朱苗蕊，權(quán)卓，楊麗霞，程濤，張定華，高漢媛，孫文

1.蘭州石化總醫(yī)院，甘肅 蘭州 730060；2.解放軍第十醫(yī)院，甘肅 武威，733000；3.甘肅省中醫(yī)藥研究院，甘肅 蘭州 730050；4.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；5.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；6.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029

新加糖腎康對(duì)高糖環(huán)境下人腎小管上皮細(xì)胞α-平滑肌肌動(dòng)蛋白和E-鈣黏蛋白的影響

朱苗蕊1，權(quán)卓2，楊麗霞3，程濤3，張定華4，高漢媛5，孫文6

1.蘭州石化總醫(yī)院，甘肅 蘭州 730060；2.解放軍第十醫(yī)院，甘肅 武威，733000；3.甘肅省中醫(yī)藥研究院，甘肅 蘭州 730050；4.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；5.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；6.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029

目的 觀察新加糖腎康對(duì)高糖環(huán)境培養(yǎng)下人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2）α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）和E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的影響，探討其防治糖尿病腎間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制。方法 含10％胎牛血清1640培養(yǎng)基體外培養(yǎng)HK-2細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、高糖組、空白血清組和新加糖腎康低、中、高劑量組。藥物干預(yù)后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，ELISA檢測(cè)α-SMA和E-cadherin的含量。結(jié)果 與空白對(duì)照組比較，HK-2細(xì)胞經(jīng)高糖培養(yǎng)后細(xì)胞數(shù)量和α-SMA含量顯著增加、E-cadherin含量明顯降低（P＜0.05）；與高糖組比較，新加糖腎康組α-SMA含量降低、E-cadherin含量增加、細(xì)胞增殖受到抑制。結(jié)論 新加糖腎康能夠抑制腎小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化及細(xì)胞增殖，具有防治糖尿病腎間質(zhì)纖維化的作用。

新加糖腎康；高糖；人腎小管上皮細(xì)胞；表型轉(zhuǎn)化；細(xì)胞增殖

糖尿病腎?。―N）是糖尿病常見的慢性微血管并發(fā)癥之一，其發(fā)病率高、危害大，在糖尿病所有并發(fā)癥中占主要地位。但其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。既往研究認(rèn)為，早期DN病變?cè)谀I小球部位，而近年來研究發(fā)現(xiàn)，腎小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化引起的腎間質(zhì)纖維化與其關(guān)系更為密切[1]。中藥復(fù)方新加糖腎康是在甘肅省中醫(yī)院劉國安和張定華研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合北京中醫(yī)藥大學(xué)劉銅華教授治療DN的學(xué)術(shù)思想，經(jīng)組方優(yōu)化，最終確立的臨床經(jīng)驗(yàn)方，具有益氣養(yǎng)陰、清熱祛濕、活血化瘀的功效。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，新加糖腎康能夠減少高糖環(huán)境培養(yǎng)下人腎小管上皮細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)成分Ⅰ型膠原（ColⅠ）、Ⅲ型膠原（Col Ⅲ）和纖連蛋白（FN）的分泌與沉積，并能調(diào)控纖維化因子基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）及其抑制劑-1（TIMP-1）的分泌與釋放[2-3]。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，觀察其對(duì)高糖環(huán)境下培養(yǎng)人腎小管上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）和E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的影響，進(jìn)一步探討其對(duì)DN腎間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物與細(xì)胞株

SPF級(jí)雄性Wistar大鼠20只，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK（甘）2004-0006，飼養(yǎng)于甘肅省中醫(yī)藥研究院中藥研究所動(dòng)物室。人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2），上海斯信生物科技有限公司，甘肅省中醫(yī)藥研究院中心實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)室培養(yǎng)。

1.2 藥物

新加糖腎康主要組成為黃芪、生地黃等，所有飲片購于甘肅省中醫(yī)院藥劑科，水提醇沉，冷藏備用。

1.3 主要試劑與儀器

人α-SMA ELISA試劑盒（批號(hào)E1208Hu）、E-cadherin ELISA試劑盒（批號(hào)E0209Hu），上海晶天生物科技有限公司；1640培養(yǎng)基（批號(hào)1237579）、胎牛血清（批號(hào)12657-029），Gibco公司；D-葡萄糖，汕頭西隴化工廠有限公司，用時(shí)配成30 mmol/L濃度。CO2培養(yǎng)箱（日本SANYO），SW-CJ-2FD超凈生物安全柜（蘇凈安泰），IX51倒置顯微鏡（日本Olympus），MS352酶標(biāo)儀（芬蘭Labsystems），-80 ℃ MDF-U53V超低溫冰箱（日本SANYO）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 新加糖腎康藥物血清制備

雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組和藥物組，每組10只。藥物組采用新加糖腎康灌胃，劑量為成人臨床用量的6.5倍；空白對(duì)照組采用等體積生理鹽水灌胃。每次灌胃1 mL/100 g體質(zhì)量。早晚各1次，連續(xù)3 d。最后1次灌胃前禁食不禁水，灌胃30 min后，大鼠股動(dòng)脈無菌采血，冷凍離心，吸取血清，裝入EP管中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

HK-2 細(xì)胞于37 ℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10％胎牛血清1640培養(yǎng)基。每日鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，及時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長融合達(dá)到80％以上，用含0.25％胰蛋白酶、0.05％EDTA消化液消化，鏡下觀察細(xì)胞消化程度，及時(shí)拍落消化細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基終止消化，1000 r/min離心5 min，用新鮮培養(yǎng)基將細(xì)胞吹打均勻后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為6組，空白對(duì)照組由1640培養(yǎng)液培養(yǎng)；高糖組在1640培養(yǎng)液中加入30 mmol/L D-葡萄糖，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行高糖環(huán)境下培養(yǎng)；空白血清組在高糖組的基礎(chǔ)上，加入10％空白血清，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)性培養(yǎng)；新加糖腎康低劑量組在高糖組的基礎(chǔ)上，加入5％新加糖腎康藥物血清，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)性培養(yǎng)；新加糖腎康中劑量組在高糖組的基礎(chǔ)上，加入10％新加糖腎康藥物血清，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)性培養(yǎng)；新加糖腎康高劑量組在高糖組的基礎(chǔ)上，加入20％新加糖腎康藥物血清，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)性培養(yǎng)。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 細(xì)胞α-平滑肌肌動(dòng)蛋白和E-鈣黏蛋白表達(dá)檢測(cè) 將傳代培養(yǎng)的細(xì)胞吹打均勻，接種在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔劑量為1 mL細(xì)胞懸液，每組3孔，接種2板。2 h后鏡下觀察細(xì)胞貼壁狀態(tài)，12 h后觀察各組細(xì)胞外表形態(tài)，初步判斷藥物作用。培養(yǎng)24 h后吸棄上清液，每組加入1 mL含藥培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)24、48 h時(shí)，仔細(xì)吸取每孔細(xì)胞上清液于1.5 mL EP管中，4 ℃、4000 r/min離心10 min，取上清液，低溫保存待測(cè)。按ELISA試劑盒說明書檢測(cè)。檢測(cè)前將所有樣本置于室溫下慢慢融化，然后在反應(yīng)條孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)標(biāo)本，每孔劑量為100 μL?？瞻讓?duì)照孔加入100 μL稀釋液。在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育，洗滌反應(yīng)板，最后加酶標(biāo)抗體進(jìn)行酶聯(lián)免疫反應(yīng)。反應(yīng)終止后，以空白對(duì)照孔調(diào)零，于酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定各孔光密度（OD）值。

2.3.2 細(xì)胞增殖檢測(cè) 將傳代培養(yǎng)的細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，每組接種6孔，接種3板。顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁狀態(tài)，培養(yǎng)過夜，棄上清液，每組加入含藥培養(yǎng)液100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)。分別在24、48、72 h時(shí)各取出一板細(xì)胞，棄上清液，加入1 mg/mL MTT 100 μL，繼續(xù)孵育4 h。棄上清液，加入100 μL DMSO，振蕩10～15 min，使培養(yǎng)板中的紫藍(lán)色結(jié)晶體溶解。于酶標(biāo)儀492 nm處測(cè)定各組細(xì)胞OD值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，多組間比較采用方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 新加糖腎康對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞α-平滑肌肌動(dòng)蛋白和E-鈣黏蛋白的影響

正常培養(yǎng)HK-2細(xì)胞在高糖培養(yǎng)環(huán)境下，細(xì)胞表型標(biāo)志蛋白表達(dá)發(fā)生改變，原上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-cadherin含量降低，成纖維細(xì)胞標(biāo)志蛋白α-SMA含量顯著增加（P＜0.05）。經(jīng)新加糖腎康干預(yù)后，α-SMA含量降低，而E-cadherin含量增加，藥效隨藥物劑量和作用時(shí)間增加而增強(qiáng)，新加糖腎康各劑量組48 h時(shí)效果更顯著，與高糖組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果見表1、表2。

表1　各組HK-2細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)α-SMA含量比較（±s，ng/mL）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05；與高糖組比較，△P＜0.05

組別 n 24 h 48 h空白對(duì)照組 3 0.510±0.074 0.602±0.096高糖組 3 1.840±0.073*2.279±0.112*空白血清組 3 0.621±0.058△0.549±0.184△新加糖腎康低劑量組 3 1.752±0.150*1.420±0.072*△新加糖腎康中劑量組 3 1.681±0.121*1.435±0.053*△新加糖腎康高劑量組 3 1.607±0.069*1.373±0.180*△

