Siah2負調(diào)控脯氨酰羥化酶3表達在大鼠低氧性肺動脈高壓中的意義

潘 坤 戴愛國 張澤明 陳云榮 尹文斌 杜 宇

(河北大學附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河北 保定 071000)

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Siah2負調(diào)控脯氨酰羥化酶3表達在大鼠低氧性肺動脈高壓中的意義

潘 坤 戴愛國1張澤明 陳云榮1尹文斌 杜 宇

(河北大學附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河北 保定 071000)

目的 探討Siah2及低氧誘導因子(HIF)脯氨酰羥化酶(PHD)3的表達變化趨勢在大鼠低氧性肺動脈高壓(HPH)中的作用和意義。方法 40只成年雄性SD大鼠隨機劃分常氧正常組和低氧3 d、7 d、14 d和21 d組，每組8只，常壓低氧制作HPH大鼠模型。RT-PCR檢測Siah2和PHD3 mRNA表達變化，Western印跡檢測上述兩指標的蛋白質(zhì)表達，并分析其表達變化與大鼠HPH的關(guān)系。結(jié)果 常氧正常組Siah2 mRNA表達水平較低，低氧7 d后顯著增高(P<0.05)，低氧14 d達高峰;常氧正常組及低氧3 d組Siah2蛋白表達亦較低，低氧7 d后顯著增高(P<0.05)，低氧14 d達高峰。常氧正常組PHD3 mRNA和蛋白質(zhì)表達均不明顯，低氧3 d mRNA明顯增高(P<0.05)，同時隨低氧時間延長其mRNA表達逐漸升高并保持在高水平；PHD3蛋白質(zhì)低氧3 d明顯增高(P<0.05)，低氧7 d保持高水平，低氧14 d和21 d下降。相關(guān)分析表明，肺小動脈壁Siah2 蛋白質(zhì)表達水平與Siah2 mRNA呈正相關(guān)(r=0.87，P<0.01),與PHD3蛋白表達水平呈負相關(guān)(r=-0.44，P<0.05)。結(jié)論 Siah2與PHD3均在大鼠HPH的發(fā)病機制中發(fā)揮作用。Siah2可能從蛋白水平下調(diào)PHD3的表達水平，導致HPH的發(fā)生發(fā)展。

脯氨酰羥化酶3；Siah2；低氧性肺動脈高壓

低氧誘導因子(HIF)-1α在慢性阻塞性肺疾病患者和低氧大鼠肺動脈高壓形成過程中發(fā)揮非常重要的作用〔1，2〕。HIF-1α蛋白降解有一個前提條件，即脯氨酰羥化酶(PHD)3催化HIF-1α氧依賴性降解區(qū)域兩個脯氨酸殘基羥基化。因此，對HIF-1α蛋白表達水平的調(diào)控本質(zhì)上就是對PHD3的調(diào)控。體外試驗已發(fā)現(xiàn)Siah2可通過泛素-蛋白酶體途徑介導PHD3的降解〔3〕。本實驗通過觀察Siah2與PHD3在低氧性肺動脈高壓(HPH)大鼠模型肺小動脈血管壁中表達的動態(tài)變化，探討二者在HPH發(fā)病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 制作動物模型及實驗分組 選用清潔級健康雄性SD大鼠40只制作HPH大鼠模型，體重(220±20)g，數(shù)字表法隨機劃分為常氧正常組，低氧3、7、14、21 d組，每組8只。常氧正常組放置于氧濃度正常的空氣艙內(nèi)，低氧組每天間斷低氧8 h，氧濃度為(10.0±0.5)%，氣壓與大氣壓相等，五組大鼠飼養(yǎng)條件除低氧時間不同外，其余完全相同〔4〕。

