香菇多酚氧化酶活性測(cè)定方法的改進(jìn)

黃赫雁，韓春然，李 煜，戴傳榮，林樅雨，張家成

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150076）

香菇多酚氧化酶活性測(cè)定方法的改進(jìn)

黃赫雁，*韓春然，李 煜，戴傳榮，林樅雨，張家成

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150076）

對(duì)目前香菇多酚氧化酶活性的測(cè)定方法進(jìn)行改進(jìn)，通過(guò)離心消除蛋白質(zhì)沉淀對(duì)反應(yīng)的不利影響，以及其他因素對(duì)酶活力測(cè)定的影響，并對(duì)該方法進(jìn)行了重復(fù)與再現(xiàn)試驗(yàn)。結(jié)果表明，香菇中多酚氧化酶的最佳測(cè)定條件為反應(yīng)液預(yù)熱溫度40℃，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%（W/V）的三氯乙酸，取酶液1 mL，添加濃度0.3 mol/L的鄰苯二酚，反應(yīng)3 min后進(jìn)行離心，于波長(zhǎng)410 nm處測(cè)定吸光度。穩(wěn)定性與再現(xiàn)性試驗(yàn)表明，此方法的重復(fù)試驗(yàn)和再現(xiàn)試驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差性均小于5%。

香菇；多酚氧化酶；分光光度法；改進(jìn)；離心

0 引言

多酚氧化酶是導(dǎo)致香菇酶促褐變的主要酶類，引起香菇變黑甚至腐爛，導(dǎo)致品質(zhì)下降。該酶往往催化香菇中的內(nèi)源性多酚物質(zhì)氧化為醌類化合物，醌類化合物使高活性親電子的分子能夠聚合，導(dǎo)致褐色或黑色色素的形成，嚴(yán)重影響產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、風(fēng)味等[1-2]。多酚氧化酶活性常用的檢測(cè)方法為分光光度法，該法利用鄰苯二酚和D-兒茶素在多酚氧化酶（PPO）催化下生成有色產(chǎn)物，其顯色物質(zhì)在波長(zhǎng)410 nm處有最大吸收，吸收值在單位時(shí)間內(nèi)的變化和單位酶活性成正比，依此計(jì)算PPO活性強(qiáng)度。測(cè)定具有操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確性好等特點(diǎn)，應(yīng)用范圍較廣[3]。按照反應(yīng)時(shí)間，分光光度法測(cè)定酶活又可分為連續(xù)監(jiān)測(cè)法和定時(shí)法兩大類。連續(xù)監(jiān)測(cè)法是目前果蔬中PPO活性測(cè)定常用方法，這種方法可將多點(diǎn)的測(cè)定結(jié)果連接成線，很容易找到呈直線的區(qū)段，因而可以選擇線性反應(yīng)期來(lái)計(jì)算酶活性，但香菇中多酚氧化酶的線性反應(yīng)期只出現(xiàn)在反應(yīng)開(kāi)始時(shí)的極短時(shí)間區(qū)域內(nèi)，因此操作復(fù)雜，對(duì)試驗(yàn)人員的操作速度要求較高，誤差較大。在參考ünal M ü等人[4-5]的方法，以鄰苯二酚為底物，采用分光光度法測(cè)定香菇多酚氧化酶活性時(shí)發(fā)現(xiàn)，該方法測(cè)定的分光光度值數(shù)值小且不穩(wěn)定，出現(xiàn)了測(cè)定的分光光度值隨時(shí)間增加而減小，與實(shí)際趨勢(shì)不一致的現(xiàn)象。其原因?yàn)槎喾友趸概c底物接觸既反應(yīng)，且僅在反應(yīng)開(kāi)始的短時(shí)間內(nèi)呈線性增加，因此需要操作迅速，并且該方法在連續(xù)監(jiān)測(cè)的情況下需要對(duì)分光光度計(jì)進(jìn)行保溫。蘇適等人[6]在測(cè)定香菇中多酚氧化酶活性時(shí)，對(duì)此法進(jìn)行了改進(jìn)，采用分光光度法，使用了三氯乙酸來(lái)終止反應(yīng)，方法簡(jiǎn)單，測(cè)定時(shí)酶促反應(yīng)已經(jīng)被終止，故分光光度計(jì)無(wú)需保溫設(shè)備。另外，有文獻(xiàn)提到使用其他方法終止反應(yīng)，如沸水浴法[7]；但也有文獻(xiàn)指出，使用三氯乙酸終止酶反應(yīng)較其他方法得出的試驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確有效[8]。但該方法沒(méi)有測(cè)定反應(yīng)開(kāi)始時(shí)的分光光度值，無(wú)法知道在整個(gè)酶促反應(yīng)進(jìn)程中是否都是零級(jí)反應(yīng)，而且作為蛋白質(zhì)變性劑的三氯乙酸能夠使蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，使蛋白質(zhì)暴露出較多的疏水性基團(tuán)，從而引起蛋白質(zhì)聚集沉淀，這些絮狀沉淀嚴(yán)重影響分光光度值的測(cè)定。因此，在使用該方法時(shí)，第一需要測(cè)定反應(yīng)開(kāi)始時(shí)的分光光度值，第二有必要將沉淀與反應(yīng)液分離開(kāi)來(lái)，從而消除沉淀對(duì)分光光度值的影響。所以，在前面分光光度法的基礎(chǔ)上，使用三氯乙酸終止酶促反應(yīng)后，對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行離心，將沉淀分離，同時(shí)對(duì)方法中涉及到的其他對(duì)酶活測(cè)定有影響的因素（溫度、緩沖液pH值、三氯乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶液體積和底物濃度）進(jìn)行探討，以期使香菇中多酚氧化酶活性的測(cè)定方法在簡(jiǎn)單的基礎(chǔ)上更加準(zhǔn)確、可靠。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香菇，采摘于哈爾濱玉豐菌業(yè)香菇生產(chǎn)基地；磷酸二氫鈉（分析純），天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司提供；磷酸氫二鈉（分析純）、三氯乙酸（分析純），天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司提供；鄰苯二酚（教學(xué)試驗(yàn)用），天津市巴斯夫化工有限公司提供；PVPP（分析純），廣東粵美化工有限公司提供。

