桑葉多糖的含量影響因素與提取檢測方法

趙東曉　董亞茹　杜建勛　陳傳杰　梁明芝　王照紅

(山東省蠶業(yè)研究所,山東煙臺 264002)

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桑葉多糖的含量影響因素與提取檢測方法

趙東曉董亞茹杜建勛陳傳杰梁明芝王照紅*

(山東省蠶業(yè)研究所,山東煙臺 264002)

桑葉多糖是桑葉活性物質(zhì)的一種，因其具有降血脂、降血糖、抗衰老、抗氧化、增強免疫力等多種藥理作用，在醫(yī)藥、食品和保健品等行業(yè)有較高的開發(fā)利用價值，近年來備受人們關(guān)注。本文概述了桑葉多糖含量的影響因素，介紹了熱水浸提法、微波提取法、超聲波提取法等5種檢測方法及其研究進(jìn)展。

桑葉多糖含量檢測方法

桑葉，為?？?Moraceae)桑屬植物桑(Morus alba L.)的葉[1]。因其具有疏風(fēng)散熱，潤燥清肺，清肝明目的作用，較廣泛的用于治療風(fēng)熱感冒，頭暈頭痛，肺熱燥咳，目赤昏花[2]。很多研究表明桑葉具有顯著的降血糖功能[3]，現(xiàn)代藥理研究證明桑葉可以抑制血糖上升，因此可以預(yù)防和治療糖尿病[4-7]。桑葉的主要有效成分有黃酮類、生物堿、植物甾醇、γ-氨基丁酸、桑葉多糖等。筆者就桑葉多糖含量的影響因素及其檢測方法作一綜述。

1　桑葉多糖的功能

桑葉多糖是桑葉中的主要活性物質(zhì)之一。近年來人們對桑葉多糖進(jìn)行了大量集中的研究，發(fā)現(xiàn)桑葉多糖具有明顯的降血糖、降血脂和抗氧化等活性作用，并能促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)，在藥品和保健食品產(chǎn)業(yè)化開發(fā)和應(yīng)用方面具有廣闊前景。

Li Y G等[8]研究表明桑葉多糖可顯著降低糖尿病模型小鼠(四氧嘧啶誘導(dǎo))血糖。路國兵等[9]分離純化獲得桑葉多糖組分MLPⅡ，并且證明MLPⅡ能有效控制糖尿病模型大鼠的空腹血糖水平和體質(zhì)量，改善糖耐量，促進(jìn)糖尿病模型大鼠合成胰島β細(xì)胞，分泌胰島素，這有可能是桑葉多糖MLPⅡ降血糖的機制之一。邢東旭等[10]研究發(fā)現(xiàn)桑葉多糖能顯著清除化學(xué)模擬產(chǎn)生的OH-自由基,可以清除DPPH，這證明桑葉多糖具有抗氧化作用。趙駿等[11]實驗表明，桑葉多糖可以顯著降低糖尿病模型大鼠的血糖和膽固醇。桑葉多糖的藥用和保健功能使其成為近年來人們的研究熱點。

2　桑葉多糖含量影響因素

桑葉多糖的含量與桑品種、產(chǎn)地和處理方式等都有顯著的相關(guān)性。

2.1品種

魯戰(zhàn)會等[12]研究發(fā)現(xiàn)廣東桑和魯桑選792的桑葉多糖含量較高，比其他品種高10倍以上。同一產(chǎn)地的廣東桑品種的桑葉多糖含量高于湘7920、富鈷11- 6、農(nóng)桑14、桐鄉(xiāng)青等其它品種。廖森泰等[13]測定了廣東桑、魯桑、白桑的14個代表性桑品種桑葉多糖含量，結(jié)果表明廣東桑的桑葉多糖含量總體比魯桑種、白桑種高。在68個代表性廣東桑品種之間，桑葉多糖含量存在顯著差異，含量最高和最低的分別為曲馬2號和抗誘2號。多倍體桑樹品種的桑葉多糖含量總體上高于二倍體桑樹品種。林天寶等[14]測定了農(nóng)桑14號、強桑1號和豐田2號三個桑品種粗多糖含量，含量由高到低分別為農(nóng)桑14號、強桑1號、豐田2號。

