高 媛, 劉宇峰, 宋淑敏, 姬妍茹, 楊慶麗, 張正海

黑龍江省科學院大慶分院, 黑龍江 大慶 163319

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組培技術提高白背三七試管苗中總黃酮含量

高 媛, 劉宇峰*, 宋淑敏, 姬妍茹, 楊慶麗, 張正海

黑龍江省科學院大慶分院, 黑龍江 大慶 163319

為了建立一種提高白背三七試管苗總黃酮含量的組織培養(yǎng)技術，采用組織培養(yǎng)技術，改變激素配比、碳源、微量元素(Mn2+：Zn2+)比例和氮源，來提高白背三七試管苗中總黃酮的含量。正交實驗結果表明，當碳源為蔗糖30 g/L、微量元素Mn2+：Zn2+比為44.6 mg/L：13.2 mg/L、氮源KNO3：NH4NO3為2 020 mg/L：1 600 mg/L、激素比NAA：6-BA為0.1 mg/L：1.5 mg/L時，白背三七試管苗中總黃酮含量相對于原盆栽植株提高了15%。通過組織培養(yǎng)技術建立了一種可提高白背三七總黃酮含量的繁殖體系，為白背三七優(yōu)良種苗的培育提供技術支持，該研究結果也表明利用組織培養(yǎng)技術改變培養(yǎng)基中物質(zhì)配比有益于植物生長和次生代謝產(chǎn)物積累。

白背三七；組織培養(yǎng)；總黃酮含量提高；試管苗

白背三七(Gynuradivaricata(L.)DC)，多年生草本，是傳統(tǒng)中草藥的一種，分布廣泛，是一種食用和藥用兼有的優(yōu)良品種，主要在中國南部、西南部和臺灣[1]。植物組織培養(yǎng)技術是利用細胞的全能性，在無菌條件下將離體的植物器官、組織、細胞以及原生質(zhì)體在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在人工控制的環(huán)境中生長、分化、繁殖成為新的植株的過程和技術[2]。組培技術已廣泛的應用于育種和快速繁殖、脫毒、種質(zhì)保存以及植物次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)等方面。利用植物組織細胞培養(yǎng)技術來對白背三七進行育種已有報道[2～5]，其葉片、葉柄和莖段處均能直接分化出叢生芽，提高了其繁殖的速度。

白背三七具有藥用和保健功能是因其含有豐富的總黃酮類等[6]。黃酮類屬于植物次生代謝產(chǎn)物，是多種中藥發(fā)揮生理作用的物質(zhì)基礎。組織培養(yǎng)已成為生產(chǎn)植物次生代謝藥用成分的重要手段[7]。改變培養(yǎng)基種類及激素配方能夠獲得適合于植物次生代謝產(chǎn)物的懸浮細胞培養(yǎng)體系[8]。李琰等[9]改變培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件提高了杜仲愈傷組織中次生代謝產(chǎn)物總黃酮的含量。改變了培養(yǎng)條件也能夠改變甘草愈傷組織次生代謝產(chǎn)物的多樣性[10]。植物激素是組培中影響次生代謝產(chǎn)物含量的重要因素。不同濃度配比的激素組合將直接影響愈傷組織的生長和其次生代謝產(chǎn)物的合成[11]。微量元素是植物生長中所必須的，能夠參與植物體內(nèi)的代謝，也是很多酶的活化劑，因此能影響植物的代謝和次生代謝產(chǎn)物的合成和積累[12]。已有的研究表明，培養(yǎng)基中的微量元素對雷公藤總生物堿及雷公藤甲素的含量影響顯著[13]。

而目前對于白背三七組織培養(yǎng)的研究中，已經(jīng)建立了成本低廉、周期短的快速繁殖體系[1,3,4]。對于如何利用組織培養(yǎng)技術提高白背三七試管苗莖葉總黃酮含量的研究尚無報道。本研究以白背三七的幼嫩莖葉為材料誘導得到試管苗，探討在培養(yǎng)基中不同激素配比、不同氮源、不同碳源和微量元素比例對白背三七試管苗中總黃酮積累的影響，明確了植物激素、氮源、碳源和微量元素比例對白背三七試管中總黃酮合成的影響，為提高白背三七的總黃酮含量提供技術依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及材料處理