1.2 主要儀器

TGL-18C型高速冷凍離心機(jī)，湖南星科科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；UV-5200型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司產(chǎn)品；電子天平，上海光正醫(yī)療儀器有限公司產(chǎn)品；DK-98-11A型恒溫?cái)?shù)顯水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 粗酶液的制備

取新鮮的香菇50 g，加pH值為6.9的2%PVPP的磷酸緩沖液50 mL，勻漿，攪拌，靜置40 min，以轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心10 min。取上清液于4℃冰箱保存。

1.3.2 多酚氧化酶酶活計(jì)算

多酚氧化酶活力單位定義為在測(cè)定條件下，每毫升樣品每分鐘引起吸光度改變0.001，則定為1個(gè)酶活單位［U/(g·min)］，樣品中的多酚氧化酶活性按下式方程計(jì)算：

式中：R——多酚氧化酶活性，單位U/（g·min）；

ΔA——反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化；

Vt——酶提取液的總體積，mL；

W——香菇的鮮質(zhì)量，g；

Vs——參加反應(yīng)的酶液體積，mL；

T——反應(yīng)時(shí)間，min。

1.3.3 PPO活性測(cè)定的方法

（1）按參考文獻(xiàn)[1]方法。取1 mL濃度為0.1 mol/L鄰苯二酚，加入5 mL磷酸鹽緩沖液（pH值6.9），搖勻。在30℃條件下水浴恒溫10 min，立即加入1 mL酶溶液，快速搖勻。以不加酶液加入1 mL PBS溶液的反應(yīng)體系為參比液，采用分光光度計(jì)于波長(zhǎng)410 nm處測(cè)定溶液的吸光度。每30 s測(cè)定1次，共測(cè)定3 min。以1 mL酶液，1 min內(nèi)增加的吸光度表示酶活力的大小。

