李中娥

南陽市食品藥品檢驗(yàn)所，河南 南陽 473061

HPLC同時(shí)測定痛經(jīng)靈顆粒中3種有效成分含量

李中娥

南陽市食品藥品檢驗(yàn)所，河南 南陽 473061

目的 建立高效液相色譜法同時(shí)測定痛經(jīng)靈顆粒中丹酚酸B、芍藥苷和羥基紅花黃色素A含量的方法，為有效控制其質(zhì)量提供可靠的方法。方法 采用Welchrom C18色譜柱，以乙腈（A）-0.1%磷酸（B）為流動(dòng)相梯度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測波長為230 nm。結(jié)果 丹酚酸B在0.197～1.316 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r＝0.999 6），平均回收率為98.72%，RSD＝1.49%；芍藥苷在0.158～1.051 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r＝0.999 8），平均回收率為99.01%，RSD＝0.92%；羥基紅花黃色素A在0.053～0.353 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r＝0.999 4），平均回收率為98.34%，RSD＝1.60%。結(jié)論 該方法簡便、靈敏、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于痛經(jīng)靈顆粒的質(zhì)量控制。

痛經(jīng)靈顆粒；丹酚酸B；芍藥苷；羥基紅花黃色素A；高效液相色譜法

痛經(jīng)靈顆粒收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)?中藥成方制劑》第十五冊(cè)，由丹參、赤芍、香附（醋制）、蒲黃、紅花、延胡索、烏藥等組成，具有活血化瘀、理氣止痛功效，臨床用于治療氣滯血瘀所致痛經(jīng)。該產(chǎn)品現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中沒有含量測定項(xiàng)[1]，無法有效控制其質(zhì)量。以往報(bào)道多以原兒茶醛或芍藥苷等單一成分作為質(zhì)控指標(biāo)[2-3]，本研究參考有關(guān)文獻(xiàn)[4-8]，對(duì)樣品處理方法和色譜分離系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化，采用高效液相色譜法（HPLC）同時(shí)對(duì)方中3味主藥的特征性活性成分丹酚酸B、芍藥苷、羥基紅花黃色素A含量進(jìn)行測定，從而在簡化檢測步驟、節(jié)約檢測資源的情況下，更好地控制該藥品的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀，配四元梯度泵、G1314F紫外檢測器；賽多利斯BP-211D電子天平；KQ-300DE型數(shù)控超聲波儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

對(duì)照品丹酚酸B（批號(hào)111562-201110，含量98.0%）、芍藥苷（批號(hào)110736-201035，含量96.5%）、羥基紅花黃色素A（批號(hào)111637-200905，含量91.8%）均購自中國食品藥品檢定研究院，乙腈（HPLC，Welch Materials Inc.），磷酸（分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠），水為重蒸餾水。痛經(jīng)靈顆粒（市售）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Welchrom C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0～12 min，12%A；12～20 min，12%A→34%A；20～30 min，34%A；30～35 min，34%A→12%A）；檢測波長：230 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)按羥基紅花黃色素A峰計(jì)算應(yīng)不低于4000，各峰之間分離度符合要求。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取羥基紅花黃色素A對(duì)照品9.62 mg，置50 mL量瓶中，加75%甲醇適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密稱取丹酚酸B對(duì)照品16.78 mg、芍藥苷對(duì)照品13.61 mg，置25 mL量瓶中，加上述羥基紅花黃色素A對(duì)照品溶液使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得含丹酚酸B 0.657 8 mg/mL、芍藥苷0.525 3 mg/mL、羥基紅花黃色素A 0.176 6 mg/mL的溶液（對(duì)照品溶液①），精密量取2 mL，置20 mL量瓶中，加75%甲醇至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 取本品適量，研細(xì)，精密稱取0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加75%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲提?。?50 W，40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用75%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，用微孔濾膜過濾，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液制備 按處方制法分別制備不含丹參、赤芍和紅花的陰性對(duì)照樣品，按供試品溶液制備方法分別制成陰性對(duì)照溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn)

吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，結(jié)果供試品色譜中，在與丹酚酸B、芍藥苷和羥基紅花黃色素A對(duì)照品色譜相同的保留時(shí)間處有色譜峰，與其他組分能達(dá)到良好分離，分離度均＞1.5，理論塔板數(shù)分別為8326、10 967、13 980。陰性對(duì)照色譜中，在與丹酚酸B、芍藥苷和羥基紅花黃色素A對(duì)照品色譜峰相應(yīng)的位置上無干擾峰，說明供試品溶液中的其他成分對(duì)測定結(jié)果無影響，見圖1。