野生型的白背三七采自南京市郊區(qū)，采集時間為2015年10月，采集白背三七地上部分，對取得的植株在通風處干燥，真空包裝后帶回進行測定，經(jīng)黑龍江省科學院大慶分院劉宇峰研究員鑒定為白背三七(Gynuradivaricata(L.) DC.)。大棚盆栽苗為南京郊區(qū)引種的白背三七，與組培所用白背三七為同一批。

已有研究表明，在三七組織中莖葉中總黃酮含量最高[14]，在10月份時白背三七的總黃酮含量為最高[15]，因此本研究中使用10月份的白背三七頂端幼嫩莖葉進行組織培養(yǎng)得到愈傷組織。按照無菌操作規(guī)程在超凈工作臺上完成，采集白背三七的頂端幼嫩莖葉，沖洗干凈，用次氯酸鈉溶液(20g/L)消毒10 min，以無菌水沖洗干凈。接種于高溫高壓滅菌的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將外植體接種到MS誘導培養(yǎng)基中誘導分化愈傷組織，得到的愈傷組織進行試管苗誘導。在培養(yǎng)45～50 d后，將獲得的試管苗取下，將培養(yǎng)基清洗干凈并去除愈傷組織后進行總黃酮含量的測定。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

本實驗采用MS培養(yǎng)基。誘導培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基中添加30 g/L蔗糖，瓊脂含量為7%，pH 5.5～6。NAA濃度為0.5 mg/L，6-BA濃度為2.0 mg/L，誘導得到愈傷組織，對初次得到的愈傷組織進行繼代培養(yǎng)以得到狀態(tài)較一致的愈傷組織，為后續(xù)的實驗做好準備。愈傷組織誘導分化得到試管苗的實驗中，也采用MS培養(yǎng)基，瓊脂含量為7%，pH 5.5～6，根據(jù)實驗設計改變其中的激素比例和微量元素(Mn2+和Zn2+)比例、碳源和氮源。培養(yǎng)條件為光照強度2 000 lx，培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照時間為16 h。

1.3 總黃酮含量測定

總黃酮含量的測定采用紫外分光光度法。將新鮮試管苗清洗干凈后進行減壓干燥、研磨，取適量樣品進行總黃酮的提取，以蘆丁作為標準品，在510 nm處測定，計算得到試管苗中總黃酮含量[16]。

1.4 不同激素比例對試管苗總黃酮含量的影響

在基本MS培養(yǎng)中加入生長素NAA和細胞分裂素6-BA，其具體比例如表1所示。NAA濃度設定為0 mg/L、0.1 mg/L和0.2 mg/L，6-BA設定為0.5 mg/L、1 mg/L和1.5 mg/L。將繼代培養(yǎng)得到的愈傷組織接種到改變激素配比的培養(yǎng)基中，誘導分化得到試管苗，測定試管苗中總黃酮的含量。

表1 激素比例設定Table 1 The settings of hormone ratio.

1.5 不同微量元素(Mn2+和Zn2+)對試管苗總黃酮含量的影響

不同Mn2+和Zn2+比例實驗采用硫酸錳(MnSO4)和硫酸鋅(ZnSO4)在MS基本培養(yǎng)基中調(diào)整Mn2+和Zn2+兩種離子的濃度，具體設定如表2，MnSO4設定為0 mg/L、11.15 mg/L、22.3 mg/L、44.6 mg/L、89.2 mg/L，ZnSO4設定為0 mg/L、3.3 mg/L、6.6 mg/L、13.2 mg/L、26.4 mg/L。測定培養(yǎng)試管苗中總黃酮的含量。

表2 微量元素Mn2+和Zn2+的設定Table 2 The settings of the dosage of trace elements Mn2+ and Zn2+.

