林曉平, 汪珍光, 孫金海

1.第二軍醫(yī)大學衛(wèi)生勤務學系軍隊健康管理學教研室，上海 200433

2.第二軍醫(yī)大學基礎(chǔ)醫(yī)學部，上海 200433

3.第二軍醫(yī)大學東方肝膽外科醫(yī)院膽道三科，上海 200433

?

·論 著·

乙肝相關(guān)肝癌患者肝組織硬脂酰-輔酶A脫氫酶的表達與預后的相關(guān)性

林曉平1,2, 汪珍光3, 孫金海1*

1.第二軍醫(yī)大學衛(wèi)生勤務學系軍隊健康管理學教研室，上海 200433

2.第二軍醫(yī)大學基礎(chǔ)醫(yī)學部，上海 200433

3.第二軍醫(yī)大學東方肝膽外科醫(yī)院膽道三科，上海 200433

目的： 探討乙肝相關(guān)肝癌組織中硬脂酰-輔酶A脫氫酶(stearoyl-CoA desaturase, SCD)的表達水平及臨床意義。方法： 構(gòu)建176例距離肝癌邊界3 cm以上肝組織的組織芯片，應用免疫組化技術(shù)檢測SCD的表達水平，并分析其與臨床病理學特征之間的關(guān)系。結(jié)果： SCD在乙肝相關(guān)肝癌患者肝組織中的陽性率為85.80%(151/176)。且肝組織中SCD表達量與腫瘤數(shù)目、微血管侵犯、肝硬化等相關(guān)(P<0.05)，SCD高水平表達組患者無瘤生存時間和總體生存時間均短于SCD低水平表達組。結(jié)論： SCD在乙肝相關(guān)肝癌患者肝組織中的表達量與臨床病理及不良預后之間存在一定聯(lián)系，提示肝癌患者肝組織中SCD的表達量可以作為不良預后的標志物。

肝癌；SCD；組織芯片；免疫組化

根據(jù)2014年世界衛(wèi)生組織報告，我國肝癌新增病例數(shù)和死亡病例數(shù)均居世界首位。最近的研究表明與肥胖相關(guān)的非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)不僅可導致肝癌，且肥胖相關(guān)的肝癌與丙肝病毒感染導致的肝癌相比預后更差[1]。與肥胖相關(guān)的非酒精性脂肪肝組織中，由于脂肪沉積，肝臟星狀細胞被激活。一方面，活化的星狀細胞會激活肝臟組織中的巨噬細胞，促進炎癥；另一方面，激活的星狀細胞會直接調(diào)控肝細胞，促進其發(fā)生表皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化，從而加速肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程[2]。可見，肝細胞的脂肪代謝的異常與肝癌的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系。肝癌患者手術(shù)后殘存肝組織中的肝細胞肩負著分裂增殖、恢復肝臟重量及功能的重任，肝細胞脂肪代謝的紊亂無疑會影響這一過程。此外，手術(shù)后殘存的肝組織也提供了肝癌復發(fā)的微環(huán)境，是“種子腫瘤細胞”生根發(fā)芽的“土壤”，紊亂的肝細胞脂肪代謝會參與其“微環(huán)境”的構(gòu)建。因此，肝癌病人手術(shù)后殘存肝組織中肝細胞脂肪代謝的關(guān)鍵調(diào)控基因的表達變化可能會對患者手術(shù)后的預后產(chǎn)生較大的影響。

硬脂酰-輔酶A脫氫酶(stearoyl-CoA desaturase, SCD)是催化飽和脂酰輔酶A生成單不飽和脂酰輔酶A的關(guān)鍵酶[3-4]。高熱量飲食[5]、運動、激素等因素均影響SCD的表達水平。調(diào)控SCD蛋白表達水平或者是蛋白活性會導致細胞內(nèi)飽和與單不飽和脂肪酸比例的調(diào)整，從而進一步影響整個機體的脂質(zhì)代謝。有研究結(jié)果顯示，肥胖以及肝細胞中脂肪累積與肝細胞中SCD的表達水平呈正相關(guān)[6-7]。SCD作為脂肪酸合成的關(guān)鍵調(diào)控基因，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，參與腫瘤發(fā)展的多個方面，包括細胞增殖、細胞周期、凋亡、炎癥反應等[8-10]。腫瘤細胞中降低SCD的表達能夠誘導凋亡，抑制多種不同類型腫瘤生長[11-12]。盡管近期有研究表明與癌旁組織比較，SCD在肝癌組織中表達量增高，且其表達量與肝癌患者的預后相關(guān)[13]，但肝癌患者手術(shù)后殘存肝組織中SCD的表達量是否影響患者預后仍沒有定論。