2.4 線性關(guān)系的考察

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液① 0.3、0.6、0.9、1.2、1.6、2.0 mL，分別置10 mL量瓶中，加75%甲醇至刻度，搖勻，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，以濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。丹酚酸B：Y＝10.866X－1.100 9，r＝0.999 6（n＝6）。芍藥苷：Y＝7.621X＋0.292 1，r＝0.999 8（n＝6）。羥基紅花黃色素A：Y＝11.834X－0.352 8，r＝0.999 4（n＝6）。結(jié)果表明，丹酚酸B在0.197～1.316 μg、芍藥苷在0.158～1.051 μg、羥基紅花黃色素A在0.053～0.353 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

圖1 痛經(jīng)靈顆粒中3種有效成分HPLC圖

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，進(jìn)樣量10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，結(jié)果丹酚酸B、芍藥苷和羥基紅花黃色素A的峰面積RSD分別為0.97%、1.56%、1.22%，表明精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)樣品6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測定每份樣品中3種成分含量，結(jié)果丹酚酸B、芍藥苷、羥基紅花黃色素A的含量RSD分別為1.33%、0.91%、1.52%，說明重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供品溶液，分別在0、3、6、9、12 h進(jìn)樣測定峰面積，結(jié)果丹酚酸B、芍藥苷、羥基紅花黃色素A的峰面積RSD分別為1.59%、1.13%、1.27%。表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已測得含量（丹酚酸B 2.628 mg/g，芍藥苷2.083 mg/g，羥基紅花黃色素A 0.706 mg/g）的痛經(jīng)靈顆粒6份，每份0.25 g，分別精密加入“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液①各1.0 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品測定

按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件，測定來自云南、河北、陜西、吉林不同廠家共12批樣品中3種成分的含量，結(jié)果見表2。

根據(jù)12批樣品所測得的結(jié)果，可看出不同廠家不同批次所含3種成分的含量有所差異，質(zhì)量參差不齊，其中尤以羥基紅花黃色素A的含量差別為大，可能與紅花藥材較貴且在成藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中較少被檢測有關(guān)，因此很有必要對(duì)這3種成分合理定量，從而更好地監(jiān)管該藥品的質(zhì)量。

表212 批樣品中3種成分含量測定結(jié)果（mg/g，n＝3）

3 討論

本試驗(yàn)比較了30%乙醇、甲醇、50%甲醇及75%甲醇幾種溶劑的提取效果，結(jié)果以75%甲醇提取所得可更好兼顧3種成分的含量，故以75%甲醇為提取溶劑。因丹酚酸B對(duì)熱不太穩(wěn)定，故未采用回流而采用超聲方式提取，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)超聲提取25 min后，3種成分的含量無明顯增加，所以將提取時(shí)間定在30 min。

在多成分同時(shí)檢測中，很多需要采用轉(zhuǎn)換波長的方式以取得好的效果[5-6]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以芍藥苷的最大吸收波長230 nm作為單一檢測波長，其他2種成分亦吸收穩(wěn)定，響應(yīng)信號(hào)良好，線性范圍滿足需要，故采用單波長檢測，便于該方法更廣泛地應(yīng)用。

[1] 中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)：中藥成方制劑 第十五冊(cè)[M].1997：209.

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Simultaneous Determination of Three Active Ingredients in Tongjingling Granules by HPLC

LI Zhong-e (Nanyang Institute for Food and Drug Control, Nanyang 473061, China)

Objective To establish a simultaneous determination method for Salvianolic acid B, Paeoniflorin and Hydroxysafflor yellow A in Tongjingling Granules; To provide a reliable method for effective quality control. Methods The determination was performed on a Welchrom C18column with acetonitrile (A) - 0.1% phosphoric acid (B) as the mobile phase in gradient elution mode at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was 230 nm. Results Salvianolic acid B presented in a good linear relation in the range of 0.197–1.316 μg, and the average recovery rate was 98.72% with RSD 1.49%; Paeoniflorin presented in a good linear relation in the range of 0.158–1.051 μg, and the average recovery rate was 99.01% with RSD 0.92%; Hydroxysafflor yellow A presented in a good linear relation in the concentration range of 0.053–0.353 μg, and the average recovery rate was 98.34% with RSD of 1.60%. Conclusion This method is simple, sensitive, accurate and with good reproducibility, which can be used for quality control of Tongjingling Granules.

Tongjingling Granules; Salvianolic acid B; Paeoniflorin; Hydroxysafflor yellow A; HPLC

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.01.025

R284.1

A

1005-5304(2016)01-0103-03

2014-12-02；編輯：陳靜）