參芪抑瘤方藥物血清對胃癌MKN-45細胞周期阻滯及抗侵襲轉移的影響

馬春林，吳紅彥，2，3，李海龍，2，陳杰，張宣

1.甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中醫(yī)方藥挖掘和創(chuàng)新轉化重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅省中藥新產品創(chuàng)制工程實驗室，甘肅 蘭州 730000

參芪抑瘤方藥物血清對胃癌MKN-45細胞周期阻滯及抗侵襲轉移的影響

馬春林1，吳紅彥1，2，3，李海龍1，2，陳杰1，張宣1

1.甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中醫(yī)方藥挖掘和創(chuàng)新轉化重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅省中藥新產品創(chuàng)制工程實驗室，甘肅 蘭州 730000

目的 探討不同濃度參芪抑瘤方藥物血清對胃癌MKN-45細胞周期阻滯及抗侵襲轉移作用的相關機制。方法 60只SPF級Wistar大鼠，隨機分為對照組和參芪抑瘤方低、中、高劑量組，每組15只。參芪抑瘤方低、中、高劑量組分別給予0.25、0.50、1.00 g原藥材/mL藥液灌胃，空白組給予等量飲用水灌胃，每日2次，連續(xù)7 d，末次灌胃2 h后取血，分離血清。MKN-45細胞經不同濃度藥物血清處理后，流式細胞術檢測細胞周期，免疫組化檢測COX-2、PTEN蛋白表達。結果 藥物血清干預后細胞G0～G1期比例增加，S期比例減少；藥物血清可降低MKN-45細胞COX-2蛋白陽性表達率，升高PTEN蛋白陽性表達率（P＜0.05）。結論 參芪抑瘤方藥物血清阻滯細胞周期及抗侵襲轉移作用可能與影響COX-2、PTEN蛋白表達有關。

參芪抑瘤方；胃癌；MKN-45細胞；細胞周期；COX-2蛋白；PTEN蛋白；大鼠

中醫(yī)藥防治惡性腫瘤方面，近年來顯示出了一定優(yōu)勢，并越來越受到關注。當歸貝母苦參丸出自《金匱要略》，原用于治療妊娠小便困難。現代研究顯示，其對肝癌、胃癌細胞等有明顯的抑制作用[1-3]。參芪抑瘤方為臨床經驗方，用于多種腫瘤疾病的治療，由當歸貝母苦參丸加黃芪、全蝎、山慈菇等組成，契合了腫瘤正氣不足，痰（濕）濁、癌毒、瘀血內阻的發(fā)病機制[4]。方中藥材所含有效成分黃芪多糖、當歸多糖、貝母堿、苦參堿等對多種癌細胞有明顯的抑制作用[5-8]。本實驗在前期研究基礎上，進一步探索其抗腫瘤的相關作用機制，為抗腫瘤中藥研發(fā)提供一定的實驗依據。

1 實驗材料

1.1 動物

60只SPF級Wistar大鼠，雌雄各半，6～8周齡，體質量（200±20）g，甘肅中醫(yī)藥大學科研中心動物實驗室，合格證號SYXK（甘）2001-0001。室溫20～25 ℃、濕度45%～55%分籠飼養(yǎng)，喂標準飼料（甘肅中醫(yī)藥大學科研中心動物實驗室提供），自由飲水。

1.2 藥物和細胞

參芪抑瘤方由苦參、黃芪、山慈菇、全蝎、當歸、浙貝母等組成，所有飲片購自甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中藥房，經甘肅中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室楊扶德教授鑒定符合《中華人民共和國藥典》規(guī)定。胃癌MKN-45細胞，中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所提供。

1.3 主要試劑與儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibco公司），四季青胎牛血清（杭州四季青公司），胰蛋白酶（Gibco公司），二抗（中杉金橋生物技術有限公司），RNAisoTMPlus（D9810A），the PrimeScript RT reagent、kit（DRRO37A），SYBR Premix Ex TaqTM（DRR081A，TakarBio），國產分析純試劑（北京化學試劑公司）。細胞培養(yǎng)箱（上海申力，HF212），高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司，5804R），倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司，CKX41+DP21），流式細胞儀（美國COULTER EPICS XL）。

