張璐瑤，趙 峽，陳歡歡

(中國海洋大學(xué) 醫(yī)藥學(xué)院，海洋藥物教育部重點實驗室，山東省糖科學(xué)與糖工程重點實驗室，山東 青島 266003)

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糖類化合物PMP衍生分析進展

張璐瑤，趙 峽*，陳歡歡

(中國海洋大學(xué) 醫(yī)藥學(xué)院，海洋藥物教育部重點實驗室，山東省糖科學(xué)與糖工程重點實驗室，山東 青島 266003)

糖類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與組成分析在揭示其生物學(xué)功能方面發(fā)揮著重要作用，糖類化合物的衍生化分析是實現(xiàn)其高靈敏度定性和定量檢測的有效方法。該文對一種條件溫和、靈敏度高、選擇性好的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)的衍生化分析方法在糖類化合物的單糖組成、聚合度、取代度、異構(gòu)體分析以及在N/O-糖鏈的釋放和定量分析等方面的應(yīng)用進展進行了綜述。

1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)；衍生化方法；糖類分析；綜述

生物體內(nèi)的糖類物質(zhì)已被證明具有抗腫瘤、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等重要的生物活性，對糖類進行定性定量分析研究有助于探索糖類生物學(xué)功能以及相關(guān)疾病的發(fā)病機理[1]。然而由于糖類物質(zhì)極性大，缺乏光學(xué)吸收基團，無法滿足高靈敏度分析手段的檢測要求，糖類分析手段成為制約整個糖類研究領(lǐng)域發(fā)展的瓶頸[2]。衍生化可使糖鏈帶上紫外或熒光基團，在滿足高靈敏度光學(xué)檢測的同時提高離子化效率，為糖類物質(zhì)的分析提供了新的技術(shù)。常用的衍生化試劑有紫外和熒光兩種[3]，在眾多的衍生試劑中，以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)為代表的1,3取代的吡唑啉酮類衍生試劑和糖鏈還原性末端的反應(yīng)在弱堿性介質(zhì)中進行，與其它在酸性介質(zhì)中反應(yīng)的衍生試劑相比，具有條件溫和、衍生產(chǎn)物穩(wěn)定、無立體異構(gòu)體、紫外吸收強、不損失唾液酸、適于多種類型糖鏈分析等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于糖類化合物的分析[4]。PMP類似物如1-(2-萘基)-3-甲基-5-吡唑啉酮(NMP)[5-6]、1-(4-異丙基)苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PPMP)[7]、1,3-二苯基-5-吡唑啉酮(DPP)[8]及1-(甲氧苯基)-3-甲基-吡唑啉酮(PMPMP)[9]等對分析痕量甚至微痕量糖鏈也均有明顯優(yōu)勢，具有較高的開發(fā)潛力。本文對PMP衍生化方法在糖類化合物的單糖組成分析、寡糖聚合度和取代度分析、二糖異構(gòu)體的區(qū)分、N-糖鏈和O-糖鏈的釋放及定量分析等方面的研究進展進行了系統(tǒng)的總結(jié)，以期為研究者在糖類化合物的高靈敏度定性、定量分析方面提供啟發(fā)和借鑒。

1 PMP衍生化反應(yīng)的機理、方法與特性

還原糖與PMP的衍生反應(yīng)在堿性條件下進行，其1個糖分子的還原端可與2分子PMP形成穩(wěn)定的衍生物。以PMP與葡萄糖的衍生為例，其衍生反應(yīng)機理如圖1所示。常用的典型衍生方法[10]為：向100 μL供試品溶液中加入100 μL 0.3 mol/L NaOH和120 μL 0.3 mol/L PMP溶液，充分混合，在70 ℃下避光反應(yīng)1 h，冷卻至室溫后用100 μL 0.3 mol/L HCl中和，再用500 μL氯仿反復(fù)萃取3次，離心后取上清液即可用于色譜或質(zhì)譜分析。若用氨水代替NaOH作反應(yīng)介質(zhì)，無需鹽酸中和，經(jīng)真空干燥后可直接進行質(zhì)譜分析，從而可簡化反應(yīng)步驟，減少微量樣品的損失并提高質(zhì)譜信號的靈敏度[11]。

