A型豬流感病毒TaqMan探針熒光RT-PCR檢測(cè)方法的建立

王建華，陳小金，肖　妍，王玉玲，譚旭菲，趙　丹，張俊哲，陳本龍，王乃福，董志珍，趙祥平（天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心，天津　300456）

A型豬流感病毒TaqMan探針熒光RT-PCR檢測(cè)方法的建立

王建華，陳小金，肖妍，王玉玲，譚旭菲，趙丹，張俊哲，陳本龍，王乃福，董志珍，趙祥平
（天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心，天津300456）

根據(jù)A型豬流感病毒（SIV）的基質(zhì)蛋白（M）編碼基因保守序列設(shè)計(jì)合成一對(duì)特異性引物和一條TaqMan探針，建立了一種檢測(cè)A型SIV的熒光RT-PCR方法。結(jié)果顯示，該方法對(duì)H1N1、H3N2和H9N2亞型SIV均呈特異性擴(kuò)增，對(duì)豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬流行性腹瀉病毒和豬傳染性胃腸炎病毒等豬的其他常見(jiàn)病毒無(wú)交叉擴(kuò)增反應(yīng)；該方法對(duì)M基因RNA對(duì)照（SIV-M-RNA）的最適線性檢測(cè)范圍為3.8×101～3.8×108拷貝數(shù)/反應(yīng)，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y= -3.4365X+40.091，相關(guān)系數(shù)（R2）為0. 999 8，最低檢出限為38個(gè)拷貝數(shù)的SIV-M-RNA。對(duì)3個(gè)不同濃度（3.8×103～3.8×105copies /μL）的SIV-M-RNA進(jìn)行組間和組內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)，每個(gè)濃度的Ct值變異系數(shù)均小于1.5%，具有良好的重現(xiàn)性。用該方法對(duì)860份進(jìn)口豬的鼻拭子樣本和78份國(guó)內(nèi)豬場(chǎng)豬鼻拭子樣本進(jìn)行SIV檢測(cè)，結(jié)果進(jìn)口豬鼻拭子樣本的SIV檢測(cè)均為陰性，17份國(guó)內(nèi)豬場(chǎng)豬鼻拭子樣本SIV檢測(cè)為陽(yáng)性。本研究提供了一種快速、敏感和特異的A型豬流感病毒檢測(cè)方法。

A型豬流感病毒；TaqMan探針；熒光RT-PCR

豬流感（Swine Influenza，SI）是由正粘病毒科A型流感病毒（SIV）引起的一種急性、高度傳染性的豬呼吸道疾病[1]。豬群?jiǎn)我话l(fā)病時(shí)，發(fā)病率高，但死亡率低，通常5～7天后快速康復(fù)但如果與豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）、豬圓環(huán)病毒?。≒CV）、豬傳染性胸膜肺炎（APP）和豬支原體肺炎（MH）等病原混合或繼發(fā)感染時(shí)，死亡率就會(huì)升高，導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)損失增大[2]。目前SI為我國(guó)規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)普遍存在且難以根除的群發(fā)性疾病[3-5]。近年來(lái)SIV引發(fā)的流感病毒進(jìn)化與公共衛(wèi)生安全問(wèn)題已受到國(guó)內(nèi)外研究者的普遍關(guān)注，豬作為流感病毒的“混合器”在流感病毒新毒株的產(chǎn)生及跨種屬障礙感染新宿主的過(guò)程中起著重要作用[6]。對(duì)SIV要做出準(zhǔn)確診斷，需要借助實(shí)驗(yàn)室方法。由于目前診斷SIV的常規(guī)方法存在操作繁瑣和診斷周期長(zhǎng)等不足[7]，近年來(lái)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)已用于SIV核酸的檢測(cè)[8-9]。本研究基于保守的M基因建立了一種檢測(cè)A型豬流感病毒的通用型TaqMan探針熒光RTPCR檢測(cè)方法。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1病毒核酸及臨床樣本。H1N1、H3N2和H9N2亞型豬流感病毒核酸，H5N1禽流感病毒核酸，豬呼吸與繁殖綜合征病毒、豬瘟病毒、豬流行性腹瀉病毒和豬傳染性胃腸炎病毒核酸，由天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室保存。938份豬鼻拭子樣本，2012—2015年保存，其中860份鼻拭子樣品來(lái)自美國(guó)和丹麥進(jìn)口豬，78份鼻拭子樣品來(lái)自國(guó)內(nèi)疑似發(fā)病豬。