1.2 實驗方法 RT-PCR檢測肺組織中Siah2、PHD3 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。0.1 g右肺組織，參照上海生物工程公司提供的TRIZOL試劑說明書提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，按照下列參數(shù)行PCR，Siah2：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸60 s，反應37個循環(huán)，72℃延伸10 min。PHD3：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，反應30個循環(huán)，72℃延伸10 min。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，對擴增產(chǎn)物條帶吸光度做半定量分析。引物序列：PHD3正義CCTGATGACATTATCGCCTCT，反義AGCCTAGCGGTATGCGA，產(chǎn)物長度337 bp；Siah2正義ATGGGAACCTTGGAATCAATG，反義CACAGAACCACCTCCGAATTA，產(chǎn)物長度276 bp；β-actin正義CCTAAGGCCAACCGTGAA，反義CTAGGAGCCAGGGCAGTAATC，產(chǎn)物長度635 bp。

Western印跡檢測肺組織中Siah2、PHD3蛋白表達。0.1 g大鼠右肺組織充分剪碎，加入RIPA裂解液冰浴勻漿，4℃10 000 r/min離心，去除沉淀物，獲得肺組織總蛋白，將上述樣品稀釋成相等濃度分裝，置于-80℃保存。實驗時將上述等量蛋白質(zhì)樣品加至7.5%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠孔，200 V電壓電泳，電泳完成后將蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜，室溫封閉2 h，加入1∶1 000稀釋的一抗溫育過夜，漂洗液沖洗后加入1∶2 000二抗室溫雜交1 h，漂洗后化學發(fā)光試劑盒膠片顯影，對蛋白條帶吸光度行半定量分析。

1.3 結(jié)果評定 使用TanonGis-2010圖像分析系統(tǒng)對RT-PCR和Western印跡產(chǎn)物條帶做半定量分析，計算產(chǎn)物條帶與內(nèi)參照的吸光度比值。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS16.0軟件行單因素方差分析或q檢驗，相關(guān)分析采用簡單直線相關(guān)。

2 結(jié) 果

2.1 Siah2 mRNA及蛋白在大鼠HPH肺組織的差異表達 Siah2 mRNA在常氧正常組大鼠肺組織有微量表達，低氧7 d后增高明顯(P<0.05)，低氧14 d表達呈高峰，低氧21 d稍下降但仍高于正常組。Western印跡結(jié)果顯示Siah2蛋白表達變化趨勢與其mRNA的變化趨勢相一致，常氧正常組大鼠肺組織有少量表達，低氧7 d明顯升高(P<0.05)，低氧14 d到達峰值，低氧21 d有所回落但仍然高于正常組。見表1。

2.2 PHD3 mRNA及蛋白在大鼠HPH肺組織的差異表達 RT-PCR結(jié)果顯示，PHD3 RNA在常氧正常組大鼠肺組織有微量表達，低氧3 d后迅速升高(P<0.05)，低氧14 d呈高峰表達，低氧21 d保持高水平。Western印跡結(jié)果顯示PHD3蛋白表達變化趨勢與其mRNA的變化趨勢不一致，PHD3蛋白在正常組略有表達，低氧3 d明顯增高(P<0.05)，低氧7 d保持在高水平，低氧14 d和21 d下降但仍高于正常組。見表1。

2.3 Siah2與PHD3表達的相關(guān)性 在4 個不同時間低氧組大鼠中，Siah2 蛋白質(zhì)表達水平與Siah2 mRNA呈正相關(guān)(r=0.87，P<0.01),與PHD3蛋白表達水平呈負相關(guān)(r=-0.44，P<0.05)。

組別PHD3mRNAPHD3蛋白Siah2mRNASiah2蛋白常氧正常組0.125±0.0140.151±0.0140.062±0.0110.060±0.016低氧3d組0.256±0.0111)0.241±0.0261)0.066±0.0120.055±0.012低氧7d組0.263±0.0151)0.256±0.0251)0.142±0.0191)2)0.147±0.0191)2)低氧14d組0.287±0.0121)2)3)0.204±0.0221)2)3)0.179±0.0241)2)3)0.179±0.0201)2)3)低氧21d組0.292±0.0251)2)3)0.187±0.0241)2)3)0.127±0.0141)2)4)0.140±0.0191)2)4)F/P值141.765/0.00028.048/0.00075.029/0.00082.180/0.000

