□趙越　劉立元　劉騰 趙月蘭　秦建華（河北農業(yè)大學動物醫(yī)學院）

牛病毒性腹瀉病-黏膜病診斷與防治技術

□趙越劉立元劉騰 趙月蘭秦建華（河北農業(yè)大學動物醫(yī)學院）

牛病毒性腹瀉病-黏膜?。˙ovineviraldiarrhea-Mucosaldisease，BVD-MD）是由牛病毒性腹瀉病毒（Bovineviraldiarrheavirus，BVDV）引起的牛傳染病，其特征是消化道黏膜糜爛、壞死、胃腸炎和腹瀉。此病呈世界性分布，在許多養(yǎng)牛發(fā)達國家，如美國、新西蘭、加拿大等尤其嚴重，給畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經濟損失。我國自80年代首次報道該病以來，許多地區(qū)先后報道有本病的發(fā)生，內蒙、吉林、寧夏、山東、河南和西藏、新疆、南京、北京、安徽、江蘇、廣西等均有本病的報道，表明我國也存在著嚴重的污染，應引起足夠的重視。河北省現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系奶牛產業(yè)創(chuàng)新團隊奶牛疾病防控崗位對河北省奶牛牛病毒性腹瀉/黏膜病進行流行病學調查，研制和集成牛病毒性腹瀉/黏膜病診斷和防治技術，為有效地控制奶牛病毒性腹瀉/黏膜病的發(fā)生和流行提供技術支撐。

1　流行病學

本病分布于世界各地。不同季節(jié)、不同地區(qū)對不同品種、不同年齡動物均可引起發(fā)病。經常呈地方性流行。

1.1傳染來源

本病的傳染源主要為病牛和帶毒動物，山羊、綿羊、豬、鹿及小袋鼠等都可感染，一般沒有明顯臨床癥狀，但成為本病的重要傳染來源。肉用牛和奶牛均易感，多發(fā)。病畜可發(fā)生持久性的病毒血癥，其血、精液、脾、骨髓、腸淋巴結等組織帶毒；病牛及隱性感染牛的呼吸道、眼分泌物、乳汁及糞便等排泄物均含有大量病毒，康復奶?？梢詭Ф?00余天，不斷排毒形成傳染源。綿羊多為隱性感染，妊娠母羊常發(fā)生流產或產下先天性帶毒羔羊，是本病的傳染源。

1.2發(fā)病年齡和發(fā)病季節(jié)

各種年齡的奶牛對本病毒均易感，尤以6～18個月齡的犢牛發(fā)病較多。全年均可發(fā)病，通常多發(fā)生于冬季和初春。

1.3傳染途徑

本病可通過直接接觸或間接接觸而傳播，還可通過胎盤感染，特別是妊娠后120天內感染，病毒可透過胎盤屏障而使犢牛感染。應特別注意通過帶毒精液的傳播。

1.4發(fā)病率和病死率

本病的發(fā)病率一般為5%左右，犢牛中急性病例可高達25%，病死率為90%～100%。隱性感染率在50%以上。有些慢性病例呈持續(xù)感染。

2　臨床癥狀

本病的臨床表現(xiàn)與發(fā)病日齡、動物種類、病程長短、有無繼發(fā)或并發(fā)感染有很大關系。在自然情況下，臨床上分為急性型和慢性型。

2.1急性型

潛伏期多為7～10天。常突然發(fā)病，體溫升高達40℃～42℃，精神高度沉郁，厭食，有的可見臌氣。發(fā)病2～4天后，口腔黏膜表現(xiàn)為孤立的淺糜爛，之后糜爛融合成大片壞死，常見于唇內、齒齦、齒墊、硬腭的后部、口角和舌上。大量流涎，呼氣惡臭。隨后出現(xiàn)腹瀉，初期常呈水樣，后期帶有黏液及血液，糞便惡臭。鼻鏡有糜爛病變，其損害逐漸融合并覆以痂皮，鼻液呈黏液或膿性。部分患牛康復較快，黏膜損害可在10～14天內痊愈。如腹瀉嚴重，呈急性進行性脫水及衰弱，常在癥狀出現(xiàn)后5～7天死亡，個別病例2天后即死亡。在妊娠90～120天之間受感染時，病毒常侵害胎兒，引起流產或出生犢牛先天性缺陷，最常見的缺陷是小腦發(fā)育不全，患犢呈現(xiàn)程度不同的共濟失調或不能起立，角弓反張，眼球震顫等神經癥狀。