1.1.2主要儀器與試劑。Light Cycler? 480熒光PCR（Rochi）、5417R EPPENDORF冷凍離心機(jī)、ESCO CLASS ⅡBSC生物安全柜、TRIzol? LS Reagent，購(gòu)自Invetrogent公司；TaKaRa ExTaqRDNA 聚合酶、PstI限制性?xún)?nèi)切酶、One Step PrimeScript? RT-PCR Kit（Perfect Real Time），購(gòu)自大連寶生物工程（大連）有限公司；質(zhì)粒快速提取試劑盒，購(gòu)自北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司；Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System、RiboMAXTMLarge Scale RNA Production System T7，購(gòu)自Promega公司。其他試劑均為國(guó)內(nèi)或進(jìn)口分析純?cè)噭?/p>

1.2方法

1.2.1設(shè)計(jì)合成引物及探針。從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載SIVM基因序列，進(jìn)行生物學(xué)信息分析，選出高度保守且特異的區(qū)域，用Beacon Designer7.0軟件設(shè)計(jì)特異引物和TaqMan探針，由上海百力格生物技術(shù)有限公司合成。5′端用HEX標(biāo)記，3′端用BHQ1標(biāo)記，引物和探針序列見(jiàn)表1，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為74 bp。

表1　引物與探針序列

1.2.2制備RNA標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。根據(jù)SIV M基因序列（KM028202 ）設(shè)計(jì)4條引物，序列見(jiàn)表2。以SIVM1/SIVM2為模板，SIVMF/SIVMR為引物，按常規(guī)PCR方法擴(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收后與PMD18-T克隆載體連接，轉(zhuǎn)化至E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性重組克隆。以經(jīng)PstI酶切線性化的插入SIV M基因靶序列的重組質(zhì)粒DNA為模板，用RiboMAX Large Scale RNA Production System-T7試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，對(duì)體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)RQ1 DNA酶消化及純化，即制備成含有靶擴(kuò)增序列的RNA標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，命名為SIV-MRNA。用核酸蛋白分析儀測(cè)定SIV-M-RNA的濃度。按相應(yīng)公式換算出的拷貝數(shù)為3.8×108copies/μL。

表2　用于制備RNA標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的寡核酸鏈

1.2.3提取總RNA。按常規(guī)TROZOL試劑方法，分別提取樣本的總RNA，并于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4優(yōu)化熒光RT-PCR反應(yīng)條件。使用One Step PrimeScript? RT-PCR Kit（Perfect RealTime）試劑及其推薦的25 μL反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件，以3.8×106copies/μL的SIV-M-RNA為模板，在Light Cycler? 480熒光PCR（Rochi）儀上，首先對(duì)不同濃度組合的引物和標(biāo)記探針進(jìn)行熒光RT-PCR方陣篩選試驗(yàn)，確定最適引物和探針使用濃度；然后在最適引物和標(biāo)記探針濃度下，在56～61℃范圍內(nèi)，篩選最適的退火延伸溫度。

1.2.5繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將SIV-M-RNA用滅菌去離子水稀釋成3.8×101～3.8×108copies /μL的濃度范圍。每個(gè)稀釋度分別取1 μL作為模板，在1.2.4優(yōu)化的反應(yīng)條件下進(jìn)行熒光RT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后以Ct值為橫坐標(biāo)、SIV-M-RNA模板起始拷貝數(shù)濃度的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6敏感性、重復(fù)性和特異性試驗(yàn)。將SIV-MRNA做10倍系列稀釋。每個(gè)稀釋度分別取1 μL作為模板，在1.2.4優(yōu)化的反應(yīng)條件下進(jìn)行熒光RT-PCR擴(kuò)增，確定該方法可以檢出SIV-M-RNA的最低拷貝數(shù)；將3個(gè)稀釋度（3.8×103～3.8×107copies /μL）的SIV-M-RNA為模板，按1.2.4優(yōu)化的反應(yīng)條件，分別進(jìn)行組內(nèi)和組間重復(fù)試驗(yàn)，確定該方法的可重復(fù)性；以SIV、CSFV、PRRSV、PEDV和TGEV的基因組RNA為模板，按1.2.4優(yōu)化的反應(yīng)條件，進(jìn)行熒光RT-PCR擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照，確定該方法的特異性。