（2）按參考文獻(xiàn)[2]方法。取1 mL濃度為0.1 mol/L鄰苯二酚，加入5 mL磷酸鹽緩沖液（pH值6.88），再加0.5 mL酶溶液作為反應(yīng)體系，搖勻。在特定溫度條件下恒溫10 min，立即加入20%三氯乙酸2 mL，快速搖勻。以不加酶溶液的反應(yīng)體系溶液為參比液，采用723型分光光度計(jì)于波長(zhǎng)410 nm處測(cè)定溶液的吸光率（O.D）。此時(shí)吸光率（O.D）的數(shù)值就表示原酶溶液中酶活力。

（3）改進(jìn)方法。將試管A加入5 mL pH值6.9的磷酸緩沖液，在40℃溫度下水浴10 min，40℃預(yù)熱的酶液1 mL，再加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的三氯乙酸溶液使酶失活，然后加入1 mL濃度為0.3 mol/L鄰苯二酚，搖勻，以轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心5 min，取上清液，于波長(zhǎng)410 nm處測(cè)定溶液吸光度，此為反應(yīng)開(kāi)始時(shí)的數(shù)值。同時(shí)，以緩沖溶液替代酶液做相同處理，作為空白對(duì)照。再將試管B加入5 mL pH值6.9的磷酸緩沖液，0.3 mol/L鄰苯二酚1 mL，搖勻，在40℃溫度下水浴10 min，加入1 mL預(yù)熱的酶液同時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，3 min后立即加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的三氯乙酸溶液，以轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心5 min，取上清液，采用分光光度計(jì)于波長(zhǎng)410 nm處測(cè)定溶液的吸光度A2，此為反應(yīng)終止時(shí)的數(shù)值。同時(shí)，以緩沖溶液替代酶液做相同處理，作為空白對(duì)照。其中ΔA=A2-A1。

1.3.4 離心對(duì)酶活性測(cè)定的影響

在對(duì)參考文獻(xiàn)[2]方法進(jìn)行檢測(cè)的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，該法并未測(cè)定反應(yīng)開(kāi)始時(shí)的吸光度，并且反應(yīng)液經(jīng)過(guò)離心后顏色變淺，而沉淀顏色則變深，可見(jiàn)反應(yīng)后再離心可能導(dǎo)致部分反應(yīng)產(chǎn)物被沉淀帶走，因此有必要考察離心對(duì)PPO活性測(cè)定的影響。在此基礎(chǔ)上，添加另一支試管測(cè)定開(kāi)始時(shí)吸光度，具體操作步驟：取一只試管加入5 mL pH值6.9的磷酸緩沖液，在30℃溫度下水浴10 min，30℃預(yù)熱的酶液1 mL，再加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的三氯乙酸溶液使酶失活，然后加入0.1 mol/L鄰苯二酚1 mL，搖勻，以轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心5 min，取上清液，于波長(zhǎng)410 nm處測(cè)定溶液吸光度，此為反應(yīng)開(kāi)始時(shí)的數(shù)值A(chǔ)1。另取一支試管按照參考文獻(xiàn)[2]方法測(cè)定。當(dāng)2支試管中的反應(yīng)結(jié)束后，將試管內(nèi)的液體以轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心5 min，取上清液，進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5 其他因素對(duì)酶活測(cè)定的影響

（1）溫度對(duì)酶活性測(cè)定的影響。通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)測(cè)定時(shí)最適溫度并非是30℃，因此有必要考察改進(jìn)方法中溫度對(duì)酶活測(cè)定的影響。設(shè)定預(yù)熱溫度分別為20，30，40，50，60℃。

（2）緩沖溶液的pH值對(duì)酶活測(cè)定的影響。考察測(cè)定方法中緩沖溶液的pH值對(duì)酶活測(cè)定的影響，設(shè)定緩沖溶液的pH值分別為6.7，6.8，6.9，7.0，7.1。

（3）三氯乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)酶活測(cè)定的影響。測(cè)定時(shí)三氯乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)低，則酶并未完全失活；三氯乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)高會(huì)有安全隱患，因此有必要考查三氯乙酸使酶失活時(shí)的適宜質(zhì)量分?jǐn)?shù)。設(shè)定三氯乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)（W/V）分別為15%，20%，25%，30%，35%。

（4）酶液體積對(duì)酶活測(cè)定的影響?？疾鞙y(cè)定方法中酶液體積對(duì)酶活測(cè)定的影響。設(shè)定酶液體積分別為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL。

