徐 穎,樊明濤,張庭靜，董 梅,黃 佳

(1.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,陜西西安 710021;2.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,陜西楊凌 712100)

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蘋果根皮素糖基轉(zhuǎn)移酶酶學(xué)特性研究

徐 穎1,2,樊明濤2,*,張庭靜2，董 梅2,黃 佳2

(1.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,陜西西安 710021;2.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,陜西楊凌 712100)

以蘋果果皮為原料,通過飽和硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose陰離子交換法和Sephadex G75凝膠過濾色譜純化,獲得純化后的根皮素糖基轉(zhuǎn)移酶,其比酶活達(dá)到632.0 U/mg,純化倍數(shù)為71.0倍,回收率達(dá)到42.6%。SDS-PAGE鑒定其表觀分子量為50 ku。酶的最適pH為8.5,pH7.0～9.0有利于保持酶的穩(wěn)定性。最適溫度為45 ℃。以根皮素為底物測定的Km為3.16 μmol/L,Vmax為0.77 nM/min·mg蛋白。金屬離子在反應(yīng)體系的終濃度為5 mmol/L時,Ca2+和Mg2+對該蘋果根皮素糖基轉(zhuǎn)移酶有促進(jìn)作用,Na+和K+作用不明顯,Al3+、Cu2+、Mn2+和Zn2+有顯著的抑制作用,Cu2+的抑制作用最強(p<0.05)。結(jié)論:根皮素糖基轉(zhuǎn)移酶具有較好的堿穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性,在根皮苷的酶法合成方面具有應(yīng)用潛力。

蘋果根皮素糖基轉(zhuǎn)移酶,純化,酶學(xué)性質(zhì)

糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyltransferase,GT,EC 2.4.x.y)是將核苷酸-糖供體中的單糖分子轉(zhuǎn)移到其他的碳水化合物、蛋白或脂分子上,形成糖苷鍵。糖基化是植物體內(nèi)一種重要的翻譯后修飾過程,通過調(diào)節(jié)細(xì)胞重要代謝物的水平、活性在植物自動調(diào)節(jié)方面起重要作用[1-2]。同時,也是決定天然產(chǎn)物生物活性和生物利用度的重要因素之一[3-4]。

根皮苷是蘋果的特征多酚,具有抗氧化性[5]、清除體內(nèi)自由基[6]、降低血糖[7]、抑菌[8]等多種生物活性。但僅存在于石柯屬(Lithocarpus polystachyus)[9],薔薇屬(Rosa canina)[10]等植物中,且含量低。UDPG:根皮素-2′-O-糖基轉(zhuǎn)移酶催化根皮素生成根皮苷,且為根皮苷生物合成的關(guān)鍵酶。對該酶進(jìn)行分離純化及酶學(xué)特性研究,為體外合成根皮苷提供一種途徑。但目前對該酶的特性報道較少,本研究以蘋果果皮為原料,采用飽和硫酸銨鹽析、DEAE陰離子交換法、Sephadex G75凝膠過濾色譜法分離純化得到根皮素糖基轉(zhuǎn)移酶。對酶的最適pH、pH穩(wěn)定性、最適溫度、溫度穩(wěn)定性及酶反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)進(jìn)行研究,為該酶在食品工業(yè)的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

富士(Fuji)蘋果 陜西西安楊凌,果皮用錫箔紙包裹,液氮速凍,-80 ℃保存?zhèn)溆?根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品(純度>99.9%),尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)美國Sigma公司;根皮素,二硫蘇糖醇(DTT) 德國Merck公司;交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(PVPP),聚乙二醇PEG20,000,丙烯酰胺,甲叉雙丙烯酰胺,過硫酸銨,溴酚藍(lán),十二烷基硫酸鈉(SDS),四甲基乙二胺(TEMED),考馬斯亮蘭G-250、R-250 美國Amresco公司;色譜甲醇 TEDIA公司;其他試劑為分析純。

