黨參抗腫瘤藥理作用研究

武靜蓮，徐 強(qiáng)，謝親建，白澤明，韓金萍，李曉芳，方曉霞

1甘肅省第三人民醫(yī)院，甘肅 蘭州730020；2武警甘肅省總隊(duì)醫(yī)院；3武威市人民醫(yī)院

黨參抗腫瘤藥理作用研究

武靜蓮1，徐 強(qiáng)2，謝親建2，白澤明3，韓金萍2，李曉芳3，方曉霞2

1甘肅省第三人民醫(yī)院，甘肅 蘭州730020；2武警甘肅省總隊(duì)醫(yī)院；3武威市人民醫(yī)院

目的：探討黨參多糖對肝癌細(xì)胞的活性。方法：M TT法探索黨參多糖對肝癌細(xì)胞的抑制作用，利用熒光顯微鏡檢測黨參多糖對肝癌細(xì)胞的凋亡作用、瑞氏-吉姆薩染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)、病理切片及急性毒性確定黨參多糖毒性。結(jié)果：黨參多糖對肝癌細(xì)胞SM M C-7721細(xì)胞具有抑制作用，細(xì)胞核固縮，有凋亡小體的出現(xiàn)，但是黨參多糖對昆明種小鼠的臟器沒有明顯的毒性。結(jié)論：黨參多糖具有抑制肝癌細(xì)胞SM M C-7721的作用。

黨參；肝癌細(xì)胞株；抗腫瘤

甘肅是全國中藥材種植基地，中藥材的有效成分含量高，特別適宜黨參、黃芪、當(dāng)歸等藥材的種植。黨參含有多糖、酚類、甾醇、揮發(fā)油、皂苷及微量生物堿等成分，它具有抗?jié)?、調(diào)整胃腸功能、強(qiáng)心、抗休克、增強(qiáng)造血的功能［1-3］。此外，研究發(fā)現(xiàn)黨參多糖具有抗腫瘤的作用［4-5］。近年來，筆者通過藥理實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)黨參多糖能夠抑制肝癌細(xì)胞SMMC-7721，且在抑制劑量范圍內(nèi)，黨參多糖對小鼠的臟器沒有損傷，現(xiàn)將結(jié)果報道如下：

1 材料與方法

1.1 材料 黨參購買于蘭州市黃河市場，產(chǎn)地：甘肅岷縣。經(jīng)蘭州大學(xué)藥學(xué)教研室馬志剛教授鑒定正品；SPF級昆明種小鼠，購自蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，體質(zhì)量(20±2)g，50只，3周齡，l8～20 g，雌雄各半。

1.2 儀器 SARTORIUS-BT23S分析天平 (北京賽多利斯有限責(zé)任公司提供)，KH-5200B超聲清洗器(昆山禾木超聲儀器有限公司提供)，UV722S紫外分光光度計、thermo CO2培養(yǎng)箱(美國賽默飛公司提供)，Multiskan Spectrum酶標(biāo)儀(美國賽默飛公司提供)。

1.3 試劑 小牛血清(四季青)，DMEM培養(yǎng)基(美國GIBCO公司提供)，SMMC-7721細(xì)胞株(甘肅省武威市人民醫(yī)院提供)。

1.4 方法

1.4.1 黨參多糖的制備方法 1)稱量黨參80 g，除去雜質(zhì)和霉變藥物，清水沖洗、曬干；2)切碎，將黨參切成2～4 cm的段放入煮缸煎煮，加入純水7～10倍，煎煮2～3次，每次2～3小時，過濾，合并濾液，濾渣干燥處理后即得飼料；3)濃縮、合并的濾液減壓濃縮至半流體，比重為1.25～1.26，溫度為70～80℃，放置冷卻；4)離心分離：將放置冷卻的濃縮液，離心分離得沉淀物和母液，而沉淀物用純水洗2次，每次加純水按沉淀物濕重的1/3～1/4，攪勻，離心分離，于60～80℃干燥，得黃色粉末狀沉淀物即黨參多糖提取物，黨參多糖含量60%以上；5)母液處理：合并3次分離所得母液，濃縮比重為1.25～1.26，溫度在70～80℃，黨參多糖含量2%以上；最后合并黨參多糖的濃縮液，混合均勻［3-9］。