（5）底物濃度對(duì)酶活測(cè)定的影響。考察測(cè)定方法中底物濃度對(duì)酶活測(cè)定的影響，設(shè)定鄰苯二酚濃度分別為0.1，0.2，0.3，0.4 mol/L。為了進(jìn)一步研究底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)的影響，計(jì)算該酶的Km值和該酶促反應(yīng)的Vmax值。以單位時(shí)間內(nèi)單位體積的產(chǎn)物生成量來(lái)表示該酶促反應(yīng)的速度，將1/V對(duì)1/[S]作圖，即可得到一條直線，該直線在Y軸上的截距即為1/Vmax，在X軸上的截距即為1/Km的絕對(duì)值。

1.3.6 改進(jìn)方法的穩(wěn)定性與再現(xiàn)性驗(yàn)證

重復(fù)試驗(yàn)為同一實(shí)驗(yàn)室，同一操作人員按照改進(jìn)方法，連續(xù)3 d測(cè)試香菇中多酚氧化酶活性；再現(xiàn)試驗(yàn)為不同實(shí)驗(yàn)室，另一位操作人員按照改進(jìn)方法，連續(xù)3 d測(cè)試香菇中多酚氧化酶活性。

1.3.7 改進(jìn)方法在其他果蔬中的應(yīng)用

考察改進(jìn)方法在其他果蔬中的應(yīng)用，選取香蕉、馬鈴薯、金針菇進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)。在同一實(shí)驗(yàn)室，同一操作人員按照改進(jìn)方法，連續(xù)3 d測(cè)試香菇中多酚氧化酶活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 參考文獻(xiàn)[1]方法的驗(yàn)證

吸光度隨時(shí)間的變化見(jiàn)圖1。

此方法測(cè)定PPO活性時(shí)，吸光度在3 min內(nèi)變化較小，誤差大且不穩(wěn)定，由于PPO與底物接觸立即反應(yīng)，且在反應(yīng)開(kāi)始的短時(shí)間內(nèi)呈線性增加，因此需要操作迅速，但仍無(wú)法準(zhǔn)確確定反應(yīng)開(kāi)始時(shí)的分光光度值，因此該方法誤差較大。

圖1 吸光度隨時(shí)間的變化

2.2 離心對(duì)PPO活性測(cè)定的影響

離心對(duì)PPO活性測(cè)定的影響見(jiàn)圖2。

圖2 離心對(duì)PPO活性測(cè)定的影響

由圖2可知，未離心時(shí)測(cè)定的酶活性數(shù)值為負(fù)數(shù)，顯然與事實(shí)不符。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因?yàn)?，測(cè)定反應(yīng)開(kāi)始時(shí)吸光度大于測(cè)定反應(yīng)終止時(shí)的吸光度。造成這樣的結(jié)果可能是三氯乙酸的添加與溶液中某些物質(zhì)相結(jié)合，結(jié)合后的物質(zhì)影響多酚氧化酶氧化底物的生成物對(duì)紫外光的吸收，而使得測(cè)定反應(yīng)終止時(shí)吸光度變小。進(jìn)行離心后，結(jié)果有了明顯的改變，證明離心對(duì)三氯乙酸與某些物質(zhì)結(jié)合形成的不溶物有明顯影響。但是，這種結(jié)合而成的物質(zhì)是通過(guò)什么方式以及如何影響PPO氧化底物的生成物對(duì)紫外光的吸收還需要進(jìn)一步研究。

溫度對(duì)PPO活性測(cè)定的影響見(jiàn)圖3。

圖3 溫度對(duì)PPO活性測(cè)定的影響

由圖3可知，隨著溫度的升高，酶活性逐漸增大，考慮為隨著溫度的升高，溶液中分子的熱運(yùn)動(dòng)加劇，單位時(shí)間內(nèi)底物與酶接觸的幾率增高，酶活性增大；繼續(xù)升高溫度，酶活性逐漸降低，考慮為隨溫度升高酶蛋白變性也增加，酶活性降低，最適溫度的大小是這2種作用相平衡的結(jié)果。本試驗(yàn)中考慮最適溫度為40℃。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，雙孢菇[9]、秀珍菇[10]、雞腿蘑[11]、蘑菇[12]、草菇[13]的最適溫度分別為20，35，45，50，35℃。因此可以看出，PPO的最適溫度與原料的來(lái)源及底物的種類有關(guān)。