2.2產(chǎn)地

桑葉多糖含量與產(chǎn)地具有密切的相關(guān)性。魯戰(zhàn)會等[12]認(rèn)為在北緯32°52'～36°24'，年平均氣溫12.5～14.5℃，年平均降水量626.8～1031.1mm，桑葉的多糖含量較高。

2.3處理方式

即使是同一樣品，采用不同的干燥方式對桑葉多糖含量也有影響。同一樣品的多糖含量在室內(nèi)陰干處理下小于曬干處理，原因可能是陰干過程中桑葉的呼吸消耗[12]。

3　桑葉多糖檢測方法

桑葉多糖的提取和分離一般采用熱水浸提法、微波提取法、超聲波法、酶解提取法及超高壓法等處理方法。

3.1熱水浸提法

熱水浸提法在桑葉多糖提取中應(yīng)用最廣，是桑葉多糖提取最為傳統(tǒng)的方法。桑葉多糖熱水浸提法一般是桑葉經(jīng)超微干燥粉碎后，經(jīng)過適量蒸餾水一定時間的恒溫提取，再離心(或過濾)、蒸發(fā)、脫蛋白、無水乙醇沉淀、真空干燥，最后得到桑葉多糖[15]。

現(xiàn)階段國內(nèi)外針對桑葉多糖熱水浸提法的研究主要集中在摸索提取條件，提高提取效率等方面。劉詠[16]通過正交試驗確定了桑葉多糖提取的最優(yōu)條件為水浴100℃、料液比為1∶100(w/v)、浸提時間1 h、pH 4,測得提取到桑葉多糖達(dá)98.52 mg/g。黃山等[17]優(yōu)化熱水浸提工藝為料液比1∶25(g/mL),在pH為8的條件下，水浸泡30 min后100℃加熱提取120 min，桑葉多糖回收率為3.58%。丁銳[18]研究表明,熱水浸提法提取桑葉多糖的較優(yōu)條件為水溫80℃、浸提1.5 h、料液比1∶40(g/mL),提取桑葉多糖得率約為11.3%。趙俊等[19]用水浸提1 h,浸提2次,加乙醇，使醇含量達(dá)80%,桑葉多糖回收率為2.51%。劉樹興等[20]實驗得到提取桑葉多糖的最優(yōu)化條件為100℃水浴、pH 1l、料液比1∶50(w/v)、浸提時間2 h,提取率可達(dá)90.5%。沈愛英等[21]研究表明，料液比1∶25(w/v)，經(jīng)過75℃水浴中提取2次,抽提1 h，提取液用80%乙醇醇析，桑葉多糖提取率為2.51%。張琳華等[22]的研究結(jié)果表明桑葉多糖的最佳提取工藝為用10倍的蒸餾水在pH 4，7、0℃下提取2次,每次抽提1.5 h。蓋英萍等[23]優(yōu)化熱水浸提工藝為：提取溫度80℃，桑葉粉的質(zhì)量濃度為0.100 g/mL，提取時間60 min，提取3次。應(yīng)芝等[24]利用響應(yīng)面分析法(RSM)優(yōu)化了桑葉多糖的提取工藝，得出桑葉多糖的最佳提取條件為料液比1∶17(w/v)，在77℃下提取85 min，提取2次，測得桑葉多糖得率為4.67%。邢東旭等[25]優(yōu)化熱水浸提條件為:提取90 min，溫度85℃，料液質(zhì)量比1∶45，pH 7.5。

