張雷鳴 徐嬌 劉振鵬 任偉超 馬偉

(北安市第一人民醫(yī)院，北安，164000) (黑龍江中醫(yī)藥大學)

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人參黑斑病拮抗菌的篩選1)

張雷鳴 徐嬌 劉振鵬 任偉超 馬偉

(北安市第一人民醫(yī)院，北安，164000) (黑龍江中醫(yī)藥大學)

通過與人參黑斑病(AlternariapanaxWhetz)病原真菌對峙培養(yǎng)的方法，從由人參葉片分離得到的18種內生真菌中，篩選出Ab2.2①、AY10-1①、AXY②3種人參黑斑病拮抗菌，其抑菌率分別為70.9%、75.6%、77.5%，2種毛殼屬(ChaetomiumKunze)真菌As①、As②的抑菌率分別為56.4%、62.4%。

人參；內生真菌；生物防治；人參黑斑??；人參病害

Biocontrol fungi against ginseng black spot pathogen were selected from 18 stains of endophytic fungi isolated from ginseng leaves by using plate-confrontation method. Ab2.2①, AY10-1① and AXY② bacteriostasis rates were 70.9%, 75.6%, and 77.5% respectively, and the rates of theChaetomiumfungi As①, and As② were 56.4%, and 62.4%, respectively.

人參黑斑病屬于傳染較為嚴重的病害，發(fā)病率一般在30%左右，嚴重的可達70%以上，影響人參參根的產(chǎn)量以及種子的收獲，造成減產(chǎn)和參籽干癟，是我國東北及河北等地，流行性很高的一種病害。在參齡達到3年以上的參場，也均可受到較為嚴重的侵害[1]。對于人參黑斑病的微生物防治近年來研究者較多，以吉林農業(yè)大學的研究者為眾。但目前的研究僅停留于試驗研究階段，未見微生物及微生物源農藥在人參黑斑病實際生產(chǎn)中得以應用的報道。微生物的選擇來源于人參內生菌、根際土壤微生物及其它微生物。李勇等[2]從人參根中分離內生細菌，得到2株對于人參黑斑病有明顯抑制作用的菌種，且對人參菌核病和銹腐病同樣有明顯作用，可作為生防菌進一步研究。賈斌等[3]從人參等多種中藥材根莖葉中，分離對于人參黑斑病具有拮抗作用的內生細菌，發(fā)現(xiàn)從人參根中的得到的拮抗菌株最多，其中的1株解淀粉芽孢桿菌細菌，對于人參黑斑病的抑菌率為80%，抑菌作用明顯。李鵬翔[4]采集人參種植區(qū)土樣，分離的113株菌種，其中的1株芽孢桿菌屬細菌對于人參黑斑病的抑菌效果良好。強薇等[5]從人參根際土壤分離出的1株放線菌和1株木霉菌，對于人參黑斑病有明顯的高拮抗活性，拮抗率分別為71.33%、71.76%。王玲[6]采用益生菌EM發(fā)酵玉米秸稈產(chǎn)物，施入?yún)⑻铮軌驅θ藚⒑诎卟∵M行良好的防治，降低了其發(fā)病率以及病情指數(shù)。吳長寶等[7]研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌菌懸液對于人參黑斑病有較好的抑菌效果，較其發(fā)酵液效果明顯，抑菌圈直徑為16 mm，抑菌率為68.75%。大量文獻表明，對于人參內生真菌的分離部位多為參根以及根際土壤，對于人參黑斑病侵害較為嚴重的葉片部位的內生真菌的分離，少有報道。因此，本試驗僅僅針對人參葉片部位分離的18種內生真菌，對于人參黑斑病的拮抗作用進行篩選，以其得到較為理想的生物防治菌株。

1 材料與方法

1.1 供試材料

致病菌：人參黑斑病病原真菌(AlternariapanaxWhetz)，由吉林農業(yè)大學提供。

拮抗菌株：由人參葉片提取分離得到的18種人參內生真菌。

1.2 拮抗菌株的篩選

將于-4 ℃ PDA斜面保存的人參黑斑病病原真菌活化，接種于9 cm的PDA平板，經(jīng)過分離純化，培養(yǎng)至菌落長滿整個平板。

將從人參葉片中分離得到的內生真菌，接種于9 cm的PDA平板，不同的菌株生長速度不同，以每種菌株長滿平板為標準。

試驗組：采用對峙培養(yǎng)方法，9 cm的PDA平板，中心畫十字線，選取十字線中的一條，在距離中心2 cm處各選取一點，其中一點接種上述培養(yǎng)方式培養(yǎng)的人參黑斑病病原真菌，另外一點接種人參葉片內生真菌。接種的人參黑斑病病原真菌和人參葉片內生真菌均為用7 mm打孔器打孔得到的菌餅，帶菌面朝向PDA培養(yǎng)基接種。每種拮抗菌設置3個重復。每天觀察、測量人參黑斑病病原真菌生長半徑，直至對照組黑斑病病原菌長滿整個平板為止，根據(jù)抑菌率計算公式，計算抑菌率。抑菌率=((對照菌絲半徑-處理菌絲半徑)/(對照菌絲半徑-菌餅半徑))×100%。