圖1 PMP與還原糖的衍生反應(yīng)機理以及PMP衍生物在弱堿性條件下的復(fù)原Fig.1 Derivatization mechanism of reducing sugar with PMP and recovery of the PMP derivative in weakly alkaline condition

糖與PMP的衍生產(chǎn)物具有兩個重要特點：①在紫外區(qū)(UV)具有強吸收，如PMP標(biāo)記的葡萄糖乙醇溶液在245 nm處的摩爾吸光系數(shù)可達29 400；②可使大部分糖類化合物的電化學(xué)反應(yīng)性能明顯提高[12]，如PMP標(biāo)記的葡萄糖可在玻碳電極上氧化產(chǎn)生600 mA電流，可以實現(xiàn)在毛細管電泳(CE)分析中的高靈敏度檢測[10,13]。此外，糖類的PMP衍生物雖在堿性且低溫條件下保持穩(wěn)定，但在弱堿性條件下加熱可使糖類復(fù)原，如PMP標(biāo)記的葡萄糖在弱堿溶液中加熱時，1個PMP基團首先被移除，形成1-PMP衍生物；在更激烈的條件下可移除另1個PMP。這不僅可將PMP衍生物恢復(fù)為原先的糖，還可用于糖類的結(jié)構(gòu)確證和酶的抑制分析等[14]。據(jù)此特性可在PMP衍生完成后，利用萃取等手段除去PMP，以防止糖的復(fù)原。

2 單糖組成分析

單糖組成分析是多糖基本結(jié)構(gòu)解析的重要手段。因為糖類物質(zhì)不具有發(fā)色基團，且單糖極性較強，結(jié)構(gòu)相近，難以用常規(guī)方法進行分析。采用PMP衍生化方法可使糖類物質(zhì)在245 nm處產(chǎn)生強烈的紫外吸收，檢測靈敏度可達到1 pmol甚至100 fmol[12]，并具有操作方便、分離效率高、重現(xiàn)性好等特點，是目前糖類物質(zhì)，尤其是復(fù)雜糖類物質(zhì)單糖組成分析的重要方法[15-16]。

通過采用PMP衍生法可實現(xiàn)對中性糖如甘露糖(Man)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、木糖(Xyl)、阿拉伯糖(Ara)、鼠李糖(Rha)、巖藻糖(Fuc)，酸性糖如葡萄糖醛酸(GlcUA)、半乳糖醛酸(GalUA)，堿性糖如氨基葡萄糖(GlcN)、氨基半乳糖(GalN)共11種單糖的同時測定[15]。本實驗室的研究結(jié)果表明，這些常見單糖中除Ara/Xyl外，均可實現(xiàn)良好的基線分離(見圖2)。另外，本實驗室還將PMP衍生方法成功用于褐藻多糖及海洋抗心血管疾病藥物藻酸雙酯鈉(PSS)中甘露糖醛酸(M)/古羅糖醛酸(G)的組成比例分析(見圖3)[17]，因該方法是在堿性條件下衍生，糖醛酸的內(nèi)酯形式不影響M和G的分離，比傳統(tǒng)的離子交換色譜方法更適合M/G比值的測定和產(chǎn)品的質(zhì)量控制。此外，PMP衍生法還可同時對酵母細胞壁中的露聚糖和β葡聚糖含量進行測定[18]，以及對傳統(tǒng)中藥中的多糖進行PMP衍生單糖組成分析并建立HPLC指紋圖譜，從而為中藥多糖結(jié)構(gòu)分析和質(zhì)量控制提供了有力依據(jù)[19]。

圖2 常見11種單糖標(biāo)準(zhǔn)品PMP衍生物的液相色譜圖[15]Fig.2 Chromatogram of eleven monosaccharide standards derivatized by PMP[15]1.Man;2.GlcN;3.Rha;4.GlcUA;5.GalUA;6.GalN; 7.Glc;8.Gal;9.Xyl;10.Ara;11.Fuc

