潘劍茹， 張小梅， 李玲玲， 王香玲， 吳倫巧， 陳莉娟， 李 嫻

( 福州大學 生物科學與工程學院， 福州 350108 )

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當歸飲片蛋白質的提取與活性分析

潘劍茹*， 張小梅， 李玲玲， 王香玲， 吳倫巧， 陳莉娟， 李 嫻

( 福州大學 生物科學與工程學院， 福州 350108 )

當歸是傳統(tǒng)的補血中藥，其所含的多糖與小分子已有大量的研究，然而當歸中的蛋白質組成與功效仍無人知曉。該研究通過0.05 mol·L-1Tris-HCl(pH=8.0)緩沖液浸提和組織勻漿得到當歸飲片粗提液，結合硫酸銨沉淀和透析法去除粗提液中的多糖及還原糖等小分子成分，得到當歸飲片總蛋白質，并首次對其組成和生物活性進行了研究。結果表明：當歸飲片蛋白含量較高，分子量為17.5～90.7 kDa，其中 17.5 kDa的蛋白含量最高，達47%。飲片蛋白在pH 5～11范圍內較為穩(wěn)定，pH為3時，僅余少量17.5 kDa的蛋白。當歸飲片蛋白質中至少有3種蛋白在80 ℃內穩(wěn)定存在，其中熱穩(wěn)定性最好的是17.5 kDa的蛋白，在熱處理溫度達到100 ℃時，仍然穩(wěn)定存在，但隨著處理時間的延長，該蛋白有部分單體發(fā)生了交聯(lián)反應。當歸飲片蛋白質具有清除DPPH自由基的能力，且該能力隨著熱處理溫度及熱處理時間的增加而增加，pH處理會影響該能力，pH為5.0時，清除能力最高，5.0兩側清除能力均下降。此外，當歸飲片蛋白質對細胞有很強的選擇性，表現(xiàn)為對正常肝細胞L-02有顯著的增殖作用(1.0～4.0 mg·mL-1，P<0.01)，對白血病細胞K562則表現(xiàn)出顯著的抑制作用(0.5～1.5 mg·mL-1，P<0.01)，當歸飲片蛋白濃度為1.0 mg·mL-1時，可使L-02細胞增值率達550% (P<0.01)，而K562細胞的抑制率達18.3% (P<0.01)。綜上所述，當歸飲片飲片蛋白具有重要的生物活性，可望從中開發(fā)出具有保肝作用的藥物蛋白。

當歸飲片， 蛋白質， 穩(wěn)定性， DPPH自由基， 細胞增殖

當歸(Angelicasinensis)為傘形科多年生草本植物當歸的干燥根，其在中國、韓國和日本，作為香料、補藥或藥物，已有一千多年的使用歷史，至今仍作為一種傳統(tǒng)中藥在中國中醫(yī)界廣泛使用(Williamson et al，2013)。它通常用于治療貧血，促進血液循環(huán)，緩解疼痛和治療便秘，但主要用于女性生殖問題的治療，如痛經(jīng)，閉經(jīng)，并用于分娩或手術后失血過多的輔助“補血”(Wu et al，2005)。此外，當歸常與其他草藥配伍使用，如著名的四物湯(何瑤等，2012)等，或作為藥食兩用的藥用食物用于煮肉燉湯。中國的當歸主產(chǎn)于甘肅、云南和四川，但是長期以來，無論產(chǎn)量還是質量，都是甘肅岷縣一帶量多且上乘，所以甘肅岷縣的當歸被譽為“道地藥材”(嚴輝等，2009)。

到目前為止，人們對當歸進行了大量的研究，研究主要集中于當歸的化學成分分析(吳燕燕等，2008；宋秋月等，2011)、炮制工藝(宋金春等，2007；吳志成等，2014)、抽提液的生物學效應(劉凱等，2012；劉芳等，2015)、配伍效果(李偉霞等，2012；李淑嬌等，2014)等。早期研究認為當歸中的主要化學成分為藁苯內酯類的揮發(fā)油和阿魏酸，以之作為當歸的有效成分并用以鑒定當歸品種的質量(中華人民共和國藥典，2010)。近年來，人們發(fā)現(xiàn)當歸中還含有香豆素、黃酮、有機酸、多糖、微量元素及維生素等多種具有生物學效應的成分(倪竹南等，2007)。特別是當歸多糖，其含量豐富，在補血方面具有雙向調節(jié)作用，在抗腫瘤、抗輻射、抗氧化、抗病毒等方面也具有良好的效果(李成軍等，2007)。以上研究豐富了當歸的藥理作用，但當歸的有效成分就是這些小分子和多糖嗎？這個問題的答案仍不明朗，因為迄今為止，人們對當歸中重要的高分子物質——“當歸蛋白質”的組成和作用仍一無所知。為此，本研究制備了當歸飲片蛋白，并對當歸飲片蛋白的組成、穩(wěn)定性及其生物活性等方面進行了研究，以評估其開發(fā)和應用的潛力。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

