周媛麗 葉耿坪 劉光磊

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院寵物科技學院，泰州225300； 2.上海光明荷斯坦牧業(yè)有限公司，上海200436)

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飼糧硒含量對酮病奶牛氧化應(yīng)激的緩解作用

周媛麗1葉耿坪2*劉光磊2

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院寵物科技學院，泰州225300； 2.上海光明荷斯坦牧業(yè)有限公司，上海200436)

本試驗旨在通過研究飼糧硒含量對酮病奶牛氧化應(yīng)激的緩解作用，并確定酮病奶牛對硒的最適需求量。采用完全隨機區(qū)組設(shè)計，將40頭胎次為(3.43±0.87)胎、泌乳天數(shù)為(6.33±1.14) d、體重為(644±36) kg、平均泌乳量為(38.42±4.82) kg/d、血漿β-羥丁酸(BHBA)水平為(1.50±0.26) mmol/L的荷斯坦奶牛隨機分成4組，每組10頭牛。第1組為對照組，飼喂基礎(chǔ)飼糧(硒含量為0.15 mg/kg DM)；第2、3、4組為試驗組，在基礎(chǔ)飼糧中加入亞硒酸鈉(Na2SeO3)至飼糧硒含量分別達到0.30(試驗組1)、0.45(試驗組2)和0.60 mg/kg DM(試驗組3)。試驗分為3期，每期1周。試驗每期結(jié)束后采集血樣，并在第2期結(jié)束后每組隨機選取5頭牛采集肝組織。結(jié)果表明：1)試驗組酮病奶牛全血、肝臟中硒含量，肝臟中總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)活性以及GPx1與GPx4 mRNA的相對表達水平均顯著高于對照組(P<0.05)，同時試驗組2和3還顯著高于試驗組1(P<0.05)。2)試驗組酮病奶牛肝臟中丙二醛(MDA)和過氧化氫(H2O2)含量均顯著低于對照組(P<0.05)，同時試驗組2和3還顯著低于試驗組1(P<0.05)。3)試驗組酮病奶牛血漿非酯化脂肪酸(NEFA)水平顯著低于對照組(P<0.05)，但血漿葡萄糖和BHBA水平與對照組相比無顯著差異(P>0.05)。4)飼糧硒含量為0.45和0.60 mg/kg DM時，酮病奶牛全血和肝臟中硒含量、肝臟抗氧化指標和血漿能量代謝指標均無顯著差異(P>0.05)。由此得出，飼糧硒含量為0.45 mg/kg DM時可顯著改善酮病奶牛機體的抗氧化能力。

酮病奶牛；硒；抗氧化；肝組織；氧化應(yīng)激

酮病是奶牛產(chǎn)后發(fā)病率最高的營養(yǎng)代謝性疾病，為彌補能量赤字，奶牛機體發(fā)生脂肪動員產(chǎn)生非酯化脂肪酸(NEFA)，NEFA不完全氧化轉(zhuǎn)化為酮體，后者超過機體分解能力時就蓄積于體內(nèi)，當血液中的β-羥丁酸(BHBA)水平達到1.2 mmol/L時就判定為酮病，酮病能損害奶牛機體的防御系統(tǒng)，影響奶牛的免疫反應(yīng)，降低抗病能力[1-4]。肝臟中NEFA的氧化作用加強，導致了活性氧族(ROS)的增多，促進了氧化應(yīng)激的發(fā)生[5]，氧化應(yīng)激可導致奶牛機體功能紊亂，從而影響奶牛的生產(chǎn)性能[6-7]。硒(Se)是重要的食源性微量元素，主要功能是作為谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)的組成成分，而GPx具有抗氧化功能，通過催化還原型谷胱甘肽把體內(nèi)有害過氧化物還原為無害的羥基化合物，從而保護細胞的結(jié)構(gòu)和正常功能免受過氧化物的損害[8-11]。本試驗旨在通過研究飼糧硒含量對酮病奶牛氧化應(yīng)激的緩解作用及其機制，為硒在改善奶牛產(chǎn)后機體健康及生產(chǎn)性能的廣泛應(yīng)用提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及飼養(yǎng)管理