1.4.2 M TT的方法 取肝癌細(xì)胞對數(shù)生長期的細(xì)胞［10-13］，計數(shù)、稀釋，最終細(xì)胞密度為1×105個/mL，接種于96孔板上，每孔加100 μL的細(xì)胞，接種24小時后，按照給藥劑量分為4、2、1、0.5、0.25 mg/mL共5組，培養(yǎng)24小時加藥，每孔加20 μL，每組設(shè)4個平行孔，空白組加培養(yǎng)液，培養(yǎng)48小時后，加入MTT和DMSO檢測，按以下公式計算：

抑制率=(正常對照組 -給藥組)／正常對照組

1.4.3 細(xì)胞核固縮的觀察 取肝癌細(xì)胞對數(shù)生長期的細(xì)胞，計數(shù)、稀釋，最終細(xì)胞密度為1×105個/mL，接種于6孔板上，每空加3 mL的細(xì)胞，接種24小時候，按照給藥劑量分1 200、600、300 μg/mL共3組，在培養(yǎng)24小時，每孔分別加300 μL的藥，空白組加等體積培養(yǎng)液，培養(yǎng)24小時后，收集細(xì)胞，用PBS洗滌1～2遍，用多聚甲醛固定15分鐘后，染色，當(dāng)染色液吹干后，蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察［14-15］。

1.4.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察 2.5×106細(xì)胞經(jīng)同一時間不同濃度或同一濃度不同時間的黨參多糖混懸液培養(yǎng)后收集，對照組加入最高黨參多糖劑量組藥量等體積的溶劑。PBS洗2遍，取少量細(xì)胞離心涂片，瑞氏-吉姆薩染色，光鏡下觀察形態(tài)。

1.4.5 病理切片的觀察 用昆明種小鼠做黨參多糖的急性毒性實(shí)驗(yàn)［14-15］，先用20只小鼠做急性毒性的預(yù)實(shí)驗(yàn)，然后把小鼠分成4組，分別為高、中、低劑量組和對照組，每組10只。2周以后，用斷頭法處死小鼠，用病理觀察方法觀察小鼠心、肝、肺。

1.4.6 小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn) 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，取禁食不禁水12小時的小鼠150只，雌雄各半，體質(zhì)量(20±2)g，平均分成15組給藥實(shí)驗(yàn)，分別采用單次靜脈注射給藥法，腹腔注射給藥法，灌胃給藥法測定各受試藥對小鼠產(chǎn)生的急性毒性，藥物質(zhì)量濃度最大為1 200 μg/mL，然后按1∶0.8依次稀釋作為其他組的濃度，按小鼠體質(zhì)量計算，注射體積分別為0.6、0.4、0.15 mL，全部藥量在45s內(nèi)注完，給藥后立即觀察各組動物反應(yīng)情況，連續(xù)觀察2周，記錄小鼠體質(zhì)量變化和中毒情況，按照改良寇氏綜合計算法的要求，根據(jù)公式：LD50=lg-1［lgDm-lgr(∑P-0.5)］計算黨參多糖溶液的半數(shù)致死量。

2 結(jié)果

2.1 黨參多糖體外肝癌的抑制率及對肝癌細(xì)胞核的影響 黨參多糖對肝癌細(xì)胞株SMMC-7721有抑制作用，并且隨著藥物濃度的增大，抑制率增大，特別是4 mg/mL時，抑制率達(dá)到了69.2%。見圖1。低劑量組出現(xiàn)核固縮，細(xì)胞核的形狀變形，凋亡小體不明顯；高劑量組凋亡小體明顯，而且出現(xiàn)大量的凋亡小體，細(xì)胞核固縮也十分明顯。見圖2。