當歸飲片購自北京同仁堂(毫州)飲片有限責任公司。BCA試劑盒購自美國 Thermo science，DPPH購自美國sigma公司，其余試劑均屬國產(chǎn)分析純試劑。人正常肝細胞株L-02和人白血病細胞株K562購自中國科學院上海生科院細胞資源中心。

電熱恒溫水浴HWSH12(上海一恒科技有限公司)；高速離心機CF15RX型(日本HITACHI公司)；電子分析天平BS 124 S(德國SARTORIUS公司)；磁力攪拌器Color Squid(德國IKA公司)； pH計(德國METTLER-TOLEDO)；日立U-1900比例光束分光光度計(日本日立公司)；Synergy多功能酶標儀(美國Biotek公司)。

1.2 方法1.2.1 當歸飲片蛋白質的抽提與制備 稱取20.00 g當歸飲片，按1∶10的料液比(w/v)加入0.05 mol·L-1Tris-HCl 緩沖液(pH 8.0)，4 ℃浸泡過夜后反復勻漿4次，每次勻漿1 min，然后用四層紗布過濾，濾液離心(12 000 r·min-1)15 min，取上清液，得到當歸飲片粗提液。往粗提液中加入硫酸銨至80%終飽和度，待當歸蛋白完全沉淀，離心(12 000 r·min-1)15 min，取沉淀按1∶2比例添加0.05 mol·L-1Tris-HCl 緩沖液(pH8.0)，充分震蕩溶解，離心(12 000 r·min-1)15 min，取上清液，透析脫鹽，制得當歸總蛋白。

以牛血清白蛋白作為標準蛋白，采用BCA試劑盒法分別測定當歸飲片粗提液和當歸飲片總蛋白的蛋白含量；以葡萄糖為標準制作標準曲線，用蒽酮硫酸法(Babu et al,1987) 分別測定當歸飲片粗提液和當歸飲片總蛋白的總糖含量。以SDS-PAGE法(Laemmli，1970)分析當歸飲片全蛋白。電泳采用12.5%分離膠，考馬斯亮藍法染色，使用Image J 軟件分析相關電泳條帶的分子量和含量。1.2.2 當歸飲片蛋白質清除DPPH自由基活性 按照Blois的方案測定清除DPPH自由基的活性(Blois，1958)。準確稱取20 mg DPPH用無水乙醇定容于250 mL容量瓶中，得到濃度為2×10-4mol·L-1的DPPH溶液。取 2 mL 不同濃度的樣品液,加入 2 mL 2 × 10-4mol·L-1的 DPPH 溶液，混勻，反應 30 min 后測定 517 nm 處的吸光值Ai,同時測定 2 mL DPPH + 2 mL 乙醇的吸光值A0和 2 mL 樣品液 + 2 mL 乙醇混合后的吸光值Aj。以溶劑無水乙醇調零。

DPPH自由基的清除率: 清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

1.2.3 當歸飲片蛋白質的穩(wěn)定性分析 取1.2.1所得當歸飲片蛋白質，分別用下述方法處理后，分別進行SDS-PAGE和DPPH自由基清除活性分析，以研究當歸飲片全蛋白經(jīng)不同處理后的穩(wěn)定性。

(1)熱處理溫度穩(wěn)定性：將當歸飲片蛋白質分別于室溫(28 ℃)、40、60、80和100 ℃靜置30 min，離心(12 000 r·min-1)15 min，取上清。