試驗動物：胎次為(3.43±0.87)胎、泌乳天數(shù)為(6.33±1.14) d、體重為(644±36) kg、平均泌乳量為(38.42±4.82) kg/d、血漿BHBA水平為(1.50±0.26) mmol/L的荷斯坦奶牛。

飼養(yǎng)管理：雙列對尾栓系式飼養(yǎng)，自由飲水。試驗參照NRC(2001)奶牛營養(yǎng)需要并結(jié)合生產(chǎn)實踐統(tǒng)一配制基礎(chǔ)飼糧(表1)[12]，每日飼喂3次(07:00、14:00和21:00)，每個飼喂點采用管道式擠奶設(shè)備擠奶1次。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計

試驗采用完全隨機區(qū)組設(shè)計，將40頭荷斯坦奶牛根據(jù)其血漿BHBA水平、體況評分、泌乳量、胎次和泌乳天數(shù)隨機分成對照組和試驗組1、2、3，每組5個重復，每個重復2頭牛(分組信息見表2)。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧(飼糧硒含量為0.15 mg/kg DM)，試驗組1、2、3在基礎(chǔ)飼糧中加入亞硒酸鈉(Na2SeO3)至飼糧硒含量分別達0.30、0.45和0.60 mg/kg DM。試驗分為3期，每期1周。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

續(xù)表1項目Items含量Content合計Total100.00營養(yǎng)水平Nutrientlevels2)泌乳凈能NEL/(MJ/kg)7.03粗蛋白質(zhì)CP17.20中性洗滌纖維NDF33.80酸性洗滌纖維ADF20.50粗灰分Ash5.35鈣Ca1.02磷P0.46鎂Mg0.39鉀K1.27鈉Na0.43

1)每千克預混料含有One kg of premix contains the following：VA 1 200 000 IU，VD 450 000 IU，VE 8 000 IU，Mn 3 000 mg，Zn 1 500 mg，F(xiàn)e 1 500 mg，Cu 500 mg，I 85 mg，Co 35 mg，Se 10 mg。

2)泌乳凈能為計算值，數(shù)值來源于NRC(2001)，其他為檢測值，由上海光明荷斯坦牧業(yè)有限公司檢測中心檢測。粗蛋白質(zhì)、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、粗灰分、鈣、磷、鎂、鉀和鈉含量分別采用GB/T 6432—1994、GB/T 20806—2006、NY/T 1459—2007、GB/T 6438—2007、GB/T 6436—2002、GB/T 6437—2002、GB/T 13884—2003、GB/T 13885—2003和GB/T 13885—2003方法檢測。NELis a calculated value from NRC (2001), while the others are measured values that detected by Test Center ofShanghaiBright Holstan Co., Ltd. The contents of CP, NDF, ADF, ash, Ca, P, Mg, K and Na were detected by the methods of GB/T 6432—1994, GB/T 20806—2006, NY/T 1459—2007, GB/T 6438—2007, GB/T 6436—2002, GB/T 6437—2002, GB/T 13884—2003, GB/T 13885—2003 and GB/T 13885—2003, respectively.

1.2.2 樣品采集與處理

于每期試驗結(jié)束當天晨飼前1 h，用10 mL肝素鈉抗凝真空采血管尾靜脈采血，取3 mL抗凝全血-20 ℃保存以測定全血中硒含量，剩余抗凝血4 ℃、1 000×g離心10 min，分離血漿并于-20 ℃保存，用于血漿中葡萄糖、BHBA和NEFA水平的測定。

試驗第2期結(jié)束當天從每組中隨機挑選5頭牛采集肝組織樣品，參照葉耿坪[13]的方法進行樣品處理，樣品用于測定肝臟中硒含量、抗氧化指標[總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、過氧化氫(H2O2)含量和GPx活性]以及GPx1和GPx4 mRNA的表達。

表2 試驗牛分組信息

同行數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同 。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