2.4 緩沖液pH值對(duì)PPO活性測(cè)定的影響

緩沖液pH值對(duì)PPO活性測(cè)定的影響見(jiàn)圖4。

圖4 緩沖液pH值對(duì)PPO活性測(cè)定的影響

由圖4可知，緩沖溶液pH值在6.7～7.1時(shí)對(duì)香菇中多酚氧化酶活性影響不大，最適值在pH值為6.9處，與文獻(xiàn)中給定的pH值6.88相差不大。

2.5 三氯乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)PPO活性測(cè)定的影響

三氯乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)PPO活性測(cè)定的影響見(jiàn)圖5。

圖5 三氯乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)PPO活性測(cè)定的影響

由圖5可知，三氯乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%（W/V）時(shí)，顯示為酶活測(cè)定值最好，但是當(dāng)三氯乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%時(shí)，反應(yīng)液顏色呈深褐色，隨著時(shí)間增加，顏色逐漸變深為黑褐色，原因可能是此時(shí)三氯乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，并未使酶失活，反應(yīng)液顏色較深，所測(cè)數(shù)值較大，因此該數(shù)值為錯(cuò)誤數(shù)值。當(dāng)三氯乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于20%后，酶活性測(cè)定的數(shù)值逐漸減小，造成這樣的結(jié)果可能是由于三氯乙酸達(dá)到一定的質(zhì)量分?jǐn)?shù)后，部分過(guò)量的三氯乙酸和溶液中的某些物質(zhì)結(jié)合，結(jié)合后的物質(zhì)干擾PPO氧化底物的生成物對(duì)紫外光的吸收，而隨著三氯乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，這種干擾物質(zhì)的量也同步增加，所以造成讀數(shù)偏小、酶活降低[14]。因此，在多酚氧化酶活性測(cè)定時(shí)應(yīng)選擇適宜的三氯乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)。在試驗(yàn)中，選擇三氯乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%（W/V）。

對(duì)于類方形蜂窩夾芯，有：θ=0°，h=2l，于是可得設(shè)等效單元在yoz面內(nèi)的剪切模量為Gcyz，則等效單元的總變形能為：

2.6 酶液體積對(duì)PPO活性測(cè)定的影響

酶液體積對(duì)PPO活性測(cè)定的影響見(jiàn)圖6。

圖6 酶液體積對(duì)PPO活性測(cè)定的影響

由圖6可知，當(dāng)加入的酶液體積為1 mL時(shí)，測(cè)定的酶活性數(shù)值最好。過(guò)低的酶液體積使底物生成物生成量少，酶蛋白在低濃度下易失活，可能是亞基易解離、易吸附在容器上和易發(fā)生表面變性的原因，測(cè)定值不準(zhǔn)確；酶液體積過(guò)高時(shí)測(cè)定的酶活值偏小，原因?yàn)槊敢后w積過(guò)高，反應(yīng)速率加快，時(shí)間過(guò)短，在計(jì)算時(shí)誤差較大。因此，酶液應(yīng)選擇合適的液體積，使吸光度在0.1～0.7時(shí)較好。試驗(yàn)選取酶液體積為1 mL。

2.7 底物濃度對(duì)PPO活性測(cè)定的影響

底物濃度對(duì)PPO活性測(cè)定的影響見(jiàn)圖7。

圖7 底物濃度對(duì)PPO活性測(cè)定的影響

由圖7可知，酶活性隨著底物濃度的增加，離心后所測(cè)得的酶活性逐漸增加，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?.3 mol/L時(shí)達(dá)到最大，但在0.4 mol/L時(shí)出現(xiàn)負(fù)值。