AKTA Purifier100蛋白純化儀 瑞典Amersham Biosciences公司;LC-20AT液相色譜儀,該系統(tǒng)配有SPD-M20A光電二極管陣列檢測器,CTO-20A柱溫箱,SIL-20A自動進(jìn)樣器,DGU-20A5在線脫氣裝置 日本島津公司;cp2245型分析天平 德國Sartorius公司;Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司;MDF-U53V型-80 ℃超低溫冰箱 日本Sanyo公司;HC-3018R型高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學(xué)儀器公司;液氮罐 四川東亞低溫容器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 糖基轉(zhuǎn)移酶提取純化方法

1.2.1.1 硫酸銨鹽析 參照陳欣等[11]方法。稱取凍于-80 ℃的蘋果果皮1 g,置于用液氮預(yù)冷的研缽中,研成粉末,加0.5 g石英砂和0.5 g PVPP,混勻,加10 mL提取液(0.1 mol/L Tris-HCl,pH8.1,5 mmol/L DTT,5 mmol/L EDTA),研磨20 min,12000 r/min 4 ℃離心20 min,上清液在冰浴中邊攪拌邊緩慢加入硫酸銨粉末至30%飽和度,靜置3 h,12000 r/min轉(zhuǎn)速下4 ℃離心20 min,上清液在冰浴中邊攪拌邊緩慢加入硫酸銨粉末至80%飽和度,靜置3 h,12000 r/min 4 ℃離心20 min,沉淀用0.02 mol/L Tris-HCl(pH8.1)緩沖液重新溶解,4 ℃過夜透析,得粗酶液。

1.2.1.2 DEAE陰離子交換(DEAE-Sepharose Fast Flow anion-exchange) 柱子型號為HiTrap DEAE-Sepharose Fast Flow column(1 mL,Amersham Biosciences);低鹽緩沖液(A):20 mmol/L Tris-HCl buffer,pH8.5,高鹽緩沖液(B):20 mmol/L Tris-HCl buffer,pH8.5,1 mol/L NaCl;緩沖液使用前用0.22 μm濾膜過濾,防止堵塞系統(tǒng)或柱子。

將粗酶液過0.22 μm濾膜,注射到 AKTA蛋白純化系統(tǒng),用0～0.5 mol/L NaCl以1 mL/min進(jìn)行線性洗脫,每管收集1 mL洗脫液,檢測各個洗脫峰峰值管洗脫液的根皮素糖基轉(zhuǎn)移酶酶活,將有酶活的部分進(jìn)行合并,轉(zhuǎn)入透析袋(截留分子量MWCO 0.8～1.4 ku)用PEG 20,000在4 ℃進(jìn)行濃縮。濃縮酶液用于凝膠過濾。

1.2.1.3 凝膠過濾色譜 柱子型號為SuperdexTM75 10/300 GL column(24 mL,Amersham Biosciences)。將過DEAE陰離子柱后收集的濃縮酶液注射到 AKTA蛋白純化系統(tǒng),使用凝膠柱進(jìn)行純化。用緩沖液(0.02 mol/L Tris-HCl buffer,pH8.5)以1 mL/min流速進(jìn)行洗脫,每管收集1 mL洗脫液。檢測各個洗脫峰峰值管洗脫液的根皮素糖基轉(zhuǎn)移酶酶活,合并有酶活的部分,轉(zhuǎn)入透析袋(截留分子量MWCO 0.8～1.4 ku)用PEG 20,000在4 ℃進(jìn)行濃縮,存放在-20 ℃用于作SDS-PAGE驗證和酶學(xué)特性分析。

1.2.2 酶活測定 根皮素糖基轉(zhuǎn)移酶酶活以尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)和根皮素的反應(yīng)來測定。反應(yīng)體系如表1。

