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      食品中A.hydrophila分析方法研究

      2016-12-20 03:54羅紅梅
      中國高新技術(shù)企業(yè) 2016年30期
      關(guān)鍵詞:分析方法探針核酸

      羅紅梅

      摘要:A.hydrophila原為水生細(xì)菌,廣泛存在于淡水,海水及各河海交會(huì)口,故水產(chǎn)食品常可分離出此菌。除了水產(chǎn)品外,各種生肉類和內(nèi)臟、即食肉類和生菜沙拉等此菌的檢出率為5.15%和22.83%。此外,生牛奶、鮮乳、乳酪和冰淇淋也可分離出A.hydrophila。文章對(duì)食品中的A.hydrophila分析方法進(jìn)行了研究。

      關(guān)鍵詞:食品;A.hydrophila分析方法;水生細(xì)菌;水產(chǎn)食品;食品檢測(cè) 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

      中圖分類號(hào):TQ317 文章編號(hào):1009-2374(2016)30-0067-02 DOI:10.13535/j.cnki.11-4406/n.2016.30.032

      1 Aeromonashydrophila基本特性

      Aeromonashydrophila屬于弧菌科(Vibrionaceae)Aeromonad屬,為革蘭氏陰性的兼性厭氧桿菌,直徑0.3~1.0μg/mL,長1.0~3.5μg/mL,具單一極鞭毛,有運(yùn)動(dòng)性。此菌為異營性(heterotrophic),能產(chǎn)生oxidase及catalase,并可利用某些碳水化合物產(chǎn)生酸或同時(shí)產(chǎn)氣(CO2、H2),亦會(huì)水解esculin。

      2 傳統(tǒng)分析方法

      2.1 利用培養(yǎng)基分離

      早期Aeromonas菌屬的分離大多采用分離腸內(nèi)菌屬或海洋弧菌屬的培養(yǎng)基,由于A.hydrophila具有l(wèi)actose(+)及l(fā)actose(-)的菌株,而用以分離腸內(nèi)病原菌的培養(yǎng)基中的碳水化合物成分,常會(huì)抑制Aeromonas菌屬的生長。因此,一般用分離腸內(nèi)菌的培養(yǎng)基MacConkeyagar或eosinmethyleneblueagar等并不適用。近年來,許多學(xué)者分別針對(duì)食品或水等不同的來源而發(fā)展出適用的培養(yǎng)基,且培養(yǎng)基中皆添加ampicillin來抑制其他雜菌的生長,更有利于Aeromonas菌屬的回收。例如在臨床上,對(duì)于此菌的分離大多采用5%sheepbloodagar,另外添加1030g/mL的ampicillin,配合此菌產(chǎn)生β-溶血素的能力來區(qū)分,皆較以往分離腸內(nèi)菌的培養(yǎng)基佳。且由于A.hydrophila氧化酵素反應(yīng)常與培養(yǎng)基成分有關(guān),而用sheepbloodagar并不會(huì)對(duì)此反應(yīng)造成干擾。對(duì)于食品中此菌的分離,同樣可以ampicillin(10g/mL)作為抑制劑,starch則是用以區(qū)分的受質(zhì),當(dāng)菌落形成后,加入Lugolsiodinesolution,菌落為amylase(+)者,即為A.hydrophila。此方法已被廣泛應(yīng)用于食品中A.hydrophila的分離,然而SA無法區(qū)分A.hydrophila與A.caviae。

      另外,Oxoid公司將XLD(xyloselysinedeoxycholate)修飾后發(fā)展出RyansAeromonasmediumbase,再添加5μg/mL ampicillin,專用以分離Aeromonas及Plesiomonas菌屬,前者為深綠色菌落,后者則為藍(lán)灰色菌落(OxoidproductcodesCM833)。以SA、SGAP(starchglutamateampicillinagar)及RAM(RyansAeromonasmedium)來比較食品中A.hydrophila的分離率,結(jié)果三種選擇性培養(yǎng)基皆有93%以上的分離率,并無顯著差異。