表2　各組HK-2細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)E-cadherin含量比較（±s，ng/mL）

表2　各組HK-2細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)E-cadherin含量比較（±s，ng/mL）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05；與高糖組比較，△P＜0.05

組別 n 24 h 48 h空白對(duì)照組 3 1778.696± 207.815 2739.416±719.746高糖組 3 1068.045±1050.648*1060.981±265.517*空白血清組 3 1871.942± 353.016△1982.143±541.082△新加糖腎康低劑量組 3 822.214± 337.227*1014.358±676.064*新加糖腎康中劑量組 3 1012.945± 383.443*1285.620±186.894*△新加糖腎康高劑量組 3 843.406± 700.751*1380.279±262.785*△

4.2 新加糖腎康對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞細(xì)胞增殖的影響

正常培養(yǎng)HK-2細(xì)胞在高糖環(huán)境下，細(xì)胞數(shù)量顯著增加，并隨高糖培養(yǎng)時(shí)間的增加，細(xì)胞增殖更加顯著，與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；經(jīng)新加糖腎康干預(yù)后，細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞增殖在一定程度上受到抑制，新加糖腎康中、高劑量組效果更為明顯，與高糖組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果見表3。

表3　各組HK-2細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖比較（±s，OD值）

表3　各組HK-2細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖比較（±s，OD值）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05；與高糖組比較，△P＜0.05

組別 n 24 h 48 h 72 h空白對(duì)照組 6 0.168±0.006 0.169±0.007 0.188±0.007高糖組 6 0.215±0.010*0.217±0.015*0.219±0.019*空白血清組 6 0.187±0.006△0.188±0.020△0.173±0.007△新加糖腎康低劑量組6 0.212±0.020*0.206±0.029*0.208±0.014*新加糖腎康中劑量組6 0.195±0.005*△0.194±0.007*△0.193±0.006△新加糖腎康高劑量組6 0.193±0.022*△0.189±0.005*△0.182±0.021△

5 討論

DN屬中醫(yī)“消渴”“腎病”范疇，根據(jù)臨床表現(xiàn)其類似于中醫(yī)古籍中的“水腫”“脹滿”“尿濁”等病證。金元時(shí)期著名醫(yī)家劉河間《三消論》指出：“夫消渴者，多變?yōu)槊@盲瘡癬痤疿之類，或水液妄行而面上腫也。”再如《圣濟(jì)總錄》有云：“消渴病久，腎氣受傷，腎主水，腎氣虛衰，氣化失常，開闔不利，水液凝聚體內(nèi)而出現(xiàn)水腫?！鄙鲜鼋灾赋鱿嗜站眉纯砂l(fā)生傳變?yōu)樗[，這與現(xiàn)代DN的臨床表現(xiàn)極為相似。有關(guān)DN的中醫(yī)病機(jī)，古代醫(yī)家的觀點(diǎn)多集中在“腎虛血瘀”，并一致認(rèn)為其基本病機(jī)表現(xiàn)為本虛標(biāo)實(shí)，本虛一般指陰虛、陽虛、肺虛、腎虛等先天稟賦不足；標(biāo)實(shí)主要指痰、濁、濕、瘀等后天病理因素。

近年來，有關(guān)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的研究在DN中越來越多，并取得了一定的研究成果。研究認(rèn)為，腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化引起的腎間質(zhì)纖維化、細(xì)胞外基質(zhì)成分積聚等病理改變，是DN的基礎(chǔ)特征。腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，即表型轉(zhuǎn)化，在DN的發(fā)展演變過程中起重要作用。表型轉(zhuǎn)化主要是指當(dāng)機(jī)體組織細(xì)胞所處的外界環(huán)境發(fā)生變化后，細(xì)胞本來特有的表性特征發(fā)生改變，細(xì)胞獲取一種新的表型特征，由一種表型轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N表型，也就是變成另一種細(xì)胞。

有研究表明，肌成纖維細(xì)胞是腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的主要細(xì)胞類型[4]，是細(xì)胞外基質(zhì)成分合成的最主要細(xì)胞。腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞的病理特點(diǎn)有：首先上皮細(xì)胞的細(xì)胞間隙變寬，細(xì)胞間黏附狀態(tài)漸漸消失，細(xì)胞拉長成梭狀，細(xì)胞特征性標(biāo)志蛋白發(fā)生改變，主要表現(xiàn)為上皮細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白E-cadherin的表達(dá)消失，肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志蛋白α-SMA的表達(dá)出現(xiàn)；在細(xì)胞形態(tài)改變的同時(shí)伴隨腎小管基底膜結(jié)構(gòu)的大范圍破壞，細(xì)胞失去基底膜的牽拉約束，活動(dòng)力逐漸增強(qiáng)，離開固有位置向間質(zhì)移行，到達(dá)間質(zhì)后開始分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)成分[5]，引起局部組織的纖維化進(jìn)程。因此，α-SMA和E-cadherin成為研究DN腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的關(guān)鍵指標(biāo)。