3.2微波提取法

微波提取法主要是用微波處理溶劑，微波穿過細(xì)胞壁達(dá)到細(xì)胞內(nèi)部，瞬間增加細(xì)胞內(nèi)溫度和壓力。不斷增強的壓力使細(xì)胞壁破裂，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的多糖等物質(zhì)便釋放到細(xì)胞外的溶劑中，溶解于溶劑。微波技術(shù)能有效提高目的物的回收率，近年來在天然產(chǎn)物提取研究中被廣泛應(yīng)用。王尉等[26]用微波輔助法提取桑葉多糖,結(jié)果表明微波輔助提取桑葉多糖的優(yōu)化條件為溫度88℃、時間11 min、液固比18∶1,提取的多糖含量為15.20 mg/g,微波輔助提取的桑葉多糖含量分別比傳統(tǒng)熱水浸提法提取10 min時高2.18倍，比60 min時高0.23倍，極大的縮短了提取時間，提高了提取物純度。黃山等[17]試驗獲得微波法提取桑葉多糖的最佳工藝條件為：料液比1∶25(w/v)，溶劑pH8.0，微波功率300 W，處理10 min，多糖得率為4.26%，比熱水浸提法提高了18.99%。邢東旭等[25]提出的微波法提取桑葉多糖的最佳工藝為:微波功率320W，提取10 min，料液比1∶45(w/v)。

3.3超聲波提取法

超聲波作用于細(xì)胞，可以產(chǎn)生強烈、高速的空化效應(yīng)及攪拌作用。超聲波提取法的原理就是利用這個作用破壞植物細(xì)胞的細(xì)胞膜，加速細(xì)胞內(nèi)有效活性成分的釋放與溶出。與傳統(tǒng)的提取法相比，超聲波提取法提取效率高，提取速度快，因此具有廣闊的應(yīng)用前景。

目前人們通常將超聲波提取與熱水浸提法結(jié)合起來用于桑葉多糖提取，稱為超聲波輔助法。趙俊等[19]研究發(fā)現(xiàn)，超聲波提取多糖的提取效率明顯高于熱水浸提法,并且耗時短、提取次數(shù)少。劉學(xué)軍等[27]優(yōu)化超聲波提取桑葉多糖工藝條件為超聲波功率50 W,提取溫度85℃,超聲波時間2.5 h,原料粒徑80目,提取率10.47%。王豐俊等[28]研究結(jié)果表明超聲波輔助法的較優(yōu)工藝條件為: 超聲波功100 W，提取溫度81.5℃，超聲波處理0.5 h，水料比10∶1，桑葉多糖的提取率為2.99%。凌慶枝等[29]研究得到的提取條件為超聲波功率200 W下提取20 min，pH 9.0，料液比1∶15，提取2次，桑葉多糖提取率為2.07%。楊青珍等[30]建立的龍桑葉多糖的超聲輔助提取優(yōu)化提取工藝為：溫度70℃，水浴浸提2 h，超聲波提取20 min，料液比1∶40，提取率超過1.00%。并且發(fā)現(xiàn)對桑葉多糖提取效率影響由大到小依次為：溫度>料液比>浸提時間>超聲波處理時間。

3.4酶解提取法

酶具有專一、高效等特點，酶解法提取桑葉多糖正是利用這一特點快速消除植物細(xì)胞壁、蛋白質(zhì)、纖維素等，釋放桑葉多糖類物質(zhì)。該方法操作條件溫和，提取過程使桑葉多糖的生物活性得到保護(hù)，是一種具有較大潛力的桑葉多糖提取方法。但目前關(guān)于桑葉多糖酶提取法的報道較少，相關(guān)問題仍需進(jìn)一步研究和研討。依據(jù)酶的使用情況，酶解法可以分為單酶提取法和復(fù)合酶提取法?，F(xiàn)階段提取植物多糖常用的酶主要有木瓜蛋白酶、纖維素酶、果膠酶等。

王芳等[31]研究了在超聲波法、酶解法和微波法下桑葉多糖的提取效率，桑葉多糖提取效率由高到低依次為酶解法、超聲波法、微波法，其中纖維素酶為桑葉多糖的最佳提取酶，最佳方案為酶量為桑葉量的1.5%,50℃下酶解2 h,處理后水提多糖得率可達(dá)12.49%。夏平等[32]用纖維素酶和果膠酶(1∶1)提取桑葉多糖。實驗結(jié)果表明，酶解法的最佳條件為酶用量1.0%，在溫度50℃、pH4.5下，提取1 h，桑葉多糖提取率達(dá)14.32%。