1.2.3 樣品分析

全血和肝臟中硒含量的檢測參照吳顯實[14]的試驗方法。

血漿中葡萄糖、BHBA和NEFA水平，以及肝臟中H2O2含量、T-AOC、GPx活性、SOD活性、MDA含量的檢測均按照南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒操作說明進行(試劑盒編號依次為F006、H169、A042、A064、A015、A005、A001和A003)，均采用分光光度法進行檢測。

肝臟中GPx1和GPx4 mRNA的表達采用實時熒光定量PCR檢測，以β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參基因，采用2-△△CT方法分析目的基因的相對表達水平，具體操作參照葉耿坪[13]試驗中肝組織基因表達的研究方法進行，所用引物序列見表3。

表3 實時熒光定量PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用SAS 9.2的Mixed模型進行Compound Symmetry Covariance Structure分析，以Duncan氏法進行多重比較，結(jié)果以平均值±標準差(mean±SD)表示，判斷標準為：P<0.05表示差異顯著，0.05≤P<0.10表示具有影響趨勢。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧硒含量對酮病奶牛全血和肝臟中硒含量的影響

由表4可知，飼糧硒含量對酮病奶牛全血和肝臟中硒含量均有顯著影響(P<0.05)。與飼糧硒含量為0.15 mg/kg DM時相比，飼糧硒含量達到0.30、0.45和0.60 mg/kg DM時酮病奶牛全血和肝臟中硒含量均顯著升高(P<0.05)；飼糧硒含量為0.45和0.60 mg/kg DM時酮病奶牛全血和肝臟中硒含量無顯著性差異(P>0.05)，但均顯著高于飼糧硒含量為0.30 mg/kg DM時(P<0.05)。

2.2 飼糧硒含量對酮病奶牛血漿中能量代謝指標的影響

由表5可知，飼糧硒含量對酮病奶牛血漿中葡萄糖和BHBA水平無顯著影響(P>0.05)，但顯著影響血漿中NEFA水平(P<0.05)。與飼糧硒含量為0.15 mg/kg DM時相比，飼糧硒含量為0.45和0.60 mg/kg DM時酮病奶牛血漿中NEFA水平均顯著降低(P<0.05)，且與飼糧硒含量為0.30 mg/kg DM時相比，酮病奶牛血漿中NEFA水平均有降低趨勢(0.05≤P<0.10)。

表4 飼料硒含量對酮病奶牛全血和肝臟硒含量的影響

表5 飼糧硒含量對酮病奶牛血漿中能量代謝指標的影響

試驗組2和試驗組3的血漿NEFA水平與試驗組1相比有降低趨勢(0.05≤P<0.10)。圖1同。

There is a tendency toward lower plasma NEFA level in test groups 2 and 3 compared with test group 1 (0.05≤P<0.10). The same as Fig.1.

2.3 飼糧硒含量對酮病奶牛肝臟中抗氧化指標的影響

由表6可知，飼糧硒含量對酮病奶牛肝臟中各抗氧化指標均有顯著影響(P<0.05)。與飼糧硒含量為0.15 mg/kg DM時相比，飼糧硒含量為0.30、0.45和0.60 mg/kg DM時酮病奶牛肝臟中T-AOC均顯著升高(P<0.05)；同時，飼糧硒含量為0.45和0.60 mg/kg DM時酮病奶牛肝臟中T-AOC顯著高于飼糧硒含量為0.30 mg/kg DM時(P<0.05)。肝臟中SOD活性變化同T-AOC的變化。與飼糧硒含量為0.15 mg/kg DM時相比，酮病奶牛肝臟中MDA和H2O2含量在飼糧硒含量為0.30、0.45和0.60 mg/kg DM時均顯著下降(P<0.05)；同時，酮病奶牛肝臟中MDA和H2O2含量在飼糧硒含量為0.45和0.60 mg/kg DM時要顯著低于飼糧硒含量為0.30 mg/kg DM時(P<0.05)。與飼糧硒含量為0.15 mg/kg DM時相比，飼糧硒含量為0.30、0.45和0.60 mg/kg DM時酮病奶牛肝臟中GPx活性均顯著升高(P<0.05)；同時，飼糧硒含量為0.45和0.60 mg/kg DM時酮病奶牛肝臟中GPx活性顯著高于飼糧硒含量為0.30 mg/kg DM時(P<0.05)。飼糧硒含量為0.45和0.60 mg/kg DM時酮病奶牛肝臟中各抗氧化指標均無顯著性差異(P>0.05)。