      Tsai和Chen(1996)以三種選擇性培養(yǎng)基SA、Bloodampicillinagar(BA)及OxoidAeromonasagar(OA)分離水產(chǎn)品中A.hydrophila,結(jié)果以BA分離出此菌的比率最高,SA及OA所得的典型菌落,經(jīng)生化測(cè)試后,許多菌落為A.sobria或A.caviae,顯示此兩種選擇性培養(yǎng)基對(duì)A.hydrophila、A.caviae以及A.veronii辨識(shí)度較差,可能是因?yàn)镺A中的ampicillin濃度較低所致。

      水中A.hydrophila的分離則大多采用,先將樣品增殖培養(yǎng)(enrichment)后,以膜過濾,再置于ADA上培養(yǎng)。而Holmes及Sartory(1993)以ADA、XAA、RAM及BIBA比較146個(gè)水樣中Aeromonasspp.的分離率,結(jié)果以ADA及RAM回收率較好。

      2.2 利用生化特性鑒定

      A.hydrophila的鑒定方法一般是參考BergeysManualofSystematicBacteriology進(jìn)行各種生化測(cè)試,例如oxidase、catalase、starchhydrolysis、fermentationofglucose、mannitol、fructose、galactose、dextrin及esculin水解等。然而傳統(tǒng)生化測(cè)試有其困難點(diǎn),A.hydrophila培養(yǎng)在不同培養(yǎng)基,對(duì)相同生化測(cè)試,不一定有相同的反應(yīng),且耗費(fèi)很多時(shí)間配制培養(yǎng)基,需要進(jìn)行繁復(fù)的測(cè)試,因此商業(yè)上發(fā)展了鑒定套組來加以確認(rèn)。于鑒定套組方面,可以通過比較API20E、APIRE及APINFT等套組,顯示API20E鑒定的正確率達(dá)100%,APIRE及APINFT分別只達(dá)77%及87%的正確率。于實(shí)際應(yīng)用時(shí),API20E亦可準(zhǔn)確鑒定出牡蠣、臨床及環(huán)境的A.hydrophila分離株,但是由于許多環(huán)境分離株未列入API資料檔,因此以API20E鑒定環(huán)境分離株時(shí),應(yīng)同時(shí)對(duì)一些重要生化反應(yīng),再輔以傳統(tǒng)生化測(cè)試方法以

      確認(rèn)。

      而對(duì)于API20E、APINE及Microbact24NE做比較,可以發(fā)現(xiàn)API20E鑒定的正確率只達(dá)72.5%,而APINE及Microbact24NE的正確率則皆達(dá)97.5%。另外,也可以GNMicroplate(BIOLOG,Hayward,Calif)測(cè)試60株臨床分離株(A.hydrophila、A.sobria及A.caviae各20株)對(duì)于95種碳源的氧化能力,認(rèn)為此套組能有效地鑒定出臨床的Aeromonas分離株。在傳統(tǒng)鑒定中,利用選擇性培養(yǎng)基分離出可疑菌落,以生化測(cè)試確認(rèn);而鑒定套組只能縮短生化測(cè)試的時(shí)間,仍需輔以傳統(tǒng)方法確認(rèn)。

      3 快速分析方法

      由于A.hydrophila的傳統(tǒng)分析方法,除了選擇性培養(yǎng)基多種選擇外,各種生化套組鑒定時(shí)仍需輔以傳統(tǒng)生化測(cè)試,耗時(shí)費(fèi)力,無法因應(yīng)工業(yè)界快速得知結(jié)果的要求。人們極欲發(fā)展此菌的核酸探針及免疫分析的快速分析方法。