1.6 不同碳源對試管苗總黃酮含量的影響

在MS基本培養(yǎng)基中加入淀粉、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖和果糖作為碳源，濃度為30 g/L，將愈傷組織接種培養(yǎng)基上誘導分化產(chǎn)生試管苗，觀察試管苗的生長情況并測定試管苗中總黃酮的含量。

1.7 不同氮源對試管苗總黃酮含量的影響

表3 氮源設定Table 3 The settings of the dosage of Nitrogen source.

1.8 正交試驗

選擇激素比、微量元素比、氮源、碳源每個因素總黃酮含量最高的3個水平做4因素3水平實驗，得出最優(yōu)水平測定總黃酮得率。

2 結果與分析

2.1 不同激素配比對試管苗總黃酮含量的影響

在不同的激素配比下誘導得到試管苗，因激素配比的不同，所得到的試管苗總黃酮含量也不同(圖1所示)。在H3(NAA：6-BA為0.1 mg/L：1.5 mg/L)的激素水平下，得到了總黃酮含量最高的試管苗(3.5±0.11 mg/g)，H2(3.4±0.2 mg/g)次之。而在H1和H4情況下，總黃酮含量最低為零，愈傷組織未能分化成為試管苗，其他的激素配比下雖能檢測得到試管苗中的總黃酮，但是總黃酮的含量也比較低。

圖1 不同激素配比設定下得到試管苗中總黃酮含量Fig.1 The total flavonoids content of Gynura divaricata callus from different hormone ration.

2.2 不同Mn2+和Zn2+比例對試管苗總黃酮含量的影響

錳離子是必須的微量元素之一，是硝酸還原酶的活化劑。Mn2+和Zn2+屬于重金屬，會對植物的生命活動造成脅迫，從而干擾植物多種生物學進程，影響次生代謝[17]。由圖2可知，在培養(yǎng)基中缺少了兩種金屬離子時(M8)，試管苗無法長成，因而總黃酮含量為零。而Mn2+和Zn2+單獨存在時(M1和M2)，試管苗總黃酮含量較低，分別為(1.6±0.11) mg/g和(1.2±0.17)mg/g，當在M6(MnSO4：ZnSO4為44.6 mg/L：6.6 mg/L)條件下，最適合試管苗中總黃酮含量的積累，達到(3.2±0.36) mg/g。這也表明微量元素在白背三七的次生代謝過程中起著重要的作用。

圖2 不同微量元素設定下白背三七試管苗中總黃酮含量Fig.2 The total flavonoids content of Gynura divaricata callus from different trace elements ration.

2.3 不同碳源對試管苗總黃酮含量的影響

碳源為植物生長提供了能源，因此碳源也對植物的生長起到很大的影響。如圖3所示，在以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基上得到的試管苗的總黃酮含量最高為(3.4±0.22)mg/g，完全高于另外的4種碳源。而以淀粉作為碳源的培養(yǎng)基上無法分化形成試管苗，愈傷組織經(jīng)過一段時間后死亡，總黃酮含量最低為零。葡萄糖為碳源得到的分化苗很小，生長營養(yǎng)不良，總黃酮含量為(1.0±0.36)mg/g；另兩種的碳源也不適合試管苗的分化及次生代謝產(chǎn)物的積累，麥芽糖和果糖為碳源的培養(yǎng)基上得到的試管苗總黃酮含量分別為(2.3±0.29)mg/g和(2.2±0.28)mg/g。

2.4 不同氮源對試管苗總黃酮含量的影響

氮源是關系植物生長發(fā)育必須的，也是限定性因素，本試驗采用了硝態(tài)氮和銨態(tài)氮作為研究對象。如圖4所示當?shù)慈繛殇@態(tài)氮或硝態(tài)氮時，總黃酮的含量最低，分別為N1(1.4±0.25 mg/g)和N2(1.8±0.14 mg/g)。而當兩種氮源并存時，其中總黃酮含量最高的是N5(3.1±0.22 mg/g)，即氮源為硝酸鉀：硝酸銨為2 020 mg/L：1 600 mg/L。對N5和N6結果進行統(tǒng)計學分析，結果表明P<0.05，差異顯著。

圖3 不同碳源設定下總黃酮含量Fig.3 The total flavonoids content of Gynura divaricata callus from different carbon source ration.