1.2.7臨床樣本檢測(cè)。對(duì)2012—2015年期間保存的938份豬鼻拭子樣本，采用本研究建立的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法進(jìn)行SIV核酸檢測(cè)，評(píng)價(jià)該方法的實(shí)用性。當(dāng)Ct值小于37時(shí)判定為陽(yáng)性，Ct值在37～40之間的判定為可疑；如重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果的Ct值仍在37～40之間時(shí)判定為陰性，無(wú)Ct值時(shí)判定為陰性。

2　結(jié)果

2.1熒光RT-PCR反應(yīng)優(yōu)化條件

通過(guò)對(duì)不同濃度的引物和標(biāo)記探針組合以及退火延伸溫度的篩選試驗(yàn)，最后確定最適熒光RTPCR擴(kuò)增條件為：在25 μL反應(yīng)體系中，依次加入2×One Step RT-PCR bufferⅢ 12.5 μL，TaKaRa Ex TaqHS（5U/μL）0.5 μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅡ0.5 μL，SIV-M-F（10.0 pmmol/μL）SIV-M-R（10.0 pmmol/μL）和SIV-M-P（4.0 pmmol/μL）各0.5 μL，SIV-M-RNA（×106copies /μL）模板1 μL，補(bǔ)足純水至25 μL。反應(yīng)參數(shù)為42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 sec，然后95 ℃ 10 sec，60 ℃ 30 sec，45個(gè)循環(huán)。在每一次循環(huán)60 ℃退火結(jié)束前，采集HEX通道的熒光信號(hào)。在該優(yōu)化熒光RT-PCR反應(yīng)條件下，可獲得典型的S型擴(kuò)增曲線（圖1）。

圖1　SIV-M-RNA（3.8×106copies /μL）的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR動(dòng)力學(xué)曲線

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線

以3.8×101～3.8×108copies /μL的RNA標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照為擴(kuò)增模板，按優(yōu)化反應(yīng)條件進(jìn)行熒光RT-PCR反應(yīng)，擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖2-A；以起始模板濃度的對(duì)數(shù)為X軸，Ct 值為Y軸繪制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2-B。Ct 值與RNA標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照拷貝數(shù)之間的線性關(guān)系表達(dá)式為Y= -3.4365X+40.091，相關(guān)系數(shù)（R2）為0. 999 8，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖2　SIV-M-RNA實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增曲線（A）和標(biāo)準(zhǔn)曲線（B）

2.3敏感性試驗(yàn)

對(duì)不同稀釋度的RNA標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，按優(yōu)化后的反應(yīng)條件進(jìn)行熒光RT-PCR反應(yīng)，擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖2。由圖2可知該方法最低可檢出個(gè)38拷貝的RNA標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照分子。

2.4重復(fù)性試驗(yàn)

選取3個(gè)濃度的RNA標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照為模板，按優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行組內(nèi)和組間重復(fù)試驗(yàn)。每個(gè)稀釋度的Ct值和標(biāo)準(zhǔn)差（SD）及變異系數(shù)（CV）見(jiàn)表3。3個(gè)濃度的RNA標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的Ct值變異系數(shù)均小于1.0%，表明本試驗(yàn)所建立的熒光RT-PCR檢測(cè)體系穩(wěn)定，具有良好的重復(fù)性。

表3　實(shí)時(shí)熒光RT-PCR重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.5特異性試驗(yàn)

以SIV、CSFV、PRRSV、PEDV和TGEV的基因組RNA為模板進(jìn)行熒光RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，H1N1和H3N2亞型的SIV均呈特異性擴(kuò)增，而CSFV、PRRSV、PEDV和TGEV的基因組RNA均無(wú)擴(kuò)增曲線出現(xiàn)，表明該方法檢測(cè)SIV核酸有良好的特異性。

圖3　熒光RT-PCR檢測(cè)SIV的特異性

2.6臨床樣本檢測(cè)