新加糖腎康方中黃芪、生地黃益氣養(yǎng)陰，為君藥；槐米、大黃清熱祛濕，為臣藥；益母草、山楂、水蛭活血化瘀，為佐藥。其中水蛭為新增蟲類藥，加強(qiáng)了組方的活血化瘀作用。研究發(fā)現(xiàn)，正常HK-2細(xì)胞E-cadherin的含量較高，而α-SMA幾乎沒有，在高糖環(huán)境培養(yǎng)下，細(xì)胞數(shù)量顯著增加，呈增殖狀態(tài)，肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志物α-SMA含量顯著增加，而上皮細(xì)胞的標(biāo)志蛋白E-cadherin含量顯著下降，說明HK-2細(xì)胞在高糖環(huán)境下細(xì)胞表型發(fā)生了轉(zhuǎn)變。但在新加糖腎康藥物血清干預(yù)后，α-SMA含量開始減少，E-cadherin含量逐漸上升，細(xì)胞增殖受到抑制。結(jié)果表明，新加糖腎康具有抑制腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的作用，這可能是其治療DN的機(jī)制所在。

[1]李能娟,李紅.腎小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化與糖尿病腎病[J].國際內(nèi)分泌代謝雜志,2006,26(4)：277-279.

[2]朱苗蕊,楊麗霞,薛建軍,等.新加糖腎康對(duì)高糖環(huán)境下HK-2細(xì)胞外基質(zhì)成分沉積的作用研究[J].中醫(yī)研究,2015,28(3)：56-58.

[3]柴青春,楊麗霞,薛建軍,等.糖腎康對(duì)高糖誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶-9及其抑制劑-1的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志, 2014,21(10)：58-60.

[4]楊麗霞,李彧,王謙,等.姜黃素對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及分泌細(xì)胞外基質(zhì)成分的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志,2008, 9(12)：1040-1043.

[5]FAN J M, NG Y Y, HILL P A, et al. Transfoming growth factor-beta regulates tubular epithelial-myofibroblast transdifferentiation in vitro[J]. Kid Int,1999,56：1455-1467.

Effects of New Tangshenkang on α-SMA and E-cadherin of Human Renal Tubular Epithelial

Cell HK-2 in High Concentrations of Glucose

ZHU Miao-rui1, QUAN Zhuo2, YANG Li-xia3, CHENG Tao3,

ZHANG Ding-hua4, GAO Han-yuan5, SUN Wen6(1. Lanzhou Petrochemical General Hospital, Lanzhou 730060, China; 2. Tenth Chinese People's Liberation Army Hospital, Wuwei 733000, China; 3. Gansu Province Academy of Chinese Medicine, Lanzhou 730050, China; 4. Gansu Province Hospital of TCM, Lanzhou 730050, China; 5. Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China; 6. Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China)

Objective To observe he effects of new Tangshenkang on α-SMA and E-cadherin of human renal tubular epithelial cell HK-2 in high concentrations of glucose; To explore the mechanism of new Tangshenkang on the prevention and treatment of diabetic renal fibrosis. Methods The HK-2 cells were cultured and divided into control group, high glucose group, animal serum control group, new Tangshenkang low-, medium-, and high-dosage group. After medicine intervention, cell proliferation was tested by MTT assay, and contents of α-SMA and E-cadherin were observed by ELISA assay. Results Compared with control group, α-SMA of HK-2 cultured with high glucose was much notable, but the content of E-cadherin significantly decreased, with statistical significance (P<0.05). The content of α-SMA of HK-2 cultured with new Tangshenkang decreased, and the content of E-cadherin increased; cell proliferation was markedly inhibited in culture medium supernatant of HK-2 cells cultured with high glucose plus new Tangshenkang compared with only high glucose, with statistical significance. Conclusion New Tangshenkang can inhibit cell proliferation and epithelial-myofibroblast transdifferentiation of HK-2 cell induced by high glucose, and prevent the development of diabetic renal fibrosis to a certain extent.

new Tangshenkang; high glucose; human renal tubular epithelial cell HK-2; epithelial-myofibroblast transdifferentiation; cell proliferation

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.03.015

R285.5

A

1005-5304(2016)03-0054-04

國家自然科學(xué)基金（81202971）；甘肅省中醫(yī)藥科技研究課題（GZK-2011-13）

楊麗霞，E-mail：yanglixia-415@163.com

（2015-04-21；編輯：華強(qiáng)）