表1 反應(yīng)體系Table 1 Reaction system

30 ℃水浴反應(yīng)1 h,用60 μL冰乙酸終止反應(yīng)。反應(yīng)液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后,用HPLC定量測定反應(yīng)產(chǎn)物根皮苷[12]。在pH7.5,30 ℃條件下,每mg蛋白每min生成1 μg根皮苷所需的酶量為1比酶活單位(U/mg)。以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn),用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量。

1.2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 方法參照《分子克隆實驗指南(第3版)》[13]。

1.2.4 酶學(xué)性質(zhì)

1.2.4.1 pH對酶活及穩(wěn)定性的影響 分別在4.0、4.6、5.0、5.6的50 mmol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液,6.0、6.5、7.0、7.5的50 mmol/L磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀緩沖液,8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液中測定酶活,以確定根皮素糖基轉(zhuǎn)移酶的最適pH。

1.2.4.2 pH穩(wěn)定性實驗 共設(shè)置3組,調(diào)節(jié)每組酶液的pH,分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0,使每組酶液分別置于4、25、50 ℃下保溫1 h,測定其酶活,以每組中未處理的酶液做對照,計算相對酶活。

1.2.4.3 溫度對酶活的影響 分別在25、30、35、40、45、50、60 ℃下,測定其酶活,以相對酶活最高值為100%,計算相對酶活。

1.2.4.4 酶的熱穩(wěn)定性 將等量酶液分別置于40、50、60 ℃保溫,每隔30 min,取樣測酶活,以未處理的酶液為對照,計算相對酶活。

1.2.4.5 金屬離子對酶活的影響 在酶的反應(yīng)液中加入金屬離子Al3+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Na+和 K+,金屬離子的最終濃度為5 mmol/L,測定其酶活,以未加金屬離子的酶活為100%,計算相對酶活。

表2 蘋果根皮素糖基轉(zhuǎn)移酶的純化Table 2 Purification of MdP2’GT from apple peel

注:a總酶活=比酶活×總蛋白;b純化倍數(shù)=比酶活/粗酶比酶活;c回收率(%)=(總酶活/粗酶總酶活)×100。

1.2.4.6 酶促反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)的測定 純化的根皮素糖基轉(zhuǎn)移酶與不同濃度的根皮素反應(yīng)后測定其酶活,以Linewear-Burk雙倒數(shù)作圖法[14](袁勤生和趙健2005),以根皮素濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo),反應(yīng)速率的倒數(shù)為縱坐標(biāo),求出該酶對底物的Km值和Vmax值。

2 結(jié)果與討論

2.1 蘋果根皮素糖基轉(zhuǎn)移酶的純化

經(jīng)離子交換層析色譜和凝膠過濾色譜分離得到具有MdP2’GT活性的蛋白,SDS-PAGE 電泳分析顯示,在電泳圖上只出現(xiàn)一條蛋白帶,表觀分子量為50 ku(圖1)。植物糖基轉(zhuǎn)移酶的分子量絕大部分的分子量集中在45 ku到60 ku之間[15]。Nagashima 等[16]從黃芩細(xì)胞懸液中純化的UDP-葡萄糖醛酸酯:黃芩素-7-O-糖基轉(zhuǎn)移酶經(jīng)SDS-PAGE鑒定出分子量為52 ku。本研究得到的蘋果根皮素糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白分子量介于此范圍之內(nèi)。

圖1 純化后MdP2’GT 的SDS-PAGE電泳圖Fig.1 SDS-PAGE of purified MdP2’GT 1-純酶,M-蛋白marker。

如表2,經(jīng)80%飽和硫酸銨鹽析、DEAE陰離子交換法、Sephadex G75凝膠過濾色譜法分離純化,比酶活達(dá)到632.0 U/mg,純化倍數(shù)為71.0倍,回收率達(dá)到42.6%。