圖3 古羅糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品(a)、甘露糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品(b)以及PSS樣品(c)的液相色譜圖[17]Fig.3 Chromatograms of α-L-guluronic acid(a) , β-D-mannuronic acid(b)and PSS(c)[17]

圖4 PMP衍生的麥芽寡糖混合物的HPLC分離圖[22]Fig.4 Chromatogram of the PMP derivatives of maltodextrins[22]

3 寡糖聚合度及取代度的分析

寡糖的生物活性與其聚合度(DP)密切相關(guān)，不同DP值的寡糖分子可產(chǎn)生不同的生物活性[20-21]，因此寡糖的DP分析在其構(gòu)效關(guān)系研究和產(chǎn)品質(zhì)量控制方面具有重要意義。研究表明，寡糖經(jīng)PMP 衍生化后采用RP-HPLC 分離模式，可以有效地應(yīng)用于寡糖的DP測定。如對麥芽寡糖混合物采用PMP標(biāo)記后，在50 min 內(nèi)可以基線分離DP 1-16 的麥芽寡糖(圖4)[22]。

寡糖的取代基位置和取代度均會明顯影響其生物活性，采用PMP衍生化方法可以測定寡糖的取代度和判斷取代位置。殼聚糖和甲殼素的差異在于糖鏈中的乙酰化程度(DA)不同，采用Hirano法將殼聚糖的亞硝酸降解產(chǎn)物進行PMP衍生和LC-MS分析，可測定殼寡糖中自由氨基和N-乙酰葡萄糖(GlcNAc)的含量及DA值[23]。如圖5所示，質(zhì)荷比(m/z)1 100.42為帶有3個GlcNAc的寡糖，m/z752.78為帶有5個GlcNAc的寡糖。該方法可檢測到DP高達11的殼寡糖，根據(jù)紫外信號進行定量計算得到DA為32%，與酸堿滴定法測定結(jié)果一致。另外，PMP衍生方法還可用于硫酸寡糖取代位置和取代度的分析。如采用PMP衍生法將硫酸軟骨素A(UA-GalNAc4S)、硫酸軟骨素B(UA2S-GalNAc4S)以及硫酸軟骨素C(UA-GalNAc6S)的亞硝酸降解產(chǎn)物采用聯(lián)合二級質(zhì)譜技術(shù)進行分析，不僅能夠確認二糖硫酸基團位置，而且可以分析得到硫酸寡糖的取代度[24-25]。

4 二糖的同分異構(gòu)體分析

糖類的同分異構(gòu)體，尤其是不同糖苷鍵或端基異構(gòu)體很難采用常規(guī)分析方法加以區(qū)分，但通過PMP衍生化并結(jié)合多級質(zhì)譜(MSn)產(chǎn)生的離子碎片和相對豐度情況，可以區(qū)分不同連接方式的糖以及糖的α和β異構(gòu)體。如 Wan等[26]通過采用PMP衍生和MSn聯(lián)用技術(shù)，研究了α1-2(曲二糖)、β1-2(槐糖)、α1-3(黑曲霉糖)、β1-3(海帶二糖)、α1-4(麥芽糖)、β1-4(纖維二糖)、α1-6(異麥芽糖)、β1-6(龍膽二糖)8種二糖4對同分異構(gòu)體，發(fā)現(xiàn)根據(jù)不同異構(gòu)體產(chǎn)生的特定離子碎片和相對豐度比，可對其連接方式和構(gòu)型加以區(qū)分。以1-3糖苷鍵連接為例，因α-糖環(huán)和β-糖環(huán)與PMP形成的C—C鍵能不同，黑曲霉糖(α1-3)的基峰m/z為 533，而海帶二糖(β1-3)m/z為521；將丟失1個PMP基團的碎片(m/z521)進行MS3分析，可獲得更多的碎片離子信息(表1)。如在MS3分析中，1-2糖苷鍵出現(xiàn)了m/z401特征離子；1-3糖苷鍵出現(xiàn)了m/z455，1-4糖苷鍵出現(xiàn)了m/z461，1-6糖苷鍵則出現(xiàn)m/z275特征離子等，可以對不同的連接方式加以區(qū)分。此外，本實驗室還成功建立了利用PMP衍生高效液相色譜法分離糖胺聚糖(GAGs)中GlcN與氨基甘露糖(ManN)、GlcUA與艾杜糖醛酸(IdoA)的方法，并結(jié)合電噴霧二級質(zhì)譜(ESI-CID-MS/MS)鑒定了GAGs中的耐酸解二糖[25]。