表6 飼糧硒含量對酮病奶牛肝臟中抗氧化指標的影響

2.4 飼糧硒含量對酮病奶牛肝臟GPx1和GPx4 mRNA相對表達水平的影響

由圖1可知，與飼糧硒含量為0.15 mg/kg DM時相比，酮病奶牛飼糧硒含量達到0.30、0.45和0.60 mg/kg DM時肝臟中GPx1和GPx4 mRNA的相對表達水平均顯著增加(P<0.05)；飼糧硒含量為0.45和0.60 mg/kg DM時酮病奶牛肝臟中GPx1和GPx4 mRNA的相對表達水平無顯著差異(P>0.05)，但二者與飼糧硒含量為0.30 mg/kg DM時相比有增加的趨勢(0.05≤P<0.10)。

數(shù)據(jù)柱形標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 討 論

硒以硒半胱氨酸的形式參與到硒酶肽鏈里，且位于酶活性中心，給動物補硒能激活動物體內(nèi)自身抗氧化系統(tǒng)中的GPx，有效清除機體內(nèi)的H2O2、有機過氧化物(ROOH)、磷脂氫過氧化物和膽固醇氫過氧化物等[15-16]。酮病奶牛體脂動員產(chǎn)生的NEFA在肝臟中氧化分解，導致ROS增多，從而促進氧化應(yīng)激的發(fā)生[17]，氧化應(yīng)激可導致奶牛機體功能紊亂，進而影響奶牛的生產(chǎn)性能[6-7]。給酮病奶牛飼糧補充硒可激活機體自身抗氧化系統(tǒng)中的GPx活性及其基因的表達，促進催化還原型谷胱甘肽把體內(nèi)有害過氧化物還原為無害的羥基化合物，從而保護細胞的結(jié)構(gòu)和正常功能免受過氧化物的損害[11]。

本試驗中，在硒含量為0.15 mg/kg DM的酮病奶牛飼糧中補充硒能顯著提高全血和肝臟中硒含量，與前人得出的結(jié)論[18-19]一致，說明0.15 mg/kg DM的硒不足以滿足酮病奶牛的需求。當飼糧硒含量達到0.45 mg/kg DM時，全血和肝臟中硒含量均達到最大，再進一步添加硒達到0.60 mg/kg DM時，全血和肝臟中硒含量無顯著增加，說明0.45 mg/kg DM的硒是酮病奶牛的最大也是最適硒需求量。與飼糧硒含量為0.15 mg/kg DM時相比，飼糧硒含量為0.45 mg/kg DM時顯著提高了酮病奶牛肝臟中T-AOC、SOD活性和GSH-Px活性，顯著提高了肝臟中GPx1和GPx4 mRNA的相對表達水平，且顯著降低了肝臟中MDA和H2O2含量，充分說明在硒含量為0.15 mg/kg DM的酮病奶牛飼糧中補充硒達到0.45 mg/kg DM時能顯著提高酮病奶牛機體的抗氧化能力，同時能降低機體遭受氧化應(yīng)激的危害。許宗運等[19]也報道，飼糧硒含量為0.45 mg/kg DM時，奶牛有較好的抗氧化能力。此外，與對照組相比，飼糧中添加硒雖然對血漿中葡萄糖和BHBA水平無顯著影響，但是能顯著降低血漿中NEFA水平，可能是因為補硒減少了肝細胞遭受的氧化應(yīng)激，較好地保護了肝細胞及其正常生理功能，從而有效維持肝臟的糖異生功能或減少糖異生功能的損失，進而維持和提高糖的合成，減少脂肪動員，最終減少NEFA的生成；亦或是因為補硒減少了肝細胞的氧化應(yīng)激，從而保證了NEFA的正常代謝，促進NEFA的分解而減少了NEFA的蓄積。