(2)熱處理時間穩(wěn)定性：將當歸飲片蛋白質分別沸水浴0.5、1、1.5和2 h，離心(12 000 r·min-1)15 min，取上清。

(3)pH處理穩(wěn)定性：將當歸飲片蛋白質分別調至pH 3、5、7、9和11，靜置30 min，離心(12 000 r·min-1)15 min，取上清。

1.2.4 當歸飲片蛋白對細胞增殖能力的影響(MTT法) 取對數(shù)生長期的人正常肝細胞株L-02和人白血病細胞株K562，用含10% 小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液配成5 × 105·mL-1的懸液，接種于96孔板內，培養(yǎng)至貼壁。對照組只加入基礎培養(yǎng)液，實驗組加入不同濃度的當歸飲片總蛋白，每組設三個復孔。加好樣的96孔板置于37 ℃，含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，離心(1 200 r·min-1)5 min，甩去上清。向板內加入MTT[3-(4,5-二甲基吡啶-2-基)-2,5- diphenyltetrazoliumbromide]溶液50 μL，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再加入DMSO溶解液，混勻， 30 min后通過酶聯(lián)檢測儀測定OD570，空白試劑調零。

式中，A1為實驗組OD570值，A2為對照組OD570值。1.2.5 統(tǒng)計學處理 采用Excel軟件進行統(tǒng)計處理，作標準差計算、t檢驗等。以P>0.05為相差無顯著性。

2 結果與分析

2.1 當歸飲片蛋白質的制備

每克當歸飲片中含有(606.5 ± 6.41) mg多糖，(42.9 ± 0.6) mg還原糖，(51.8 ± 0.1) mg蛋白。為排除其他活性組分的影響，本研究通過硫酸銨沉淀除去了99.92%的多糖，并通過透析除去了還原糖等小分子活性組分和鹽，得到當歸飲片總蛋白。

圖 1 當歸飲片中的蛋白組分Fig. 1 Protein constituent of the decoction pieces of Chinese Angelica

當歸飲片中的蛋白質組成如圖1所示。由圖1可知， 當歸飲片蛋白的分子量分布范圍為 17～90 kDa，

圖 2 當歸飲片蛋白的熱處理溫度(a)、熱處理(100 ℃)時間(b)及pH穩(wěn)定性(c)Fig. 2 Heating temperature (a), heating(100 ℃ ) time (b) and pH-dependent stability (c) of the protein of the decoction pieces of Chinese Angelica

圖 3 熱處理溫度(a)、沸水浴熱處理時間(b)及pH(c)對當歸飲片蛋白清除DPPH自由基的能力的影響Fig. 3 Effects of heating temperature (a), heating(100 ℃) time (b) and pH (c) on DPPH radical scavenging ability of the protein of the decoction pieces of Chinese Angelica

圖 4 當歸飲片蛋白質對(a)正常人肝細胞株L-02和 (b)人白血病細胞株K562增殖能力的影響 每組3個平行，與對照組相比，**P<0.01。Fig. 4 Effects of the protein of the decoction pieces of Chinese Angelica on cell viability in (a)L-02 and (b) K562 cells n=3, compared with control group, **P<0.01.

其主要蛋白質的分子量分別為17.5、36.2、53.4、58.7和90.7 kDa，其中含量最高的蛋白分子量為17.5 kDa，約占當歸飲片總蛋白的 47%。

2.2 當歸飲片蛋白質的穩(wěn)定性

如圖2：a所示，當處理溫度小于80 ℃時，當歸飲片蛋白中分子量為58.7、36.2和17.5 kDa的蛋白基本穩(wěn)定存在，100 ℃熱處理后，前兩條蛋白條帶消失不見，僅余分子量17.5 kDa的蛋白，與此同時，電泳分離膠頂部出現(xiàn)分子量超過116 kDa的新蛋白條帶。

在此基礎上，本研究逐漸延長了當歸飲片蛋白沸水浴的時間，以進一步檢驗當歸飲片蛋白的熱穩(wěn)定性，結果如圖2：b所示。由圖可知，分子量為17.5 kDa的蛋白熱穩(wěn)定性好，100 ℃處理2 h仍保持溶解性，在圖2：a中新出現(xiàn)的高分子量蛋白在沸水浴過程中一直穩(wěn)定存在。

當歸飲片蛋白的pH穩(wěn)定性如圖2：c所示。由圖可知，當歸飲片蛋白在pH 7～11的范圍內穩(wěn)定性好，在酸性pH范圍內，隨pH的下降，溶解性逐漸降低，當pH=3時，大部分蛋白條帶消失，實驗過程可看到絮狀物存在，經(jīng)離心有沉淀，但17.5 kDa的蛋白仍保持少量的可溶性。