用該方法對(duì)2012—2015年保存的860份進(jìn)口豬的鼻拭子樣本和78份國(guó)內(nèi)豬場(chǎng)豬鼻拭子樣本進(jìn)行SIV檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，860份進(jìn)口豬鼻拭子樣本的SIV檢測(cè)結(jié)果均為陰性，在78份國(guó)內(nèi)豬場(chǎng)豬鼻拭子樣本中有17份為SIV檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性。

表4　938份實(shí)際樣本的SIV實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

3　討論

一些研究表明，SIV作為一種豬呼吸道疾病綜合癥的原發(fā)性病原，在破壞豬呼吸道上皮的防御屏障后，極易使豬合并PRRSV、PCV2、肺炎支原體和胸膜肺炎放線桿菌感染或繼發(fā)感染，從而導(dǎo)致呼吸道病程的延長(zhǎng)和死亡率的增高，對(duì)豬群危害極大[2]。因此，對(duì)豬群SIV感染的監(jiān)測(cè)可為調(diào)查豬呼吸道疾病綜合癥的病因及制定控制措施提供重要的病原學(xué)依據(jù)。此外，SIV不僅危害豬群，而且同時(shí)具有感染人和禽的潛力[6]，因此SIV的檢測(cè)具有重要的公共衛(wèi)生意義。與傳統(tǒng)的檢測(cè)SIV方法相比，熒光RT-PCR檢測(cè)SIV核酸技術(shù)具有快速而敏感的優(yōu)勢(shì)。目前國(guó)內(nèi)研究人員已報(bào)道了多種檢測(cè)SIV的熒光RT-PCR方法[8-9]。本試驗(yàn)建立的這種基于TaqMan 探針的通用型SIV熒光RT-PCR 檢測(cè)方法具有良好的特異性，并顯示出良好的定量線性關(guān)系和重復(fù)性。通過(guò)對(duì)860份進(jìn)口豬的鼻拭子樣本和78份國(guó)內(nèi)豬場(chǎng)豬鼻拭子樣本的SIV檢測(cè)，結(jié)果表明本研究建立的通用型SIV熒光RT-PCR檢測(cè)方法可用于臨床中SIV的檢測(cè)。

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Development of a Real-time RT-PCR Assay with TaqMan Probe for Detecting Swine Influenza A Virus

Wang Jianhua，Chen Xiaojin，Xiao Yan，Wang Yuling，Tan Xufei，Zhao Dan，Zhang Junzhe，Chen Benlong，Wang Naifu，Dong Zhizhen，Zhao Xiaoping
（Animals and Plants and Food Inspection Center of Tianjin Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Tianjin300456）

A Taqman probe-based real-time RT-PCR was developed with a pair of primers and a probe designed according to the conserved region of M gene sequence of swine influenza A virus （SIV）. Results showed the assay was specific to detect subtype H1N1，H3N2 and H9N2 of swine influenza A virus and had no cross-reaction with classical swine fever virus（CSFV），porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV），porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）and transmissible gastroenteritis virus（TGEV）. The real-time RT-PCR assay has a broad linear detection range for RNA standard control of M gene of SIV（SIV-M-RNA）from 3.8×101copies/μL to 3.8×108copies/μL，the standard curve equation was Y= -3.4365X+40.091，and the correlation coefficient of the assay was 0.999 8. This assay could detect 38 copies/μL of SIV-M-RNA at the lowest level. Three different concentrations of SIV-M-RNA were used to test the repeatability，and the coefficients of variation（CVs）of both inter-assay and intra-assay were less than 1.5%，showing good repeatability. 938 nasal swab samples were tested for SIV detection by the assay. No positivereaction was found for all 860 samples from imported pigs. 17 of 78 samples from domestic pigs were found to be positive for SIV detection. These results suggested that the newly established real-time RT-PCR would provide a rapid，sensitive and specific detection for swine influenza A virus.

swine influenza A virus；TaqMan probe；real-time RT-PCR

S852.65

B

1005-944X（2016）12-0085-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.12.023

天津市科技支撐項(xiàng)目（13ZCZDNCO1300）；天津市濱海新區(qū)惠民項(xiàng)目（2013-BK15H013）

（責(zé)任編輯：朱迪國(guó)）