2 實驗方法

2.1 分組、給藥及藥物血清制備

將60只SPF級Wistar大鼠隨機分為對照組和參芪抑瘤方低、中、高劑量組，每組15只。參芪抑瘤方低、中、高劑量組予0.25、0.50、1.00 g原藥材/mL藥液灌胃，對照組予等量飲用水灌胃。給藥體積均為1.5 mL/100 g，每日2次，連續(xù)7 d。末次灌胃2 h后取血，3000 r/min低溫離心15 min，分離血清，0.22 μm微孔濾膜過濾，56 ℃、30 min滅活，-80 ℃保存。

2.2 細胞培養(yǎng)

MKN-45細胞經常規(guī)傳代培養(yǎng)，采用含10%滅火胎牛血清及青鏈霉素（100 U/mL）的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中貼壁生長，每2～3 d換液1次。倒置顯微鏡下觀察細胞情況，當生長狀態(tài)良好且鋪滿瓶底時，采用25%胰酶消化、傳代，并取處于對數生長期細胞進行實驗。

2.3 流式細胞術檢測MKN-45細胞周期

取對數生長期的MKN-45細胞接種于6孔板中，增殖為80%時，加入20%藥物血清處理48 h，檢測前用胰酶消化，1500 r/min離心5 min，棄上清液，PBS洗2次，70%乙醇固定，4 ℃固定過夜。用PBS配制成單細胞懸液，50 μg/mL碘化丙啶染色液室溫染色30 min后，流式細胞儀分析細胞周期。

2.4 免疫組化檢測MKN-45細胞COX-2、PTEN蛋白表達

將無菌10 mm×10 mm的24片蓋玻片置入24孔培養(yǎng)板中，取對數生長期的MKN-45細胞消化后，制成單細胞懸液，以500 μL/孔接種于24孔培養(yǎng)板中。待細胞貼壁后，對照組加50 μL完全培養(yǎng)基，余孔依次加空白血清和高、中、低劑量藥物血清各50 μL，每組設3個復孔。細胞爬滿蓋玻片后，取爬片浸入4%多聚甲醛中過夜。用PBS洗3次，5 min/次，加50 μL 0.1%Triton X-100室溫下孵育15 min后，再用PBS洗5 min×3次，加3%H2O2室溫下孵育30 min，繼續(xù)用PBS洗5 min×3次，滴加50 μL 5%BSA封閉液。室溫封閉20 min后，甩去多余液體，滴加50 μL稀釋過的Rabbit Anti-collagen TypeⅡ（1∶100），置濕盒中4 ℃孵育過夜。并以PBS代替一抗，作為陰性對照，PBS洗3次，2 min/次，加生物素化山羊抗兔IgG，37 ℃孵育20 min，再用PBS洗2 min×3次。然后加SABC，37 ℃繼續(xù)孵育20 min，PBS洗5 min×4次。DAB顯色，自來水沖洗1 min。蘇木素復染5 min，0.5%鹽酸乙醇分化10 s，氨水返藍10 s。梯度乙醇脫水干燥，每一梯度5 min，二甲苯透明10 s，甘油封片。倒置相差顯微鏡觀察爬片，每組選6張爬片，每張爬片選擇3個高倍視野照相，用Leica Qwin病理圖像分析系統(tǒng)對所拍照片進行分析，測定相對灰度值。

3 統(tǒng)計學方法

4 結果

4.1 參芪抑瘤方藥物血清對MKN-45細胞周期的影響

10%濃度藥物血清處理后MKN-45細胞較對照組細胞G0/G1期比例升高，S期低于對照組，見表1、圖1。表明藥物血清可有效抑制細胞進入增殖周期，降低細胞S期，阻滯細胞于G0～G1期。

表1 各組MKN-45細胞細胞周期分布比較（%）

圖1 各組MKN-45細胞流式細胞圖

4.2 參芪抑瘤方藥物血清對MKN-545細胞COX-2、PTEN蛋白表達的影響

對照組細胞COX-2以強陽性和陽性表達為主，而藥物血清干預組細胞著色逐漸變淺，COX-2呈弱陽性或陰性表達；對照組細胞著色較淺，PTEN呈弱陽性或陰性表達，藥物血清干預組細胞著色逐漸變深，PTEN表達逐漸增強，呈強陽性或陽性表達，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結果見表2、圖2和圖3。

表2 各組MKN-45細胞COX-2、PTEN蛋白表達比較（±s，%）

表2 各組MKN-45細胞COX-2、PTEN蛋白表達比較（±s，%）

注：與對照組比較，▲P＜0.05

組別 n COX-2 PTEN對照組 18 0.22±0.12 1.02±0.01空白血清組 18 0.20±0.01 0.99±0.02低劑量組 18 0.45±0.02▲0.78±0.03▲中劑量組 18 0.69±0.04▲0.57±0.01▲高劑量組 18 0.89±0.03▲0.23±0.01▲