與常氧正常組比較:1)P<0.05；與低氧3 d組比較:2)P<0.05；與低氧7 d組比較:3)P<0.05；與低氧14 d組比較：4)P<0.05

3 討 論

HIF-1是組織細胞中廣泛存在的異二聚體核轉(zhuǎn)錄因子，由結(jié)構(gòu)同源的α亞基和β亞基構(gòu)成，調(diào)節(jié)上百種低氧適應性基因的表達，其表達的動態(tài)變化可引起下游靶基因表達的改變進而導致相應疾病。HIF-1的生理活性主要取決于HIF-1α亞基的活性和表達，HIF-1α mRNA在常氧時持續(xù)表達，但其蛋白可通過泛素-蛋白酶體途徑迅速降解，觸發(fā)HIF-1α蛋白降解的關(guān)鍵是PHD對其氧依賴性降解區(qū)域兩個脯氨酸殘基的羥基化。因此，對HIF-1α蛋白表達水平調(diào)控的本質(zhì)就是對羥化酶的調(diào)控，而PHD3作為調(diào)節(jié)HIF-1α平衡和活性的重要蛋白，可作為有效的研究目標。

Siah蛋白是在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的一種E3泛素連接酶家族成員，具有泛素連接酶活性，可介導多種蛋白經(jīng)泛素-蛋白酶體途徑降解，到目前為止，已有超過30余種的Siah蛋白作用底物被確定，包括近年研究發(fā)現(xiàn)的ELL2、突觸蛋白、Zeb1、ACK1等各底物〔5～7〕，在人類有Siah1和Siah2兩種亞型表達，離體細胞試驗證實，Siah2可通過泛素-蛋白酶體途徑介導PHD3的降解進而引起HIF-1α的累積〔8〕，但在肺動脈高壓的發(fā)病過程中，上述作用機制是否同樣存在還未明確。

已有研究表明，Siah2 mRNA在低氧、低糖、高糖、DNA損傷等條件下表達均可增加〔9〕。但低氧環(huán)境下Siah2 mRNA表達增加的機制目前尚不明確。HIF-1α在低氧條件下調(diào)節(jié)著上百種低氧適應性基因的表達，且HIF-1α在低氧條件下表達增加，HIF-1α是否同樣調(diào)控了Siah2在低氧條件下表達增加目前尚無明確證據(jù)。Siah2蛋白在常氧正常組表達水平很低，原因可能是由于其強烈的自身泛素化作用介導了自身經(jīng)泛素-蛋白酶體途徑降解，從而導致其不易被檢測到。Siah2 mRNA 與Siah2 蛋白質(zhì)表達水平正相關(guān),既然Siah2在低氧條件下表達增加，同時Siah2又存在眾多的作用底物，它在低氧環(huán)境下也將調(diào)控其他眾多作用底物的表達，提示Siah2表達的動態(tài)變化可能在HPH的發(fā)病過程中發(fā)揮作用。

本實驗結(jié)果表明，PHD3蛋白可能存在翻譯后水平的調(diào)控。有研究表明〔8〕，在人類293T細胞中，低氧時Siah2高表達可引起PHD3蛋白表達水平顯著下降，而在 Siah2-/-小鼠胚胎成纖維細胞中，不管在常氧(21%氧濃度)還是低氧條件(2%氧濃度)下，PHD3表達都顯著增加，HIF-1α 及其靶基因血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達也明顯下降。Moller等〔10〕利用從果蠅蛋白中提取的基因片段，成功影響了Siah蛋白和PHD之間的反應，并抑制了PHD蛋白的降解，這些結(jié)果均為Siah2在翻譯后水平對PHD3進行調(diào)控提供了基因?qū)W證據(jù)。本實驗提示，在大鼠HPH形成過程中，慢性低氧可能通過誘導肺小動脈壁Siah2表達增加，進而降低PHD3蛋白表達水平，進一步減弱PHD3對HIF-1α轉(zhuǎn)錄活性的抑制，導致血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等HIF-1α靶基因轉(zhuǎn)錄激活，從而參與 HPH 發(fā)生發(fā)展。