圖5 PMP衍生的乙?；瘹す寻返腍PLC-MS總離子流圖(A)及各峰對應(yīng)的質(zhì)量數(shù)(B)[23]

Fig.5 TIC chromatogram of the MS analysis of acetylated chitosan PMP derivatives(A) and the accumulatedm/zfor each peak(B)[23]

表1 4種不同連接方式二糖的特征離子碎片及區(qū)分異頭物的特征峰[26]

Table 1 A set of empirical criteria showing the special fragment ions for the four different linked disaccharides and the selected characteristic peak pairs to discriminate the isomeric disaccharides with different anomeric configurations[26]

LinkageSpecialionsinMS2SpecialionsinMS3RelativeionabundanceGlc(1-2)Glc401401α533/343>1>β533/343Glc(1-3)Glc431455α533/521>1>β533/521Glc(1-4)Glc-461α533/521>1>β533/521Glc(1-6)Glc659，275275α533/305>1>β533/305

5 用于N-糖鏈及O-糖鏈的釋放及定量分析

在細胞表面和糖蛋白中發(fā)現(xiàn)的N-糖鏈與O-糖鏈，在細胞間的通訊和相互作用方面發(fā)揮著重要作用，并與炎癥、免疫性疾病、腫瘤等很多疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。因此，N-/O-糖鏈的定性和定量分析在揭示糖鏈的生物學(xué)功能和與疾病的關(guān)系等方面具有重要意義[27]。

利用穩(wěn)定同位素PMP衍生標(biāo)記糖鏈的還原端，可實現(xiàn)對N-糖鏈和O-糖鏈[28]的相對定量分析。如將兩種來源的N-糖鏈用PNGase F酶切釋放，分別用氘代PMP(d0/d5-PMP)衍生后進行MS分析，發(fā)現(xiàn)同一糖鏈會出現(xiàn)分子量相差10 Da的對峰，由于同位素糖鏈之間的離子化效率相似，對峰之間豐度的差異可反映兩種不同來源糖鏈在量上的差異，從而可實現(xiàn)對糖鏈的定性和定量分析。這種方法已成功用于牛胎球蛋白(Bovine fetuin)N-糖鏈的釋放和分析(如圖6)[29]。在等摩爾混合的d0/d5-PMP牛胎球蛋白N-糖鏈衍生物ESI-MS圖[29]中，可以看到m/z2 118.09/2 128.36，2 263.09/2 273.36，2 554.18/2 564.36，2 628.36/2 638.45，2 919.45/2 929.45，3 210.36/3 220.64以及3 501.36/3 511.82共7組相差10 Da且豐度相當(dāng)?shù)膶Ψ?，通過解析可獲得這些糖鏈的結(jié)構(gòu)信息，并均與文獻報道[30]相符。另外，在NaOH堿解條件下，利用PMP衍生帶有核心α-1,3-巖藻糖基化的N-糖鏈，可以便捷地非還原性釋放N-糖鏈，解決了PNGase F酶不能有效酶切此類N-糖鏈的難題[31]。