圖4 不同氮源設定下總黃酮含量Fig.4 The total flavonoids content of Gynura divaricata callus from different nitrogen source ration.

2.5 正交實驗結果

由表4的極差分析結果可以看出，RC>RA>RD>RB，4個因素對總黃酮含量的影響大小依次為氮源(C)>激素配比(A)>碳源(D)>Mn2+：Zn2+(B)。4因素中，氮源的影響最為顯著。在試驗設計范圍內(nèi)，優(yōu)化到的最優(yōu)培養(yǎng)條件為C2A2D1B1，即碳源為蔗糖30 g/L、微量元素比Mn2+：Zn2+為44.6 mg/L：13.2 mg/L、氮源KNO3：NH4NO3為2 020 mg/L：1 600 mg/L、激素比NAA：6-BA為0.1 mg/L：1.5 mg/L。

表4 正交實驗結果Table 4 The result of orthogonal experiment.

2.7 驗證實驗

按C2A2D1B1條件進行3次平行實驗，總黃酮量平均值為3.8 mg/g，高于表4中每一項試驗結果，故C2A2D1B1為最佳培養(yǎng)基條件。

3 討論

植物次生代謝產(chǎn)物是植物通過次生代謝產(chǎn)生的一類細胞生命活動或生長發(fā)育正常運行的非必需化合物，合成受到環(huán)境等多種因素影響[18]。利用組織培養(yǎng)技術生產(chǎn)植物次生代謝物質(zhì)具有不依賴和消耗自然植物資源的特點[19]。白背三七總黃酮屬于次生代謝產(chǎn)物，如何提高試管苗的次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，改變培養(yǎng)基的組成是關鍵。植物體合成次生代謝產(chǎn)物受到兩個方面的影響：外界條件和細胞內(nèi)部因素的嚴格調(diào)控。以往的研究主要集中在愈傷組織中總黃酮含量的提高，而對于白背三七試管苗中總黃酮累積的影響因素鮮有報道。目前已經(jīng)建立了白背三七懸浮細胞培養(yǎng)體系，優(yōu)化了培養(yǎng)條件[20]。利用懸浮體系生產(chǎn)藥用次生代謝產(chǎn)物具有在提高產(chǎn)率、縮短周期同時不受環(huán)境和氣候影響等優(yōu)點，但是也存在著穩(wěn)定而高產(chǎn)的細胞系較難獲得、污染和褐化的問題難以解決、并且成本高、代謝產(chǎn)物含量不穩(wěn)定等諸多問題[21]。而改變培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件能夠提高甘草愈傷組織[10]、靈菊七愈傷組織[22]、銀杏葉片愈傷組織[23]和青錢柳愈傷組織[8]中黃酮的含量。而愈傷組織進而誘導成植株或者培養(yǎng)成懸浮細胞系，直接用于提取有效成分的少。本研究利用組織培養(yǎng)技術對白背三七進行組織培養(yǎng)，研究改變培養(yǎng)基中的激素配比、微量元素的比例、碳源和氮源對試管苗中總黃酮含量的影響，以獲得提高試管苗中總黃酮含量的最佳處置方法。本研究中試管苗可作為高總黃酮的種苗，為白背三七育種提供依據(jù)，雖然時間耗時長于懸浮培養(yǎng)體系，但是相對成本較低，且能夠獲得穩(wěn)定產(chǎn)量。