以鄰苯二酚為底物時(shí)Lineweaver-Burk曲線見(jiàn)圖8。

圖8 以鄰苯二酚為底物時(shí)Lineweaver-Burk曲線

由圖8可知，Vmax=1/1.049 7=0.952 7 min/A410，Km=1/0.513 73=1.946 5 mol/L。擬合直線 Y=0.513 7X+1.049 7，相關(guān)系數(shù)R2=0.995 1，表明香菇中PPO對(duì)鄰苯二酚有很好的親和力。酶催化反應(yīng)的初始階段與鄰苯二酚底物濃度成正比。結(jié)合圖7可得，選取底物濃度為0.3 mol/L的用量較為適宜。

2.8 改進(jìn)方法的穩(wěn)定性與再現(xiàn)性

2.8.1 改進(jìn)方法的穩(wěn)定性

重復(fù)試驗(yàn)為同一實(shí)驗(yàn)室、同一操作人員條件下按照改進(jìn)方法，連續(xù)3 d測(cè)試香菇中多酚氧化酶活性。

香菇PPO活性連續(xù)3 d測(cè)定值的精密度見(jiàn)表1。

表1 香菇PPO活性連續(xù)3 d測(cè)定值的精密度

由表1可知，在重復(fù)性條件下連續(xù)3 d測(cè)定的香菇中PPO活性比較穩(wěn)定，標(biāo)準(zhǔn)差（SD）為0.72，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.19%。通常相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%，說(shuō)明檢測(cè)結(jié)果精密度高。結(jié)果表明改進(jìn)的方法在重復(fù)條件下，重復(fù)性與穩(wěn)定性均較好。

2.8.2 改進(jìn)方法的再現(xiàn)性

再現(xiàn)試驗(yàn)為不同實(shí)驗(yàn)室、另一位操作人員按照改進(jìn)方法，連續(xù)3 d測(cè)試香菇中多酚氧化酶活性。

再現(xiàn)條件下香菇PPO活性連續(xù)3 d測(cè)定值的精密度見(jiàn)表2。

表2 再現(xiàn)條件下香菇PPO活性連續(xù)3 d測(cè)定值的精密度

由表2可知，在再現(xiàn)性條件下連續(xù)3 d測(cè)定的香菇中PPO活性也比較穩(wěn)定，標(biāo)準(zhǔn)差SD為0.82，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.33%。結(jié)果表明，改進(jìn)的方法在再現(xiàn)性條件下，重復(fù)性與穩(wěn)定性均較好。試驗(yàn)結(jié)果與劉雅嘉等人[15-16]的研究結(jié)果相似，數(shù)值大小相近。

綜上所述，試驗(yàn)改進(jìn)的香菇中多酚氧化酶活性測(cè)定方法在重復(fù)性條件及再現(xiàn)性條件下測(cè)定的結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均不超過(guò)5%，可見(jiàn)此方法可信，檢測(cè)結(jié)果可靠。

2.9 改進(jìn)方法在其他果蔬中的應(yīng)用

選取香蕉、馬鈴薯、金針菇進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)，在同一實(shí)驗(yàn)室、同一操作人員條件下按照改進(jìn)方法，連續(xù)3 d測(cè)試香菇中多酚氧化酶活性。

再現(xiàn)條件下多種果蔬PPO活性連續(xù)3 d測(cè)定值的精密度見(jiàn)表3。

試驗(yàn)結(jié)果表明，利用改進(jìn)方法測(cè)定香蕉中多酚氧化酶活性時(shí)，測(cè)定結(jié)果與曲留柱[17]的研究結(jié)果相近，該研究中使用的測(cè)定方法為參考文獻(xiàn)[1]中的方法，測(cè)得的香蕉多酚氧化酶活性為80 U/(g·min)左右。但與Wuyts N等人[18]的研究成果相差較大，其原因可能是在提取多酚氧化酶時(shí)使用了Triton X-100促使質(zhì)體膜溶解，激活了潛在的PPO活性。Triton X-100能否應(yīng)用在香菇的多酚氧化酶活性測(cè)定中，還有待進(jìn)一步研究。利用改進(jìn)方法測(cè)定馬鈴薯多酚氧化酶活性時(shí)，測(cè)定結(jié)果與鞏慧玲等人[19-20]使用參考文獻(xiàn)[1]方法測(cè)定的結(jié)果相近，測(cè)得的馬鈴薯多酚氧化酶活性均在100 U/(g·min)左右。利用改進(jìn)方法測(cè)定金針菇中多酚氧化酶活性的結(jié)果與孫月娥等人[21-22]使用參考文獻(xiàn)[1]方法測(cè)定的結(jié)果相近，測(cè)得的金針菇多酚氧化酶活性均在80 U/(g·min)左右，效果較好。由此可見(jiàn)，改進(jìn)方法在測(cè)定多酚氧化酶活性時(shí)，獲得的結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)中測(cè)得的結(jié)果相近或優(yōu)于其他，但操作上更加簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、完善。