      3.1 核酸探針

      A.hydrophila共含三個(gè)DNAhybridizationgroup,即HG1、HG2、HG3,由環(huán)境中分離的以HG3為主,病患檢體中分離的菌株,則以HG1為主。利用16SrRNA為引子,以PCR分析鑒定環(huán)境中的菌數(shù)與雜交的相關(guān)性,檢測(cè)67件樣品,顯示在海水(22/67)、溪水(3/67)、臨床檢體(0/67)的檢出率不高,且與其他菌株有交叉反應(yīng)。另外,探討由人的糞便分離Aeromonasspp.菌株的表現(xiàn)型與DNA的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)基因分類與表現(xiàn)型的鑒定有時(shí)檢測(cè)結(jié)果不一致,其建議當(dāng)表現(xiàn)型及一些生化測(cè)試不具特異性時(shí),需輔以基因的測(cè)試。為了發(fā)展核酸探針以快速分析A.hydrophila,必須先尋找A.hydrophila所特有的基因。從水域中的A.hydrophila找到其腸毒素基因,進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)A.hydrophila的腸毒素與霍亂毒素兩種基因的DNA核酸序列相似,因此不適合當(dāng)特異性的探針。

      利用A.hydrophila溶血基因建立了長度為48個(gè)寡核酸的探針,并另外由霍亂弧菌毒素基因建立了長度為34個(gè)核酸(C1)及19個(gè)寡核酸(C2)的探針,其首先以A.hydrophila溶血基因探針,利用菌落雜交法,找出呈陽性反應(yīng)的A.hydrophila菌落,抽取其染色體DNA后,再用南方轉(zhuǎn)移,再分別以霍亂毒素基因片段C1、C2為核酸探針進(jìn)行DNA雜交法,發(fā)現(xiàn)部分菌株與霍亂弧菌毒素探針(C1)有陽性反應(yīng),但對(duì)C2探針則為陰性反應(yīng),顯示霍亂弧菌毒素基因及水域菌株的溶血素基因的核酸序列相似。因此目前利用A.hydrophila溶血基因片段所建立的核酸探針法尚無法克服偽陽性反應(yīng)的問題。利用randomlyamplifiedpolymorphicDNA(RAPD)技術(shù)分類7株A.hydrophila菌株,經(jīng)PCR產(chǎn)生DNA,以SmaⅠ限制產(chǎn)生指紋圖譜,發(fā)現(xiàn)此7株菌在RAPD沒有一致性的片段,顯示其基因變化大。

      3.2 免疫分析法

      免疫分析法包含免疫沈淀法、免疫電泳法、免疫熒光法、放射性免疫分析法(RIA)和酵素免疫分析法(EIA),均已用于臨床及病原菌的抗原測(cè)定。放射性免疫分析法和酵素免疫分析法具有高敏感性。

      4 結(jié)語

      目前對(duì)A.hydrophila的分離與鑒定尚未標(biāo)準(zhǔn)化。早期Aeromonas菌屬的分離大多采用分離腸內(nèi)菌屬或海洋弧菌屬的培養(yǎng)基,然而如MacConkeyagar或eosinmethyleneblueagar中的碳水化合物會(huì)抑制部分A.hydrophila的生長,并不適用于分離。近年來,許多學(xué)者分別針對(duì)病人檢體、食品或水等不同來源的菌株而發(fā)展相關(guān)的培養(yǎng)基,且均利用ampicillin來抑制其他雜菌的生長。然而不論何種選擇性培養(yǎng)基,其上可疑菌落均必須經(jīng)過生化鑒定,方能確定為A.hydrophila。

      參考文獻(xiàn)

      [1] 石亞素,童國忠.甲魚嗜水氣單胞菌分離鑒定與藥敏試驗(yàn)[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2004,(5).

      [2] 李蓮瑞.嗜水氣單胞菌Aer毒素的研究進(jìn)展[J].塔里木農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào),2004,(3).

      [3] 鄭大海,麥康森.遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)研究概況[J].海洋湖沼通報(bào),2004,(1).

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