本研究將探討肝癌患者手術(shù)后殘存肝組織中肝細胞SCD的表達對肝癌患者根治性切除術(shù)后腫瘤復發(fā)和患者生存時間的影響，明確肝癌患者肝組織中SCD高表達是否為肝癌切除術(shù)后復發(fā)和死亡的危險因素，為肝癌患者肝癌切除術(shù)后健康管理措施的制定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標本來源及隨訪 收集在上海東方肝膽外科醫(yī)院進行肝切除的176例乙肝相關(guān)肝癌患者的資料，包括手術(shù)時身高、體質(zhì)量、年齡、性別、肝硬化及肝炎史、甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)的大小及數(shù)目、癌栓、腫瘤分期等資料。術(shù)后1個月復查肝功能、AFP、乙肝病毒的脫氧核糖核酸(HBV-DNA)、肝臟增強磁共振，以后每3個月復查肝功能、AFP、HBV-DNA、B超，每6個月復查核磁共振、胸片。

1.2 組織芯片的構(gòu)建 選取遠離肝癌邊界的(>3 cm)肝組織作為實驗樣品。組織芯片由上海芯超生物科技有限公司協(xié)助制作，具體步驟包括：將組織陣列儀設計重提的組織陣列塊放置于52℃烤箱中加熱融合，采用全自動組織切片機以4 μm/rad進行切片，切片裱附在防脫載玻片上，并置于60℃恒溫烤箱中16 h，最后于4℃冰箱中保存。

1.3 免疫組織化學術(shù)檢測SCD的表達 免疫組織化學染色按照鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法(SP法)標準操作步驟進行?？筍CD單克隆抗體(HPA012107, Sigma-Aldrich)及二抗均購自sigma公司。結(jié)果判斷由3位病理科醫(yī)生完成，按目標蛋白染色程度分為無(切片上的染色為無色，-)、輕度(切片上的染色為淺黃色，+)、中度(切片上的染色為棕黃色，)和重度染色(切片上的染色為深棕色，)。

1.4 測量方法 測量身高、體質(zhì)量：入院時，患者著輕便衣服接受身高、體質(zhì)量的測量，身高以m為單位，記小數(shù)點后2位，體質(zhì)量以kg為單位，精確到0.5 kg。根據(jù)身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index, BMI)=體質(zhì)量(kg)/身高2(m2)，計算出患者的身體質(zhì)量指數(shù)值。

1.5 統(tǒng)計學處理 統(tǒng)計數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件處理，分層變量比較采用χ2檢驗。生存檢驗采用Kaplan-Meirer和Log-rank檢驗。檢驗水準(α)為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 SCD在肝癌患者肝組織中的表達 乙肝相關(guān)肝癌癌旁組織中SCD蛋白的陽性信號主要集中在細胞質(zhì)中(圖1)，偶爾也可見部分細胞核中陽性表達。176例組織中檢測出SCD的陽性表達率為85.80%(151/176)。

圖1 SCD在原發(fā)性肝癌癌旁肝組織中的表達(SP法)

2.2 肝癌患者肝組織中SCD表達與臨床病理特征的關(guān)系 根據(jù)176例乙肝相關(guān)肝癌癌旁組織中SCD的陽性表達水平，將患者分成SCD高水平組(染色程度為中度和重度染色，n=75)和低水平組(染色程度為無和輕度，n=101)，比較兩組患者之間性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤數(shù)量、分化程度、微血管癌栓的差異情況，發(fā)現(xiàn)兩組患者肝硬化、微血管癌栓、腫瘤數(shù)目有顯著差異(表1)。腫瘤數(shù)目為多個(≥2)的比例，SCD高水平組(18/75=24.00%)高于SCD低水平組(12/101=11.88%)；有微血管侵犯的比例，SCD高水平組(20/75=26.67%)高于SCD低水平組(13/101=12.87%)；而發(fā)生肝硬化的比例則是，SCD高水平組(16/75=21.33%)低于SCD低水平組(41/101=40.59%)，說明癌旁組織中SCD高水平表達與腫瘤數(shù)目多、發(fā)生微血管侵犯呈正相關(guān)，而與肝硬化的發(fā)生呈負相關(guān)。

2.3 肝癌患者肝組織中SCD表達與患者手術(shù)后預后的關(guān)系 在預后方面，肝組織中SCD高水平組病人的無瘤生存時間和總體生存時間均短于SCD低水平組，見圖2。

表1 肝癌患者肝組織中SCD表達水平與臨床病理特征間的關(guān)系

圖2 在預后方面，SCD蛋白表達高水平組的無瘤生存時間(A)和總體生存時間(B)均要短于SCD蛋白表達低水平組

3 討 論

我國肝癌患者大部分來自于慢性乙肝患者，應該重視慢性乙肝-肝硬化-肝癌的全過程、全方位的健康管理，肝癌復發(fā)率很高，對經(jīng)過治療的患者的健康管理同樣重要。目前我國肝癌患者的健康管理水平與肝癌發(fā)病大國的狀況是不相適應的，在肝癌患者臨床治療期間的健康管理工作中還有很多問題需要深入研究。特別是肝癌患者手術(shù)切除后的健康管理和健康指導，需要整合基礎(chǔ)科研的肝癌分子分型研究、臨床循證醫(yī)學研究和流行病學調(diào)查等方面的成果。