圖1 黨參多糖對肝癌細(xì)胞的抑制率圖

圖2 藥物對肝癌細(xì)胞核的影響 H oechst 33258×200

2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 光學(xué)顯微鏡下觀察對照組細(xì)胞分布均勻，大小一致，見圖3-A。加入600 μg/mL的RPMI1640作用細(xì)胞12小時，可見細(xì)胞無變化。加入300 μg/mL的黨參多糖體積縮小，細(xì)胞不規(guī)則，細(xì)胞膜周邊有的形成小泡，正處于形成凋亡小體的過程中，見圖3-B。加入600μg/mL的黨參多糖體積縮小，細(xì)胞連接緊密不規(guī)則，細(xì)胞膜周邊有的形成小泡，正處于形成凋亡小體的過程中，見圖3-C。1 200 μg/mL的黨參多糖作用于SMMC-7721細(xì)胞12小時，可見細(xì)胞在形態(tài)上的變化，見圖3-D。為了進(jìn)一步觀察細(xì)胞核的形態(tài)變化，我們采用Hoechst 33258熒光染色法。正常細(xì)胞發(fā)出均勻的熒光，見圖3-A、B。1 200 μg/mL的黨參多糖作用于細(xì)胞12小時后，凋亡細(xì)胞核皺縮，熒光變得致密，可見明顯的粒狀熒光體聚集，為凋亡小體。

圖3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 H E×200

2.3 黨參多糖對小鼠臟器的影響 小鼠給藥7天后，黨參多糖提取液低濃度組心肌纖維排列整齊有序，未見斷裂、變性及壞死，見圖4-A。其余幾組黨參多糖提取液組均見心肌纖維斷裂溶解，有炎性細(xì)胞浸潤，大量出血，見圖4-B、C、D、E。原料組心肌纖維斷裂溶解，有炎性細(xì)胞浸潤，大量出血，見圖4-F。

圖4 黨參多糖對小鼠心臟的影響 H E×400

2.4 黨參多糖對昆明種小鼠的急性毒性結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)利用3種不同的給藥方式對黨參多糖溶液進(jìn)行比較，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1-3。

表1 小鼠腹腔注射(i p)黨參多糖溶液急性毒性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 小鼠灌胃(i g)黨參多糖溶液急性毒性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 小鼠靜脈注射(i v)雄黃浸出液急性毒性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

近年來，中藥的研究越來越多，中藥治療疾病的范圍越來越廣泛，特別是治療癌癥方面。筆者對黨參的主要活性成份黨參多糖和皂苷進(jìn)行了研究，結(jié)果表明黨參多糖確實(shí)具有抗癌的作用，且對小鼠臟器的損傷不大，說明黨參多糖的毒性小，藥理活性強(qiáng)，是治療癌癥的有效中藥成分。本研究通過形態(tài)學(xué)研究進(jìn)一步證實(shí)了黨參多糖的抗癌作用。但對于黨參多糖抗癌的機(jī)制還不清楚，有待于進(jìn)一步研究。

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Study on Antitwnor Effects of Dangshen

WU Jinglian1,XU Qiang2,XIE Qinjian2,BAI Zeming3,HAN Jinping2,LI Xiaofang3,FANG Xiaoxia2
1 The Third People's Hospital of Gansu Province,Lanzhou 730020,China;
2 Gansu Armed Police Hosipital;3 Wuwei People's Hospital

Objective:To investigate the activity of polysaceharides on liver cancer cells.Methods:MTT method was used to study the inhibition effect of codonopsis pilosula polysaccharide on liver cancer cells.The apoptosis effect of codonopsis pilosula polysaccharide on liver cancer cells was examined through Fluorescence microscopy. Codonopsis polysaccharide toxicity was determined through cells morphology observed by Wright's-Giemsa staining, pathological section and acute toxicity experiment.Results:Codonopsis pilosula polysaccharide had inhibition effect on hepatocellular carcinoma cell SMMC-7721 which could induce nucleus pyknosis and the appearance of apoptotic bodies.But codonopsis pilosula polysaccharide had little cytotoxic effect on organs of Kunming mice.Conclusion: Codonopsis pilosula polysaccharide has inhibition effect on hepatocellular carcinoma cell SMMC-7721.

Dangshen;hepatocellular carcinoma cell line;antitumor effect

R285.5

A

1004-6852(2016)08-0018-04

2016-03-09

武靜蓮(1970—)，女，副主任藥師。研究方向：中藥藥理學(xué)。