圖2 各組MKN-45細胞COX-2蛋白表達（免疫組化染色，×400）

圖3 各組MKN-45細胞PTEN蛋白表達（免疫組化染色，×400）

5 討論

胃癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多因素、多步驟、多基因參與的復雜病理過程。正常情況下，胃黏膜上皮細胞的增殖和凋亡之間保持動態(tài)平衡。這種平衡的維持有賴于癌基因、抑癌基因及一些細胞因子等共同調控。多種因素會影響上述調控體系，共同參與胃癌的發(fā)生。

中醫(yī)認為，胃癌是牽涉整體的全身性疾病的局部表現，多由先天稟賦不足、邪毒侵襲、痰凝血瘀等因素，引起機體陰陽失衡，臟腑經絡功能失調，進而導致局部癌變。其主要病機為本虛標實，本虛為素體虛弱或先天稟賦因素，標實不外乎氣滯、血瘀、痰凝、毒聚。中醫(yī)藥治療在個體化、多層次、多靶點控制腫瘤生長、抗轉移、減少復發(fā)等方面具有獨到的優(yōu)勢，是胃癌的重要輔助治療方法。胃癌早期采用中西醫(yī)結合治療，可有效逆轉病情的惡化。利用中醫(yī)藥的整體調節(jié)作用，胃癌術后放化療過程中，使患者對放化療藥物的耐受性增強，免疫功能得到提高，抑瘤效果得以強化，痛苦明顯緩解，生存期延長，生活質量提高。

COX-2是前列腺素合成關鍵限速酶環(huán)氧合酶的一種亞型，近年來研究發(fā)現，COX-2高表達與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關，在腫瘤細胞增殖、凋亡過程中起重要作用，其表達可延長癌細胞的生存期，促進腫瘤細胞侵襲轉移。在正常胃黏膜COX-2幾乎不表達，而在胃癌變時則過表達，對胃癌細胞的異常增殖、細胞凋亡、抑制血管形成及轉移復發(fā)有重要生物學作用。COX-2過表達可上調黏附因子、基質金屬蛋白酶等促進腫瘤細胞發(fā)生浸潤與轉移；上調腫瘤細胞周圍血管生成因子，促進腫瘤血管生成。研究表明，其在正常胃黏膜、淺表性胃炎、萎縮性胃炎伴腸化、不典型增生及胃癌組織中的表達呈逐漸遞增趨勢[9]。

作為抑癌基因的PTEN低表達會激活PPI3K-Ark信號通路，從而縮短細胞的分裂周期，促進細胞增殖，與腫瘤細胞浸潤、轉移密切相關[10]。PTEN的表達過低、受到抑制或缺失都會誘導腫瘤細胞的無限增殖，從而促進腫瘤的發(fā)生[11-13]。PTEN蛋白的表達與淋巴結轉移、侵襲程度密切相關。胃癌組織中PTEN蛋白的檢測可了解與判斷腫瘤增生、侵襲及轉移的能力和程度。

綜上，參芪抑瘤方藥物血清能明顯阻滯胃癌細胞于G0/G1期，減少S期細胞數量，有效抑制細胞進入增殖周期，誘導胃癌細胞周期阻滯。參芪抑瘤方藥物血清可能通過抑制COX-2的表達從而抑制血管內皮生長因子的活性，降低細胞間E-鈣黏蛋白活性，減弱腫瘤細胞的侵襲能力，也可能通過升高PTEN的表達量，使其去磷酸化作用增強，進而抑制細胞周期，誘導細胞凋亡和分化，抑制腫瘤細胞轉移等，從而發(fā)揮抗胃癌細胞侵襲轉移的作用。

[1] 舍雅莉,閆德祺,劉永琦,等.當歸貝母苦參丸對順鉑化療H22荷瘤小鼠腫瘤及肝臟、腎臟和胸腺組織病理形態(tài)的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2014,21(5)：56-60.

[2] 閆德祺,劉永琦,李應東,等.當歸貝母苦參丸對順鉑化療H22荷瘤小鼠的抑瘤作用及對血清HIF-1α和LDH的影響[J].中成藥,2014,36(7)：1351-1355.

[3] 石金鳳,李海龍,吳紅彥,等.當歸貝母苦參丸含藥血清對胃癌細胞SGC-7901和侵襲轉移能力和周期的影響[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報, 2014,16(10)：30-33.