對照組：只接種人參黑斑病病原真菌，設置3個重復，每天觀察、測量生長半徑，繪制對照組與試驗組中黑斑病病原菌的生長曲線。

每個試驗組和對照組所選的黑斑病病原真菌菌餅均為同質同量，選取位置為長滿平板的黑斑病病原真菌菌落的邊緣。培養(yǎng)條件均為28 ℃，恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，分為初篩和復篩兩部分。

數(shù)據(jù)處理：通過Excel軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理，處理方法兩組間比較采用獨立樣本t檢驗法，設定P<0.05為顯著性水平，P<0.01為極顯著性水平。

2 結果與分析

2.1 內生真菌的拮抗作用

經(jīng)抑菌試驗，由表1抑菌率可知，AXY②、AY10-1①、Ab2.2①、As②、As①這5種內生真菌對黑斑病有較強的抑菌作用，其中，AXY②、AY10-1①、Ab2.2①內生真菌的抑菌率達到70%以上，AXY②的抑菌率最高，為77.5%。As②、As①為毛殼屬真菌，該屬真菌，目前應用于生物防治研究上較為廣泛，有較高的生物防治研究價值和潛力。

表1 人參葉片內生真菌對人參黑斑病病原真菌的拮抗作用(n=3，拮抗試驗第7天)

內生真菌黑斑病病原真菌半徑/cm抑菌率/%Ab2.2①0.9770.9aAY10-1①0.8775.6bBY③1.2355.7cAY①2.0122.1dAXY②0.8377.5eB1.1①1.4349.3fB1.1②1.5444.1gB1.1③1.3354.0hB3.2①1.6041.3iAs①1.3056.4jAs②1.1562.4k對照組2.48

注：抑菌率中同列數(shù)據(jù)后字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 高抑菌率拮抗菌對黑斑病病原真菌生長的影響

由表1篩選出AXY②、AY10-1①、Ab2.2①、As②、As①，這5株拮抗效果較好的內生真菌，進一步的對峙培養(yǎng)表明，這5株內生真菌對黑病菌病原真菌有較好的抑制作用。其中Ab2.2①、AY10-1①、AXY②對黑斑病病原真菌的拮抗作用相當，無明顯差異，AY10-1①和AXY②的病原菌生長曲線幾乎重合。Ab2.2①、AY10-1①、AXY②三者的拮抗作用強于As①、As②。

2.2.1 內生真菌Ab2.2①

黑斑病菌落起初的生長呈緩慢的上升趨勢，從第6天開始上升趨勢增高，到第8天菌落停止生長，呈平臺期。第8天時，Ab2.2①和黑斑病原菌菌落邊緣開始接觸，導致黑斑病病原菌停止生長，而Ab2.2①繼續(xù)生長，分布在黑斑病病原菌的菌落表面上，猜想其拮抗機制，在生長初期是Ab2.2①真菌本身分泌的拮抗物質致使黑斑病的生長受到抑制，中期拮抗能力減弱，后期(生長平臺期)是由于真菌本身的拮抗物質以及真菌對于病原菌的重寄生作用同時作用，產(chǎn)生拮抗作用。同時黑斑病病原真菌對于Ab2.2①的生長也有一定的拮抗作用，試驗組的Ab2.2①的生長速度低于Ab2.2①本身生長速度，且試驗組中Ab2.2①的拮抗面的菌落逐漸變薄，菌絲生長受到抑制變性。

2.2.2 內生真菌AY10-1①

試驗組中黑斑病菌落生長初期在0～3 d緩慢增長，4～6 d處于平臺期，在第7天以后，菌落生長速度變快，生長曲線呈上升趨勢。試驗組中病原菌和拮抗菌菌落在生長過程中，二者之間一直存在一定的寬度，在二者停止生長時，此寬度為0.8 cm，猜想AY10-1①其拮抗機制為真菌本身產(chǎn)生的活性物質，對于黑斑病的生長產(chǎn)生抑制作用。同時黑斑病病原真菌對于AY10-1①的生長也有較強的抑菌作用，二者屬于相互競爭、相互拮抗的關系。