O-糖鏈的解離、純化、分析也是糖組學(xué)研究中的重要內(nèi)容。因尚未發(fā)現(xiàn)有效的內(nèi)切酶，目前O-糖鏈的釋放主要采用β-消除法，但該方法易造成糖鏈的還原端連續(xù)降解(即peeling反應(yīng))，使得O-糖鏈的收率較低。采用PMP衍生化反應(yīng)可使解離下的O-糖鏈隨即被PMP保護，可有效抑制peeling反應(yīng)的發(fā)生[4,32-33]。如圖7所示，解離下的O-糖鏈被PMP標(biāo)記后，采用親水作用色譜(HILIC)和RP-HPLC對中性或帶唾液酸的糖鏈進行分離純化，不僅無唾液酸的丟失，而且分析時間短，可應(yīng)用于復(fù)雜O-糖鏈的定性和定量分析[34]。

圖6 牛胎球蛋白 N-糖鏈的d0/d5-PMP衍生物等摩爾混合物的ESI-MS圖[29]Fig.6 Mass spectrum of the equimolar mixture of d0-PMP-and d5-PMP-labeled N-glycans released from bovine fetuin by PNGase F[29]■GlcNAc(N-乙酰葡萄糖);○Man(甘露糖);□Gal(半乳糖);◆NeuNAc(N-乙酰神經(jīng)氨酸); ▲Fuc(巖藻糖)

圖7 PMP標(biāo)記的牛胎球蛋白中O-糖鏈的HILIC(A)及RP-HPLC(B)色譜圖[34]

Fig.7 HILIC(A) and RP-HPLC(B) chromatograms of PMP-labeled O-glycans derived from bovine fetuin[34]

6 結(jié)論與展望

PMP衍生化方法具有操作方便、條件溫和、靈敏度高、產(chǎn)物無立體異構(gòu)等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于糖類化合物的高靈敏度定性與定量分析領(lǐng)域。PMP柱前衍生高效液相色譜法可同時檢測多達11種單糖組成，可用于復(fù)雜多糖的結(jié)構(gòu)組成分析；不同聚合度的寡糖經(jīng)PMP衍生后可在色譜柱上得到更好的分離效果；采用PMP衍生和ESI-MSn聯(lián)用，根據(jù)特定的離子碎片和相對豐度比，可以清晰地區(qū)分不同二糖異構(gòu)體的連接方式和構(gòu)型；利用d0/d5-PMP同位素標(biāo)記可對糖鏈特別是對含有唾液酸的糖鏈進行相對定量分析；O-糖鏈與PMP衍生反應(yīng)可實現(xiàn)糖鏈解離和標(biāo)記同步進行，并可簡化步驟、抑制peeling反應(yīng)和增強質(zhì)譜的檢測靈敏度。隨著色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的不斷進步，PMP衍生方法將得到更為廣泛的應(yīng)用和發(fā)展，可以預(yù)見，該方法將會進一步為復(fù)雜糖類化合物的結(jié)構(gòu)鑒定和定量分析提供更好的技術(shù)支撐。

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Advance in 1-Phenyl-3-methyl-5-pyrazolone(PMP) Derivatization Analysis of Carbohydrates

ZHANG Lu-yao,ZHAO Xia*,CHEN Huan-huan

(Key Laboratory of Glycoscience and Glycotechnology of Shandong Province,Key Laboratory of Marine Drugs of Education Ministry,School of Medicine and Pharmacy,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

The structural research and composition analysis of carbohydrates play important roles in disclosing their biological functions.Meanwhile,the derivation analysis is an efficient approach for the qualitative and quantitative detection of carbohydrates with high sensitivity.This paper reviewed a derivative method using 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone(PMP) as reagent,which is mild,sensitive and highly selective,and is widely used in the analysis of monosaccharide composition,degree of polymerization，degree of substitute,disaccharides isomers ,as well as relative quantitation and structural identification of O-and N-glycans.

1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone(PMP);derivative approach;carbohydrate analysis；review

2015-08-26；

2015-09-25

國家基金委山東聯(lián)合基金(U1406402)；“十二五”國家科技支撐計劃項目(2013BAB01B02)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.03.020

O629.1；G353.11

A

1004-4957(2016)03-0367-06

*通訊作者：趙 峽，博士，教授，研究方向：糖類分析，Tel:0532-82031560，E-mail:zhaoxia@ouc.edu.cn