前沒有明確的西醫(yī)干預(yù)手段。我們通過研究證實，由于Ki-67和IGF-1、IGF-1R表達(dá)的減少，從而導(dǎo)致了嗅感神經(jīng)元的再生能力減弱，以至于無法產(chǎn)生足夠的神經(jīng)元來維持正常的嗅覺，而電針迎香穴干預(yù)嗅覺障礙的結(jié)果表明，其可以抑制上述因子表達(dá)的減少。另外，我們通過切斷眶下神經(jīng)，從反面印證了我們的推測，即電針迎香穴是基于三叉神經(jīng)通路的完整性而發(fā)揮對上述因子的良性調(diào)控效應(yīng)的。

[1] 劉巧平,劉建華.針刺內(nèi)迎香治療嗅覺下降[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(中醫(yī)臨床版),2011,18(2):21-22.

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[5] 秦照萍,葉樹明，杜繼曾,等.Triton損傷成年大鼠嗅上皮對嗅球鈣結(jié)合蛋白-D和小白蛋白表達(dá)的影響[J].中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志,2005,19(3):226-228.

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(收稿2016-06-05；修回2016-06-28)

Effects of electroacupuncture of Yingxiang on expression of Ki-67 and IGF-1R of olfactory mucosa and IGF-1 of olfactory bulb in rats with olfactory dysfunction

Shaanxi University of Chinese Medicine (Xianyang 712046)

Wang Qiang Liu Zhibin Niu Wenmin et al

Objective: To observe the effect based on trigeminal nerve pathway of electroacupuncture of “Yingxiang” (LI20) on Ki-67 and IGF-1R of olfactory mucosa and IGF-1 of olfactory bulb of olfactory dysfunction(OD) rats. Methods: 40SD mouses were divided into four groups：control group、model group、OD + LI20group and OD + ONT + LI20group,OD models were established by perfused Triton X-100.10days were taken as one treatment course. We monitored behavioral detection of rats and observed the expression level Ki-67 and IGF-1R of olfactory bulb or olfactory mucosa by immuno histochemistry.Results: According to olfactory dysfunction model,expression of Ki-67 and IGF-1R of olfactory mucosa and IGF-1 of olfactory bulb were significantly decreased by electroacupuncture group(P<0.05),meanwhile,there was no significant difference for electroacupuncture group on ONT of OD rats.Conclusion: Electroacupuncture on LI20had a favorable effect on Triton X-100-induced olfactory disorders,its mechanism might based on increasing the expression of Olfactory nerve related cytokines Ki-67 and IGF-1R of olfactory mucosa and IGF-1 of olfactory bulb,and the intervention effect might be relied on the integrity of trigeminal nerve pathway.

Olfaction disorders/acupuncture-moxibustion Point LI20(Yingxiang) Electroacupuncture Rats Animal experimentation

*國家自然科學(xué)基金項目(81273859)

嗅覺障礙/針灸療法 穴,迎香 電針 大鼠 動物實驗

R

Adoi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.11.050

陜西省教育廳專項科學(xué)研究項目(11JK0679)

▲西安醫(yī)學(xué)院(西安 710021)

■陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(咸陽 712000)

△通訊作者