2.3 當歸飲片蛋白質清除DPPH自由基活性

本研究發(fā)現(xiàn)來自當歸飲片的蛋白質具有清除DPPH自由基的能力，如圖3所示。該能力隨蛋白質熱處理溫度的增加而增加(圖3：a, b)，在100 ℃處理2 h，該能力不僅沒有下降，反而繼續(xù)上升(圖3：b)。如圖3：c所示，在pH 3～11的范圍內，當歸飲片蛋白質都具有清除DPPH自由基的能力，在pH 3～5的范圍內，蛋白質清除自由基的能力隨pH升高而加強，在pH=5時，蛋白質清除自由基的能力最強，pH 超過5后，蛋白質清除自由基的能力隨pH升高而緩慢下降，在pH 9～11的范圍內下降的趨勢趨于平穩(wěn)。

2.4 當歸飲片蛋白對細胞增殖能力的影響

由圖4：a可知，當歸飲片蛋白質對正常人肝細胞株L-02有極顯著的增殖作用，蛋白質濃度為1.0 mg·mL-1時，細胞活力高達650%(P<0.01)，在1.0～3.0 mg·mL-1的劑量范圍內，增殖作用逐漸減低，但最低也有近450%的細胞活力(P<0.01)，在3.0～4.0 mg·mL-1的劑量范圍內，增殖作用逐漸回升(P<0.01)。

對于人白血病細胞株K562(圖4：b)，當歸飲片蛋白質則表現(xiàn)出顯著的抑制作用，在0.5～1.5 mg·mL-1的劑量范圍內，抑制作用先逐漸減低，再逐漸增加，但整體變化不大，細胞活力基本為80%左右(P<0.01)。

3 討論與結論

本研究利用硫酸銨沉淀法得到當歸飲片中的蛋白質，并首次對其進行了研究。本研究中，當歸飲片蛋白含量較高，分子量分布廣，其中以分子量17.5 kDa的蛋白含量最高，達47%，穩(wěn)定性也最好。當歸飲片蛋白質具有清除DPPH自由基的能力，對正常人肝細胞株L-02有極顯著的增殖作用，對人白血病細胞株K562則表現(xiàn)出顯著的抑制作用。

蛋白質作為具有重要功能的生物大分子，通常對溫度很敏感，高溫下會變性沉淀。因此，對于需要煎煮服用的中草藥，人們的研究對象通常不是其中的蛋白質，而是多糖和各種小分子。本研究結果表明，中草藥中存在耐高溫的蛋白質，且其在高溫下依然有生物活性。當歸飲片中的蛋白質就屬于這樣的類型。本研究中，當歸飲片蛋白質中至少有3種蛋白在80 ℃內穩(wěn)定存在，尤其是含量最高的17.5 kDa的蛋白，在熱處理溫度達到100 ℃時，仍然穩(wěn)定存在，其他蛋白條帶則均已消失。在100 ℃的熱處理溫度下，隨著處理時間的延長，該蛋白含量逐漸下降，但有高分子量蛋白條帶隨之出現(xiàn)，這表明在100 ℃的熱處理過程中，該蛋白有部分單體發(fā)生了交聯(lián)反應。當歸飲片蛋白穩(wěn)定性好可能與其制作過程有關。當歸飲片為當歸生藥除去雜質，洗凈，潤透，切薄片，低溫干燥而成。當歸生藥中含有還原糖，在飲片制作過程中，生藥中的蛋白質和糖可能發(fā)生了美拉德反應，而使蛋白質帶上糖基，從而增強了蛋白質的穩(wěn)定性。更有趣的是，當歸飲片蛋白質清除DPPH自由基的能力非但不會因高溫處理而喪失，反而隨著處理溫度的上升和處理時間的延長而增加。由于100 ℃的熱處理過程中，當歸飲片蛋白僅為17.5 kDa的蛋白及其交聯(lián)產(chǎn)物，因此清除DPPH自由基的能力的增加可能與17.5 kDa的蛋白在高溫處理過程中構象的變化和分子間的交聯(lián)有關，其具體的原因有待進一步的探討。