外植體的選擇對組培有很大的影響，對總黃酮的含量也有著很大的影響，因此本次研究中采用了報道中總黃酮含量高的白背三七的莖葉作為材料，取得了較好的效果。植物激素是組織培養(yǎng)中培養(yǎng)基的關鍵物質(zhì)，NAA和6-BA是最常用的植物激素，誘導效果好。已有的研究表明，在很多植物的總黃酮合成過程中，植物激素的濃度和種類能夠調(diào)控其生物合成過程[24]。本研究的結果表明總黃酮的生物合成受激素濃度的影響很大。而對于植物激素如何能具體調(diào)控黃酮生物合成路徑需要進一步的研究。

碳源作為能源物質(zhì)，參與了植物體內(nèi)眾多的代謝活動。而已有的研究表明，糖可在細胞內(nèi)以信號分子存在，對許多過程中起到調(diào)控作用。在培養(yǎng)基中的糖除作為碳源外，還起到調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外滲透壓的作用[25]。本研究中采用不同的糖類作為碳源，結果表明在本研究中蔗糖是最佳的碳源。氮源也是植物生長的必須因素。在本研究中硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的混合使用對總黃酮的積累有提高作用，而單獨使用這兩種氮源則出現(xiàn)了試管苗生長不好，且總黃酮的含量也不高的現(xiàn)象。微量元素的不同對白背三七試管苗中總黃酮的積累有著不同程度的影響。Mn2+和Zn2+都是微量元素，其大量存在會危害植物的生長，在合適的范圍內(nèi)會促進植物生長并提高植物體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物。在缺乏時會導致試管苗無法正常生長，對本次實驗中總黃酮的累積有很大的影響。在試管苗的生長過程中，各個因子都會對其產(chǎn)生影響，因此各個影響因子的協(xié)同作用對提高次生代謝產(chǎn)物是十分必要的。

利用組織培養(yǎng)技術在白背三七組織培養(yǎng)中改變植物激素配比、微量元素比例、碳源和氮源能夠提高試管苗中總黃酮的含量，其最佳的組合是碳源為蔗糖 30 g/L、微量元素比Mn2+44.6 mg/L：Zn2+13.2 mg/L、氮源KNO32 020 mg/L：NH4NO31 600 mg/L、激素比NAA 0.1 mg/L：6-BA 1.5 mg/L，總黃酮含量達到3.8 mg/g，比其盆栽植株3.3 mg/g提高了15%。改變培養(yǎng)基中營養(yǎng)因子對植物生長和次生代謝產(chǎn)物積累有益，這也為植物提高物次生代謝產(chǎn)物提供了新的方法。

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The Improvement of Total Flavonoids Content ofGynuradivaricataCallus by the Tissue Culture Technology

GAO Yuan, LIU Yu-feng*, SONG Shu-min, JI Yan-ru, YANG Qing-li, ZHANG Zheng-hai

DaqingBranchofHeilongjiangAcademyofSciences,HeilongjiangDaqing163319,China

The test mainly aimed at the establishment of a tissue culture technology to improve the total flavonoids ofGynuradivaricatecallus. The tissue culture technology was used to change the MS medium with different hormone combination, carbon source, nitrogen source and trace element ratio. The orthogonal experiment results showed that the maximum total flavones content was increased by 15% when the NAA∶6-BA was 0.1 mg/L∶1.5 mg/L, carbon source was 30 g/L, Mn2+∶Zn2+was 44.6 mg/L∶13.2 mg/L and nitrogen source KNO3∶NH4NO3was 2 020 mg/L∶1 600 mg/L. A system of tissue culture was developed for the enhancing of the total flavonoid of theG.divaricataDC, which was helpful for the seeding cultivation technology ofG.divaricataDC and provided essential principles and techniques of improving the secondary metabolism for further research.

Gynuradivaricata(L.)DC; tissue culture technology; total flavonoids content; callus

2016-06-23; 接受日期：2016-08-16

黑龍江省科學院青年基金資助項目資助。

高媛，碩士研究生，研究方向為植物組織培養(yǎng)及應用微生物。E-mail: gao1984yuan@163.com。*通信作者：劉宇峰，研究員，研究方向為植物生物技術。E-mail:384751172@qq.com

10.3969/j.issn.2095-2341.2016.06.13