2.2 酶學(xué)特性

酶反應(yīng)液中pH通過影響酶的帶電特性來影響酶的活性中心與底物的結(jié)合能力,從而影響酶的催化活性。適宜的pH條件能夠促進(jìn)底物與酶的結(jié)合,有利于酶的催化作用。從圖2可以看出蘋果根皮素糖基轉(zhuǎn)移酶在偏酸性至中性條件下(pH4.0～7.0),相對酶活均較低,只有最高酶活的23.57%～32.06%。pH大于7.0,相對酶活迅速升高,pH為8.5酶活最高,而后隨pH增大,相對酶活迅速降低。因此MdP2’GT最適pH為8.5。Gosch等[17]研究的蘋果和梨的根皮素糖基轉(zhuǎn)移酶的最適pH7.0～8.0,本結(jié)果雖然與這篇文獻(xiàn)不完全一致,但表明MdP2’GT在偏堿性條件下酶活較高。

圖2 pH對MdP2’GT酶活的影響Fig.2 Effect of pH on MdP2’GT activity

由圖3可知,在3個溫度下隨pH升高,MdP2’GT相對酶活都升高,pH8.0時最高,即最穩(wěn)定,之后,隨pH升高,相對酶活降低。說明pH7.0～9.0,有利于保持酶的穩(wěn)定性。pH低于7.0或高于9.0時,酶活都會迅速下降。pH4.0～6.0范圍內(nèi),4 ℃時相對酶活顯著高于25 ℃和50 ℃的酶活(p<0.05),說明低溫有利于酶的穩(wěn)定。

圖3 MdP2’GT pH穩(wěn)定性Fig.3 pH stability of MdP2’GT

如圖4所示,蘋果根皮素糖基轉(zhuǎn)移酶最適溫度為45 ℃,與Gosch等[17]研究的根皮素糖基轉(zhuǎn)移酶的最適溫度一致。溫度為40 ℃,相對酶活為68.14%,溫度為50 ℃,相對酶活66.28%。隨溫度升高,相對酶活迅速降低,這主要是由酶變性引起的酶活降低。

圖4 溫度對糖基轉(zhuǎn)移酶酶活的影響Fig.4 Effect of temperature on MdP2’GT activity

如圖5所示,在40、50和60 ℃三個溫度下,蘋果根皮素糖基轉(zhuǎn)移酶都是隨保溫時間的延長,酶活降低,且溫度越高,酶活損失的越多。在40、50、60 ℃保溫2 h后,酶活分別降為83.9%、66.1%和51.2%。說明該酶在40 ℃下較穩(wěn)定,40 ℃以上,酶活迅速降低。

圖5 酶的熱穩(wěn)定性Fig.5 Thermal stability of MdP2’GT

當(dāng)金屬離子在反應(yīng)體系的終濃度為5 mmol/L時,Ca2+和Mg2+對蘋果根皮素糖基轉(zhuǎn)移酶酶活有促進(jìn)作用。Yue[18]報道Ca2+和Mg2+對三七(Panax notoginseng)懸浮細(xì)胞中的UDPG:人參皂苷Rd糖基轉(zhuǎn)移酶(UGRdGT)有促進(jìn)作用。Na+和K+作用不明顯,Al3+、Cu2+、Mn2+和Zn2+有顯著的抑制作用,Cu2+的抑制作用最強。Fukuchi-Mizutani[19]報道三花龍膽(Gentiana triflora)UDPG:花青素-3′-O-糖基轉(zhuǎn)移酶酶活被Al3+抑制20%。此外,長春花(Catharanthus roseus)的龍膽酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶都強烈的被 Zn2+抑制[20]。綠毛山柳菊(Hieracium pilosella)的木樨草素糖基轉(zhuǎn)移酶UGT90A7 和UGT95A1活性被Cu2+完全抑制[21]。