表3 再現(xiàn)條件下多種果蔬PPO活性連續(xù)3 d測(cè)定值的精密度

在測(cè)定改進(jìn)方法于其他果蔬中的應(yīng)用時(shí)發(fā)現(xiàn)，在測(cè)定香蕉多酚氧化酶活性時(shí)幾乎沒(méi)有沉淀生成，在測(cè)定馬鈴薯多酚氧化酶活性時(shí)有少量沉淀生成，而在測(cè)定金針菇時(shí)有大量沉淀生成，可能是由于蘑菇類真菌中蛋白質(zhì)含量較高，遇到三氯乙酸后產(chǎn)生沉淀。

綜上所述，改進(jìn)方法可以應(yīng)用于各種水果、蔬菜及蘑菇類的多酚氧化酶活性測(cè)定，對(duì)于反應(yīng)過(guò)程中容易出現(xiàn)沉淀的多酚氧化酶測(cè)定，如蘑菇類等含蛋白較高的產(chǎn)品，該法尤其適用。

3 結(jié)論

在文獻(xiàn)中測(cè)定PPO活性方法的基礎(chǔ)上，有必要確定反應(yīng)開(kāi)始時(shí)的測(cè)定值，以便確定測(cè)定數(shù)值的完整性與準(zhǔn)確性；反應(yīng)結(jié)束后需進(jìn)行離心，以消除雜蛋白及其他不溶性物質(zhì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成的影響；適宜的溫度、三氯乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶液體積與底物濃度對(duì)保證酶促反應(yīng)的順利進(jìn)行，讓酶活力真實(shí)體現(xiàn)也必不可少。

試驗(yàn)證明，采用分光光度法測(cè)定香菇中多酚氧化酶的最佳條件為反應(yīng)液預(yù)熱溫度40℃，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%（W/V）的三氯乙酸，取酶液1 mL，添加濃度0.3 mol/L的鄰苯二酚，反應(yīng)3 min后進(jìn)行離心，于波長(zhǎng)410 nm處測(cè)定吸光度。穩(wěn)定性與再現(xiàn)性試驗(yàn)表明，此方法的重復(fù)試驗(yàn)和再現(xiàn)試驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差性均小于5%，穩(wěn)定性與再現(xiàn)性均較好。

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Improvement of the Determination of Polyphenol Oxidase Activity in Mushroom（Lentinus edodes（Berk.）sing）

HUANG Heyan，*HAN Chunran，LI Yu，DAI Chuanrong，LIN Congyu，ZHANG Jiacheng （Food and Engineering College，Harbin University of Commerce，Harbin，Heilongjiang 150076，China）

Common methods from literatures for the determination of polyphenol oxidase（PPO） activity in mushroom （Lentinus edodes（Berk）.sing） is improved.Adverse effect of precipitate is removed by centrifugation，at the same time，some factors are also studied，repetition and repeatability tests are conducted.The results show that the optimal conditions for the determination of PPO activity is as follows：preheating temperature of the reaction is 40℃，concentration of trichloroacetic acid is 20%（W/V），the crude enzyme is 1 mL，pyrocatechol is 0.3 mol/L after incubation for 3 min，the reaction liquid is centrifuged and measured the absorbance at 410 nm.Stability and repeatability rests show that the relative standard deviation of both tests is within 5%.

mushroom；polyphenol oxidase；spectrophotometry；improvement；centrifugation

TS207.3

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.11.010

1671-9646（2016）11a-0032-06

2016-09-01

黃赫雁（1990—），女，在讀碩士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工及保鮮。*