2.2慢性型

沒有明顯的發(fā)熱癥狀，但也有少數(shù)病例體溫高于正常。鼻鏡糜爛，常連成一片。眼內有漿液性分泌物?？谇缓苌儆忻訝€，門齒通常發(fā)紅。因蹄葉炎及趾間皮膚糜爛壞死而有明顯的跛行癥狀。皮膚常成皮屑狀，在髻甲、頸部和耳后最明顯，并可見間歇性腹瀉。

3　病理變化

病毒經血流散布于病牛全身，侵害消化道所有上皮細胞及皮膚、黏膜，導致這些部位發(fā)生病變。特征性的損害是食道黏膜糜爛。鼻鏡、鼻孔有糜爛及淺潰瘍。齒銀、上腭、舌面兩側及頰黏膜也有糜爛。重癥病例在咽喉頭黏膜有潰病及彌散性壞死。消化道有卡他性、出血性、潰瘍性以至壞死等不同程度的炎癥。流產胎兒的口腔、食道、真胃及氣管內有出血斑及潰瘍。運動失調的犢牛，可見到小腦發(fā)育不全及兩側腦室積水。蹄部趾間皮膚及全蹄冠有急性糜爛炎癥、潰瘍和壞死。

組織學變化可見上皮細胞變性為基本病理變化。鱗狀上皮細胞發(fā)生空胞變性、腫脹、壞死。真胃黏膜的腺上皮細胞壞死，腺腔出血和擴張。黏膜的固有層和黏膜下水腫，并有白細胞浸潤和出血。小腸淋巴小結病變最明顯，上皮細胞壞死，黏膜腺體形成囊腔，淋巴組織的生發(fā)中心壞死，成熟的淋巴細胞消失，出血明顯。

4　診斷

通過流行病學調查、臨床表現(xiàn)、病理變化等做出的臨床診斷可作為處理疫情的依據。確診須經實驗室診斷分離到病原或檢測到特異性抗原或抗體。血液是最好的病毒分離材料，也可采取病畜的骨髓、脾、淋巴結及呼吸道、眼、鼻分泌物、流產胎兒等用于分離病毒。

4.1電鏡檢查

獲得的新鮮病料或細胞培養(yǎng)物可直接用負染法，在電鏡下觀察病毒粒子的特征。也可制作超薄切片標本后檢查，病毒粒子存在于胞漿、空泡和擴張的內質網池內，形態(tài)比較規(guī)整。

4.2中和試驗

病毒中和試驗（Neutralizationtest，NT）是用牛睪丸或犢牛腎細胞培養(yǎng)的病毒與被檢血清作用后再接種牛睪丸或犢牛腎細胞，觀察細胞病變情況，是進行BVDV流行病學調查的有效手段。用雙份血清（間隔3～4周）倍比稀釋后進行中和試驗，滴度升高4倍以上判為陽性，本法既可以定性，又可用來定量，而且重復性好，是常用的實驗室檢測方法。但由于許多持續(xù)性感染動物處于免疫耐受狀態(tài)，雖然體內不產生抗體，卻可終生帶毒、排毒，因而，僅憑檢查抗體難以查出這部分傳染源。

4.3瓊脂擴散試驗

存在于病畜腸黏膜、腸系膜淋巴結、胰腺及其他病變組織中的沉淀抗原，可用瓊脂擴散試驗檢出。選取發(fā)炎或糜爛和潰瘍周圍的黏膜，不經任何處理，直接與陽性血清進行瓊脂擴散試驗。約有60%的病牛呈現(xiàn)陽性反應。