[4] 梁云麒,沈克平,胡兵.中醫(yī)胃癌病機與治法研究[J].中華中醫(yī)藥學刊, 2014,32(3)：513-515.

[5] GUO L, BAI S P, ZHAO L, et al. Astragalus polysaccharide injection integrated with vinorelbine and cisplatin for patients with advanced non-small cell lung cancer：effects on quality of life and survival[J]. Med Oncol,2012,29(3)：1656.

[6] 吳素珍,李加林,陳水親,等.硫酸酯化當歸多糖抗腫瘤實驗研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2012,23(2)：319-320.

[7] 劉琦,程旭鋒,張新峰,等.山慈菇-蜂房藥對抑制人乳腺癌MDA-MB-231細胞體外侵襲轉移的機理研究[J].中藥新藥與臨床藥理,2014,25(4)：389-392.

[8] 王晶娟,張貴君,吳明俠,等.全蝎蛋白藥效組分對HepG2細胞的體外抑制作用[J].藥物分析雜志,2011,31(1)：71-74.

[9] TATSUGUCHI A, MATSUI K, SHINJI Y, et al. Cyclooxygenase-2 expression correlates with angiogenesis and apoptosis in gastric cancer tissue[J]. Hum Pathol,2004,35：488.

[10] WANG S I, PARSONS R, ITTMANN M, et al. Homozygous deletion of PTEN tumor suppressor gene in a subset of prostate adenocarcinoma[J]. Clin Cancer Res,1998,4(6)：811-815.

[11] TIBAREWAL P, ZILIDIS G, SPINELLI L, et al. PTEN protein phosphatase activity correlates with control of gene expression and invasion, a tumor-suppressing phenotype, but not with AKT activity[J]. Sci Signal,2012,213：18.

[12] ZHENG H, TAKAHASHI H, MURAI Y, et al. Low expression of FHIT and PTEN correlates with malignancy of gastric carcinomas：tissue-array findings[J]. Appl Immunohistochem Mol Morphol,2007, 15(4)：432-440.

[13] ZHANG B G, LI J F, YU B Q, et al. MicroRNA-21 promotes tumor proliferation and invasion in gastric cancer by targeting PTEN[J]. Oncol Rep,2012,27(4)：1019-1026.

Effects of Shenqi Yiliu Decoction Medicated Serum on Blocking Cell Cycle and Inhibiting

Invasion and Metastasis of Gastric Cancer Cell Lines MKN-45

MA Chun-lin1, WU Hong-yan1,2,3,

LI Hai-long1,2, CHEN Jie1, ZHANG Xuan1(1. Gansu University of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China; 2. Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Excavation Innovation and Transformation of Gansu Province, Lanzhou 730000, China; 3. Laboratory for TCM New Products Development Engineering of Gansu Province, Lanzhou 730000, China)

Objective To investigate the relevant mechanism of different concentrations of Shenqi Yiliu Decoction medicated serum on blocking cell cycle and inhibiting invasion and metastasis of gastric cancer cell lines MKN-45. Methods Sixty SPF Wistar rats were randomized into Shenqi Yiliu Decoction low-, medium-, and high-dose groups and control group, with 15 rats in each group. Low-, medium- and high-dose groups were fed with different concentrations of TCM liquid from which containing crude medicine (0.25, 0.50, 1.00 g/mL) separately for gavage. Rats in the blank group were given the same amount of drinking water for gavage, twice a day, for 7 days. 2 h after the last gavage, rat blood was taken and serum was separated. After MKN-45 cells were dealt with different concentrations of medicinal serum, FCM was used to detect cell cycle and immunohistochemistry technology was used to detect the expressions of COX-2 and PTEM proteins. Results FCM analysis showed that medicated serum could increase G0-G1 phase and shorten S phase of cells; medicated serum could reduce the positive expression rate of COX-2 of the MKN-45 cells and increase positive expression rate of PTEN proteins (P<0.05). Conclusion Shenqi Yiliu Decoction medicated serum can block the cell cycle and inhibit invasion and metastasis of MKN-45 cell lines, which may be related to the intervention in the expression levels of COX-2 and PTEN proteins.

Shenqi Yiliu Decoction; gastric cancer; MKN-45 cell; cell cycle; COX-2; PTEN; rats

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.04.017

R285.5

A

1005-5304(2016)04-0064-04

2015-06-24）

（

2015-07-03；編輯：華強）

甘肅省高等學?？蒲许椖浚?013A-088）

吳紅彥，E-mail：wuhy@163.com