乙型肝炎病毒(hepatitis b virus, HBV)的慢性感染是導致肝細胞癌變最重要的原因。近年來的相關(guān)研究結(jié)果表明，HBV可通過多種途徑對人肝細胞的功能產(chǎn)生諸多影響。對HBV轉(zhuǎn)基因鼠肝臟組織的蛋白質(zhì)組學以及代謝組學的研究結(jié)果表明，HBV抗原的表達會導致肝細胞脂肪酸代謝紊亂[14]。伴隨著感染肝細胞組裝并分泌完整HBV病毒顆粒，肝細胞膜的丟失非常明顯，從而需要肝細胞大量合成新的細胞膜。眾所周知，細胞膜的主要結(jié)構(gòu)是脂質(zhì)雙分子層，因此細胞膜的更新會在一定程度上促進脂肪酸合成與代謝的活躍。此外，隨著肥胖、高脂血癥和糖尿病等代謝性疾病的全球化流行，NAFLD已成為目前對人類健康損害最嚴重的問題之一。據(jù)保守估計，全世界約有10億人口患有NAFLD，在生活水平相對較高的西方發(fā)達國家，該疾病的流行更是明顯，約有1/3的人口罹患該病[15]。Ascha等研究者近3年的隨訪數(shù)據(jù)表明，非酒精性脂肪性肝炎導致的肝硬化患者中約有12.8%的患者會進展為肝癌[16]。可見，在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中，肝細胞脂肪代謝紊亂起到重要作用[17]。而通過控制飲食、增加有氧運動等可行健康管理措施調(diào)整慢性乙型肝炎患者及肝癌患者肝細胞的脂肪代謝程度，可能會延緩疾病的進展，改善其預后。本研究之所以選擇肝癌手術(shù)病人遠離癌邊界(距離邊界3 cm以上)的肝組織(接近于手術(shù)后的殘存肝組織)進行研究，是基于肝癌的復發(fā)主要有兩種可能：一種是可能殘存的肝細胞重新“癌化”生成了一個“新的”肝癌，此時，殘存肝組織中的肝細胞基因表達的異常及功能改變實際上提供了其向癌細胞轉(zhuǎn)變的基礎(chǔ)；另一種可能是隱藏于殘存肝組織中的“少量癌細胞”增殖成為“肝內(nèi)轉(zhuǎn)移性”肝癌，在這種情況下，殘存肝組織中的肝細胞參與構(gòu)建的“微環(huán)境”對其增殖等變化有重要影響。因此，肝癌病人手術(shù)后殘存肝組織中肝細胞是影響其復發(fā)的重要因素。本研究主要是在肝癌手術(shù)病人遠離(距離邊界3 cm以上)癌邊界的肝組織中檢測脂肪代謝關(guān)鍵酶SCD的表達，發(fā)現(xiàn)其在殘存肝組織中的表達量越低，病人手術(shù)后的無瘤生存時間和整體生存時間就越長，預后越好。綜上所述，肝臟細胞脂肪代謝關(guān)鍵酶SCD在肝癌患者手術(shù)后殘存肝組織的表達與肝癌的臨床病理學特征之間存在相關(guān)性，提示其在肝癌復發(fā)中起一定作用。因此，研究及檢測SCD在肝癌患者手術(shù)后殘存肝組織的表達，對肝癌的治療以及判斷預后具有一定的臨床意義，可將SCD作為肝癌發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預后的評估指標。

[ 1 ] Piscaglia F, Svegliati-Baroni G, Barchetti A, et al. Clinical patterns of hepatocellular carcinoma in nonalcoholic fatty liver disease: A multicenter prospective study[J]. Hepatology, 2016,63(3):827-838.

[ 2 ] Benbow JH, Thompson KJ, Cope HL, et al. Diet-Induced Obesity Enhances Progression of Hepatocellular Carcinoma through Tenascin-C/Toll-Like Receptor 4 Signaling[J]. Am J Pathol, 2016,186(1):145-158.

[ 3 ] Flowers MT, Ntambi JM. Stearoyl-CoA desaturase and its relation to high-carbohydrate diets and obesity[J]. Biochim Biophys Acta, 2009,1791(2):85-91.

[ 4 ] Smith SB, Kawachi H, Choi CB, et al. Cellular regulation of bovine intramuscular adipose tissue development and composition[J]. J Anim Sci, 2009,87(14 Suppl):E72-E82.