圖6 金屬離子對酶活的影響Fig.6 Effect of cations at 5 mmol/L on MdP2’GT activity

純化的根皮素糖基轉(zhuǎn)移酶與不同濃度的根皮素反應(yīng)后測定其酶活,以根皮素濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo),反應(yīng)速率的倒數(shù)為縱坐標(biāo),作Linewear-Burk雙倒數(shù)曲線,如圖7,得到回歸方程為

以根皮素為底物該酶的Km為3.16μmol/L,Vmax為0.77nM/min·mg蛋白。這與Noguchi等[22]得到的結(jié)論相似,該作者從大豆(Glycinemax)苗根部提取異黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucose:isoflavone7-O-glucosyltransferase),得出以染料木素為底物的Km值為3.6μmol/L。

圖7 MdP2’GT雙倒數(shù)曲線Fig.7 Linewear-Burk curve for MdP2’GT

3 結(jié)論

本研究從蘋果果皮分離純化得到蘋果根皮素糖基轉(zhuǎn)移酶,經(jīng)SDS-PAGE鑒定其表觀分子量為50 ku。該酶最適pH8.5,在pH7.0～9.0范圍內(nèi),有利于保持酶的穩(wěn)定性,最適溫度45 ℃,該酶在40 ℃下較穩(wěn)定。當(dāng)金屬離子在反應(yīng)體系的終濃度為5 mmol/L時,Ca2+和Mg2+對酶活有促進(jìn)作用。該酶具有較好的堿穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性,本研究為體外酶法合成根皮苷提供理論基礎(chǔ)。

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Study on the enzymatic properties of Uridine Diphosphate Glucose:phloretin-2′-O-glycosyltransferase fromMalusxDomestica

XU Ying1,2,FAN Ming-tao2,*,ZHANG Ting-jing2,DONG Mei2,HUANG Jia2

(1.School of Food and Biological Engineering,Shaanxi University of Science &Technology,Xi’an 710021,China;2.College of Food Science and Engineering,Northwest A & F University,Yangling 712100,China)

UridineDiphosphateGlucose:phloretin-2′-O-glycosyltransferasefromMalus x Domestica(MdP2’GT)waspurifiedusingtheammoniumsulfateprecipitation,DEAE-Sepharoseanion-exchangeandSephadexG75gelfiltrationchromatographyprocedurestoapparenthomogeneity.Specificactivityforpurifiedenzymewas632.0U/mg.Thepurficationfoldwas71.0andrecoveryratewas42.6%.Themolecularweightwasestimatedtobe50kubySDS-PAGE.ThepurifiedenzymecatalyzedtheglycosylationreactionwithoptimalactivityatpH8.5andwasstableoverarangeofpH7.0～9.0.Theoptimaltemperatureforenzymeactivitywas45 ℃.TheKmvalueforMdP2’GTwasdeterminedtobe3.16μmol/L,andVmaxwas0.77nM/min·mgprotein.Attheconcentrationof5mmol/L,MdP2’GTwasfoundtobeactivatedbythepresenceofCa2+andMg2+ions.TheactivityofMdP2’GTwasnotapparentlyaffectedbyNa+orK+,butitwassignificantlyinhibitedbyAl3+,Cu2+,Mn2+andZn2+.TheinhibitioneffectofCu2+wasthestrongest(p<0.05).MdP2’GTexhibitspHstabilityunderalkalineconditionandthermalstability,whichhaspotentialapplicationsintherespectofenzymaticsynthesisofphloridzin.

UDPG:phloretin-2′-O-glycosyltransferasefromMalus x Domestica;purfication;enzymaticproperty

2016-05-10

徐穎(1978-),女,博士研究生,講師,主要從事食品生物技術(shù)研究，E-mail:xuying@sust.edu.cn。

*通訊作者:樊明濤(1963-),男,博士,教授,主要從事食品生物技術(shù)研究，E-mail:fanmt@nwsuaf.edu.cn。

高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金項目(20130204110032)；陜西科技大學(xué)科研啟動金-自然科學(xué)預(yù)研基金(2016BJ-21)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)21-0178-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.026