4 結(jié) 論

飼糧硒含量為0.15 mg/kg DM時無法滿足酮病奶牛對硒的需求，在本試驗基礎(chǔ)飼糧中補硒使飼糧硒含量達到0.45 mg/kg DM時能顯著提高酮病奶牛的抗氧化能力，進一步增加硒含量抗氧化能力不再增加，確定0.45 mg/kg DM是酮病奶牛的最適硒需求量。

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*Corresponding author, E-mail: ygphappy@163.com

(責任編輯 菅景穎)

Mitigative Effect of Dietary Selenium Content on Oxidative Stress of Ketotic Dairy Cows

ZHOU Yuanli1YE Gengping2*LIU Guanglei2

(1.PetScienceandTechnologyCollege,JiangsuAgri-AnimalHuabandryVocationalCollege,Taizhou225300,China; 2.ShanghaiBrightHolstanCo.,Ltd.,Shanghai200436,China)

The present study was aimed to evaluate the mitigative effect of dietary selenium (Se) content on oxidative stress of ketotic dairy cows, and to confirm the Se requirement of ketotic dairy cows. Forty Holstein dairy cows with (3.43±0.87)parities, (6.33±1.14) days in lactation, body weight of (644±36) kg, average milk yield of (38.42±4.82) kg/d and plasma β-hydroxybutyrate (BHBA) level of (1.50±0.26) mmol/L were assigned to 4 groups (n=10) according to a completely randomized design. The 1st group was control group, and the dairy cows in this group were fed a basal diet (Se content was 0.15 mg/kg DM); the 2nd, 3rd and 4th group were test groups, and the dairy cows in those groups were fed the basal diet added with sodium selenite (Na2SeO3) until the Se content was 0.30 (test group 1), 0.45 (test group 2) and 0.60 mg/kg DM (test group 3), respectively. The experiment period was divided into three periods and each period had 7 days. The blood samples were collected from all cows on the last day of each period, and the hepatic tissues were collected from five cows randomly selected from each group on the last day of the 2nd period. The results showed as follows: 1) the Se content in whole blood and liver, the total antioxidant capacity (T-AOC), superoxide dismutase (SOD) activity, glutathione peroxidase (GPx) activity and the relative expression levels ofGPx1 andGPx4 mRNA in liver of ketotic dairy cows in test groups were significantly higher than those in control group (P<0.05); meanwhile, those indexes in test groups 2 and 3 were significantly higher than those in test group 1 (P<0.05). 2) The malondialdehyde (MDA) and hydrogen peroxide (H2O2) contents in liver of ketotic dairy cows in test groups were significantly lower than those in control group (P<0.05); meanwhile, those indexes in test groups 2 and 3 were significantly lower than those in test group 1 (P<0.05). 3) No significant differences were found in plasma glucose and BHBA levels between test groups and control group (P>0.05), but the plasma not fat fatty acids (NEFA) level in test groups was significantly lower than that in control group (P<0.05). 4) There were no significant difference in the Se content in whole blood and liver, liver antioxidant indexes and plasma energy metabolism indicators of ketotic dairy cows when dietary Se contents were 0.45 and 0.60 mg/kg DM (P>0.05). In conclusion, diet containing 0.45 mg/kg DM Se can significantly improve the anti-oxidation ability of ketotic dairy cows.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(12)：4029-4035]

ketotic dairy cows; Se; anti-oxidation; hepatic tissue; oxidative stress

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.12.038

2016-07-26

生鮮牛乳中潛在生物性危害因子的評估研究[滬農(nóng)科攻字(2013)第3-1號]；江蘇高校品牌專業(yè)建設(shè)工程資助項目(PPZY2015C230)

周媛麗(1987—)，女，江蘇宿遷人，助教，碩士，從事畜牧獸醫(yī)方面的科學研究與教學工作。E-mail: 1045236430@qq.com

*通信作者：葉耿坪，E-mail: ygphappy@163.com

S816

A

1006-267X(2016)12-4029-07