4.4免疫熒光染色

免疫熒光技術 （immunofluorescencetechnique，IFT）通過顯微鏡標本的免疫熒光染色而顯示其結果，它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術發(fā)展的基礎上建立起的一項技術，把免疫學的特異性、敏感性和顯微鏡的精確性有機結合起來，從而成為廣泛應用的免疫學技術。應用熒光抗體技術（用直接法）可以檢測感染細胞培養(yǎng)物以及病變組織冰凍切片中的病毒抗原。熒光顆粒出現(xiàn)于胞漿中，并可應用未標記抗體進行熒光抑制試驗作進一步鑒定。此法特異、敏感、快速。

4.5雙抗體夾心ELISA

雙抗體夾心 ELISA是通過檢測病料和糞便中的病毒抗原來檢測動物是否感染BVDV，該方法操作簡便、費用低，可用于大批量樣本的檢疫，更重要的是它能從病料中檢出持續(xù)性感染的動物，所以該方法非常適用于臨床的診斷和檢疫。

本崗位建立了雙抗體夾心斑點酶聯(lián)免疫吸附法 （Dot-ELISA）和間接 Dot-ELISA法，并應用建立的方法對78份腹瀉奶牛血樣檢測，結果BVDV陽性檢出率分別為57.69%、55.13%，而AGP法的陽性檢出率是34.62%。經檢驗分析，建立的方法與AGP法相比較，陽性檢出率差異顯著。證實這兩種方法檢出率高、具有高度敏感性和特異性，只需要3～4小時即可得出結果，且結果判斷直觀，適用于基層單位對BVDV的檢測和流行病學調查。

4.6核酸探針雜交試驗

可用光敏生物素標記制備的BVDV核酸探針。直接檢測細胞和臟器組織中BVDV，是高度特異和靈敏的方法。

4.7RT-PCR診斷

根據BVDV基因組序列合成一對或數(shù)對引物，應用RT-PCR診斷技術可檢測器官、組織、培養(yǎng)細胞中的BVDV。該法具有高度特異性和靈敏性，不僅具有可測定BVDV核酸序列的優(yōu)點，即使BVDV被滅活，仍可用該方法檢測。

5　防治技術

防治本病應采取綜合措施。沒有特效療法，但可進行輔助療法。加強飼養(yǎng)衛(wèi)生管理，防止本病的傳播。嚴格檢疫隔離和門禁制度，防止該病的傳播。

5.1養(yǎng)殖環(huán)境衛(wèi)生與消毒

定期對奶牛舍及其周圍環(huán)境進行清潔、消毒，消毒劑應選擇對人和奶牛安全、沒有殘留毒性、對設備無破壞和在奶牛體內不產生有害積累的消毒劑，選用的消毒劑應符合《中華人民共和國獸藥典》及相關法規(guī)的規(guī)定。

保證有充足的飲水，水質應符合畜禽飲用水衛(wèi)生要求。定期清洗消毒飲水設備。消毒劑應符合《中華人民共和國獸藥典》及相關法規(guī)的規(guī)定。

發(fā)病后，流產胎兒及其他排泄物，污染場地均需進行嚴格消毒處理。對死于該病的和可疑的動物尸體嚴格處理，防止污染環(huán)境，散布病原。

5.2免疫接種

在6～10月齡、初乳免疫力消失時接種疫苗，減毒活疫苗及滅活疫苗均可提供有效的保護，應嚴格遵守生產廠家推薦的使用方法和接種計劃。滅活疫苗更為安全。

5.3治療

本病尚無特效療法，可進行對癥治療。使用收斂劑和補液療法可縮短恢復期，減少損失。及時使用抗生素，以避免或減少繼發(fā)性細菌感染。

建立并保存治療記錄。包括發(fā)病時間及癥狀，治療用藥的商品名稱和有效成分，生產廠家及生產日期，治療時間、劑量、療程、療效及停藥時間。記錄應保存兩年以上。