[ 5 ] Schwenk RW, Jonas W, Ernst SB, et al. Diet-dependent alterations of hepatic SCD expression are accompanied by differences in promoter methylation[J]. Horm Metab Res,2013,45(11):786-794.

[ 6 ] Kotronen A, Sepp?nen-Laakso T, Westerbacka J, et al. Hepatic stearoyl-CoA desaturase (SCD)-1 activity and diacylglycerol but not ceramide concentrations are increased in the nonalcoholic human fatty liver[J]. Diabetes, 2009,58(1):203-208.

[ 7 ] García-Serrano S, Moreno-Santos I, Garrido-Sánchez L, et al. Stearoyl-CoA desaturase-1 is associated with insulin resistance in morbidly obese subjects[J]. Mol Med, 2011,17(3-4):273-280.

[ 8 ] Huang GM, Jiang QH, Cai C, et al. SCD negatively regulates autophagy-induced cell death in human hepatocellular carcinoma through inactivation of the AMPK signaling pathway[J]. Cancer Lett, 2015,358(2):180-190.

[ 9 ] Igal RA. Stearoyl-CoA desaturase-1: a novel key player in the mechanisms of cell proliferation, programmed cell death and transformation to cancer[J]. Carcinogenesis, 2010,31(9):1509-1515.

[10] von Roemeling CA, Marlow LA, Pinkerton AB, et al. Aberrant lipid metabolism in anaplastic thyroid carcinoma reveals stearoyl CoA desaturase 1 as a novel therapeutic target[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2015,100(5):E697-E709.

[11] Powell DA. An overview of patented small molecule stearoyl coenzyme-A desaturase inhibitors (2009 - 2013)[J]. Expert Opin Ther Pat, 2014,24(2):155-175.

[12] Zhang Z, Dales NA, Winther MD. Opportunities and challenges in developing stearoyl-coenzyme A desaturase-1 inhibitors as novel therapeutics for human disease[J]. J Med Chem, 2014,57(12):5039-5056.

[13] Budhu A, Roessler S, Zhao X, et al. Integrated metabolite and gene expression profiles identify lipid biomarkers associated with progression of hepatocellular carcinoma and patient outcomes[J]. Gastroenterology, 2013,144(5):1066-1075.

[14] Yang F, Yan S, He Y, et al. Expression of hepatitis B virus proteins in transgenic mice alters lipid metabolism and induces oxidative stress in the liver[J]. J Hepatol, 2008,48(1):12-19.

[15] Ahmed M. Non-alcoholic fatty liver disease in 2015[J].World J Hepatol, 2015,7(11):1450-1459.

[16] Ascha MS, Hanouneh IA, Lopez R, et al. The incidence and risk factors of hepatocellular carcinoma in patients with nonalcoholic steatohepatitis[J]. Hepatology, 2010,51(6):1972-1978.

[17] Saran U, Humar B, Kolly P, et al. Hepatocellular carcinoma and lifestyles[J]. J Hepatol,2016,64(1):203-214.

[本文編輯] 廖曉瑜, 賈澤軍

The relationship between the expression of stearoyl-CoA desaturase in liver tissue and the prognosis of HBV-related hepatocellular carcinoma patients

LIN Xiao-ping1,2, WANG Zhen-guang3, SUN Jin-hai1*

1. Department of Health Management, Faculty of Health Service, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China2. College of Basic Medical Sciences, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China3. Third Department of Biliary Tract, Shanghai Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China

Objective： To investigate the expression level and clinical significance of stearoyl-CoA desaturase (SCD) in liver tissues of HBV-related hepatocellular carcinoma (HCC) patients. Methods： We constructed the tissue microarray of liver tissue 3 cm beyond the HCC boundary (n=176), detected the expression level of SCD by immunohistochemistry, and analyzed the relationship between the expression level and clinical pathological features. Results： The positive rate of SCD in liver tissues of patients with HBV-related HCC patients was 85.80% (151/176). The SCD expression level was associated with tumor number, microvascular invasion, liver cirrhosis (P< 0.05). The tumor free survival time and overall survival time of SCD high level expression group were both shorter than those of SCD low level expression group. Conclusions： The SCD expression level in the liver tissues of HBV-related HCC patients is related to clinical pathology and prognosis, which suggests that the expression of SCD in the liver tissues of HCC patients can be used as a marker of poor prognosis.

hepatocellular carcinoma; stearoyl-CoA desaturase; tissue microarray; immunohistochemistry

2016-07-05 [接受日期] 2016-08-11

林曉平，碩士生，實驗師. E-mail: xiaolin714714@126.com

*通信作者(Corresponding author). Tel: 021-81870913, E-mail: sunjinhai2003@sina.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2016.20160026

R 735.7

A