3.5超高壓提取法

超高壓提取(UHPE)技術(shù)是在常溫下提取天然產(chǎn)物有效成分的一項新技術(shù)。其原理是料液在加壓裝置下經(jīng)過加壓、保壓、迅速卸壓，使得細(xì)胞內(nèi)壓力快速變化，細(xì)胞壁受壓破裂，內(nèi)含物釋放，從而達(dá)到萃取目的。凌慶枝等[29]實驗得出超高壓法提取桑葉多糖的最佳條件是在壓力300 MPa，pH9.0下，處理4.5 min，固液比1∶16，桑葉多糖提取率2.23%。和熱水浸提法和超聲提取法相比，超高壓提取法提取時間短、多糖提取率高，是提取桑葉多糖較為適宜的方法。

4　結(jié)語

由于我國桑資源豐富，且地理位置和環(huán)境氣候影響較大，桑葉多糖在不同品種之間的含量差異一直未有一個系統(tǒng)全面的檢測。目前廣泛認(rèn)為不同季節(jié)，尤其霜降之后桑葉內(nèi)生物活性物質(zhì)的含量和功效都有提高，但是仍未見到桑葉多糖含量和功效是否受季節(jié)影響的報道。

桑葉多糖在目前?；钚猿煞值难芯恐休^為多見，因此能否快速、準(zhǔn)確的提取和檢測是繼續(xù)深入研究的關(guān)鍵，因此如何進(jìn)一步完善桑葉多糖的提取和檢測方法是今后研究的方向之一。熱水浸提法作為傳統(tǒng)的桑葉多糖提取方法，目前被普遍采用，原因在于這種方法操作簡單，對提取設(shè)備要求低。但同時也存在諸多缺點，如多糖回收率易受料液比、提取溫度、提取次數(shù)、提取時間及桑葉粉碎程度等因素影響，且多糖的生物活性也很容易受提取時間和溫度影響，導(dǎo)致多糖回收率低。超聲波輔助法提取桑葉多糖得率最高，并且還有操作時間短，無污染的優(yōu)點，因此適合工業(yè)生產(chǎn)，在工業(yè)化提取桑葉多糖方面具有廣闊的應(yīng)用前景。微波法提取桑葉多糖，不僅安全、高效、節(jié)能，而且設(shè)備簡單易得，適用范圍廣，無噪音污染，同時微波快速產(chǎn)生的高溫可以滅活細(xì)胞內(nèi)的酶，有效減少目的物降解，是一種極具發(fā)展?jié)摿Φ男滦吞崛〖夹g(shù)。相信隨著桑葉多糖提取技術(shù)的不斷發(fā)展完善，桑葉多糖的提取及利用將會更加便捷、高效、安全。

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Influencing Factors and Extraction and Detection Method of Polysaccharide Content in Mulberry Leaf

ZHAO Dongxiao，DONG Yaru，DU Jianxun，CHEN Chuanjie，LIANG Mingzhi，WANG Zhaohong*

(Shandong Provincial Sericultural Research Institute, 264002, Yantai ,Shandong ,China)

Polysaccharide is one of the active substances in mulberry leaves, because it has a variety of pharmacological effects such as reducing blood lipid, blood sugar, anti-aging, anti-oxidation and immunity.It has high exploitation and utilization value in medicine, food and health food industries, hence receiving many concerns in recent years.This paper reviews the factors affecting the polysaccharide content in mulberry leaves, and introduced five detection methods such as hot water extraction, microwave extraction and ultrasonic wave extraction, and the progress of it as well.

mulberry leaf; polysaccharide; content; detection method

趙東曉(1985-)，女，碩士，助理研究員，從事桑樹生化與分子生物學(xué)研究。

王照紅(1969-)，男，研究員。E-mail:wzh1788@163.com