此外，本研究還通過了MTT實驗來初步探索了當歸飲片蛋白對細胞的生物學效應。該方法是非常成熟的藥物篩選技術，已廣泛應用于生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗等。通過該實驗，本研究發(fā)現(xiàn)當歸飲片蛋白質(1 mg·mL-1)能極顯著地促進正常人肝細胞增殖，使其細胞活力高達650%(P<0.01)，同時對白血病細胞卻具有顯著的抑制作用，使其細胞活力降至80%左右(P<0.01)，這與中醫(yī)中的“扶正祛邪”的說法相仿。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)的具有細胞增殖能力的物質很多，但能選擇性促進正常細胞增殖同時又能抑制腫瘤細胞增殖的物質少之又少，當歸飲片蛋白質非凡的促肝細胞增殖能力和選擇性使其具有巨大的開發(fā)和應用潛力。下一步將深入尋找具有促肝細胞增殖能力的蛋白質并探究其保肝機理。

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Extraction and activity analysis of the protein in the decoction pieces of Chinese Angelica

PAN Jian-Ru*, ZHANG Xiao-Mei, LI Ling-Ling, WANG Xiang-Ling,WU Lun-Qiao, CHEN Li-Juan, LI Xian

(CollegeofBiologicalScienceandEngineering,FuzhouUniversity, Fuzhou 350108， China )

Chinese Angelica is one of the herbs most commonly used by Traditional Chinese Medicine (TCM) practitioners with the ability of “enrich the blood”. A large number of studies have been done on the polysaccharides and small molecules of Chinese Angelica while the protein composition and of Chinese Angelica are still barely known. In this research, crude extract in the decoction pieces of Chinese Angelica was obtained by 0.05 M Tris-HCl (pH = 8.0) buffer extraction and tissue homogenates. Protein of the decoction pieces of Chinese Angelica was obtained by combination with ammonium sulfate precipitation and dialysis which could remove the polysaccharides and other small molecules such as reducing sugars in crude extract. The composition and the biological activity of the protein of Chinese Angelica were studied for the first time to evaluate their potential for development and application. The results showed that Angelica Pieces is high in protein. These protein’s molecular weight range from 17.5 kDa to 90.7 kDa and the 17.5 kDa one was the highest at content, amounting to 47%. Almost all proteins were stable under the condition of pH 5-11 while only a few proteins with the molecular weight of 17.5 kDa survived under acidicconditions(pH 3). At least three proteins were stable at 80 ℃. Among those protein, the 17.5 kDa protein showed the best thermostability, which was stable on heat treatment (100 ℃). But some of the monomers of 17.5 kDa protein seemed to be cross linked to from an emerging one with the Mw bigger than 116 kDa during the process of boiling water bath. Protein of the decoction pieces of Chinese Angelica was proved to have the ability to scavenge DPPH radicals which was increased with the temperature and time of heat treatments. The highest ability was presented under pHconditionsof 5.0 and declined under other pHconditions. In addition, protein of the decoction pieces of Chinese Angelica was proved to have effects on normal cells and tumor cells. Resultsinvitroexperiments showed that the proliferation of human normal hepatic cell line L02 cells was promoted significantly (1.0 - 4.0 mg·mL-1，P<0.01) while that of human erythromyeloblastoid leukaemic cell line K562 was inhibited observably by these proteins (0.5-1.5 mg·mL-1，P<0.01). With 1.0 mg·mL-1pretreatment of the protein, the proliferation of L-02 cells was enhanced to 550% (P<0.01), while the inhibitory rate of K562 cells reached 18.3% (P<0.01). In conclusion, the important biological activity of proteins of decoction pieces of Chinese Angelica was confirmed and a pharmaceutical protein with hepatic protective effect would be developed from these proteins.

decoction pieces of Chinese Angelica, protein, stablity, DPPH free radicals, cell proliferation

10.11931/guihaia.gxzw201512028

2015-12-28

2016-04-11

國家自然科學基金(81472907)[Supported by the National Natural Science Foundation of China(81472907)]。

潘劍茹(1977-)，女，福建福州人，博士，副研究員，主要從事生物醫(yī)學研究，(E-mail)panjr@fzu.edu.cn。

Q946， R284.2

A

1000-3142(2016)11-1363-06

潘劍茹， 張小梅， 李玲玲， 等. 當歸飲片蛋白質的提取與活性分析 [J]. 廣西植物， 2016， 36(11):1363-1368

PAN JR, ZHANG XM, LI LL， et al. Extraction and activity analysis of the protein in the decoction pieces of Chinese Angelica [J]. Guihaia， 2016，36(11):1363-1368

*通訊作者