2.2.3 內生真菌AXY②

試驗組中黑斑病菌落生長整體呈上升趨勢，與AY10-1①的生長趨勢相似，曲線幾乎重合，拮抗作用相當，其平臺期在第6～7天，起穩(wěn)定抑菌作用的時間相對于AY10-1①較晚，持續(xù)時間較其短暫，且在第8天以后菌落生長呈明顯的上升趨勢，抑制作用減弱。但試驗組中黑斑病對于AXY②的抑制作用低于對AY10-1①的作用，AXY②與黑斑病的接觸面，菌絲生長的抑制不明顯，菌絲未見明顯的萎縮和變性。拮抗機制可能為真菌本身產(chǎn)生的活性物質以及與病原菌的空間競爭的共同作用。

2.2.4 內生真菌As①

生長初期，病原菌呈緩慢上升趨勢，但生長速度高于Ab2.2①、AY10-1①、AXY②，略高于As②，在第5天以后，生長趨勢處于平臺期，病原菌停止生長，As①與黑斑病病原真菌的接觸面，菌絲萎蔫，生長速度變得緩慢，且拮抗面周圍的培養(yǎng)基顏色由暗黃色變?yōu)辄S綠色，在后期覆蓋黑斑病病原真菌表面生長，猜想其拮抗機制為As①與黑斑病病原真菌的空間競爭以及重寄生的共同作用。

2.2.5 內生真菌As②

黑斑病病原真菌的生長趨勢與As①相同，但較As①的拮抗作用強，有明顯的差異。試驗組，黑斑病病原菌生長初期，菌落生長緩慢增長，在第4天以后，一直處于平臺期，黑斑病病原真菌停止生長。黑斑病病原真菌對于As②的生長速度幾乎無影響，As②與黑斑病病原真菌接觸后依然繼續(xù)生長，而后覆蓋黑斑病病原真菌的表面。猜想其拮抗機制為空間競爭和重寄生的協(xié)同作用。

表2 人參黑斑病病原菌生長半徑(n=3) cm

3 結論

在18株內生真菌與人參黑斑病病原真菌的拮抗試驗中，共篩選出5株抑菌率在54%以上的拮抗菌株，其中AXY②、AY10-1①、Ab2.2①的抑菌率在70%以上，AXY②的抑菌率最高，為77.5%，毛殼屬真菌As①、As②的抑菌率分別為56.4%、62.4%。

5種內生真菌AXY②、AY10-1①、Ab2.2①、As②、As①與人參黑斑病病原真菌的拮抗試驗中，由黑斑病病原真菌的生長曲線可以看出，對照組的黑斑病病原真菌生長速度明顯高于試驗組的生長速度，表明這5種內生真菌對黑斑病病原真菌有著明顯的拮抗作用，可用于生物防治菌株的研發(fā)。

[1] 王崇仁,吳友三,卜增山,等.人參黑斑病的研究I:損失調查、病原菌及發(fā)病規(guī)律[J].沈陽農業(yè)大學學報,1986,17(3):11-21.

[2] 李勇,趙東岳,丁萬隆,等.人參內生細菌的分離及拮抗菌株的篩選[J].中國中藥雜志,2012,37(11):1532-1535.

[3] 賈斌,趙貞麗,沈國娟,等.人參黑斑病生防用內生拮抗菌分離鑒定及發(fā)酵濃縮液的性質[J].中國森林病蟲，2014,33(3):5-10,17.

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[5] 強薇,郭帥,張愛華,等.人參根際土壤中拮抗人參病害微生物的篩選[J].華南農業(yè)大學學報,2014,35(5):76-81.

[6] 王玲.EM菌發(fā)酵玉米秸桿條件優(yōu)化及對人參黑斑病影響研究[D].長春:吉林農業(yè)大學,2012:17-18.

[7] 吳長寶,回云靜,徐小明,等.枯草芽孢桿菌生物菌劑對人參病原菌室內抑菌實驗研究[J].人參研究,2010(4):11-13.

Screening Biocontrol Fungi against Ginseng Black Spot Pathogen//

Zhang Leiming; Xu Jiao, Liu Zhenpeng, Ren Weichao, Ma Wei

(Bei’an First People’s Hospital, Bei’an 164000, P. R. China)(Heilongjiang University of Chinese Medicine)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(11)：89-91.

Ginseng; Endophytic fungi; Biological control; Ginseng black spot; Ginseng disease

張雷鳴，女，1988年2月生，北安市第一人民醫(yī)院藥局，助理藥師。E-mail:229628771@qq.com。

馬偉，黑龍江中醫(yī)藥大學藥學院，教授。E-mail:88788891@qq.com。

2016年4月12日。

S476+.1

1)2013年度農業(yè)公益性行業(yè)科研專項人參產(chǎn)業(yè)技術研究與示范項目(201303111-04)。

責任編輯：程 紅。