PHD3對常氧和低氧、生理和病理狀態(tài)下HIF1-α蛋白質(zhì)水平的調(diào)節(jié)都起決定性作用，可稱之為HIF1-α降解的關(guān)鍵酶，明確PHD3的調(diào)控機制將有助于通過PHD3對HIF-1α進行精密調(diào)控，延緩甚至阻斷HPH的進展。本研究推測，低氧環(huán)境下高表達的Siah2可能通過泛素-蛋白酶體途徑對靶蛋白PHD3進行降解，從而正向調(diào)節(jié)HIF-1α的表達，并在肺動脈高壓的形成過程中發(fā)揮生物學作用。

1 陳云榮，戴愛國，胡瑞成.一氧化氮抑制缺氧誘導因子α亞基表達對大鼠缺氧性肺動脈高壓的作用〔J〕.中國病理生理雜志，2011;27(1)：14-21.

2 賀承健，鄧立普.低氧對人肺腺癌細胞SPCA-1低氧誘導因子-1α和低氧誘導因子-2α的差異性調(diào)控作用〔J〕.中國全科醫(yī)學，2011;14(33)：3833-6.

3 Simon MC.Siah proteins,HIF prolyl hydroxylases,and the physiological response to hypoxia〔J〕.Cell,2004;117(7):851-3.

4 Chen YR,Dai AG,Hu RC,etal.Differential and reciprocal regulation between hypoxia-inducible factor-alpha subunits and their prolyl hydroxylases in pulmonary arteries of rat with hypoxia-induced hypertension〔J〕.Acta Biochim Biophys Sin,2006;38(6):423-4.

5 Zhao Y,Li Q,Jin A,etal.E3 ubiquitin ligase Siah-1 downregulates synaptophysin expression under high glucose and hypoxia〔J〕.Am J Transl Res,2015;7(1):15-27.

6 Chen AN,Wong CS,Liu MC,etal.The ubiquitin ligase Siah is a novel regulator of Zeb1 in breast cancer〔J〕.Oncotarget,2015;6(2):862-73.

7 Buchwald M,Pietschmann K,Brand P,etal.SIAH ubiquitin ligases target the nonreceptor tyrosine kinase ACK1 for ubiquitinylation and proteasomal degradation〔J〕.Oncogene,2013;32(4):4913-20.

8 Nakayama K,Ffew IJ,Hagensen M,etal.Siah2 regulates stability of prolyl-hydroxylases,controls HIF1alpha abundance,and modulates physiological responses to hypoxia〔J〕.Cell,2004;117(7):941-52.

9 Qi J,Kim H,Scortegagna M,etal.Regulators and effectors of Siah ubiquitin ligases〔J〕.Cell Biochem Biophys,2013;67(1):15-24.

10 Moller A,House CM,Wong CS,etal.Inhibition of Siah ubiquitin ligase function〔J〕.Oncogene,2009;28(2):289-96.

〔2015-11-19修回〕

(編輯 袁左鳴)

Down-regulation of prolyl hydroxylases 3 by Siah2 in rats with hypoxia-induced pulmonary hypertension

PAN Kun, DAI Ai-Guo, ZHANG Ze-Ming,et al.

Department of Respiratory, Affiliated Hospital of Hebei University, Baoding 071000, Hebei, China

Objective To study the dynamic expression of seven in absentia2 (Siah2)and prolyl hydroxylase 3 (PHD3)in rats with hypoxia-induced pulmonary hypertension (HPH).Methods Male SD rats(n=40)were randomly divided into normoxia normal, 3, 7, 14 or 21 d hypoxia groups respectively (n=8). HPH was made by atmospheric hypoxia. The expression levels of mRNA were measured by RT-PCR, Western blot was used to determine the expression of protein levels.Results Compared with normal group, Siah2 mRNA and protein levels were increased markedly after 7 d of hypoxia (P<0.05)and reaching its peak after 14 d of hypoxia.PHD3 mRNA was up-regulated after 3 d of hypoxia(0.256±0.011,P<0.05), and then remained at high levels, while PHD3 protein decreased after 14 d of hypoxia(0.204±0.022,P<0.05). Linear correlation analysis indicated that Siah2 protein was positively correlated with Siah2 mRNA (r=0.87，P<0.01)but negatively correlated with PHD3 protein (r=-0.44，P<0.05).Conclusions Siah2 and PHD3 are all involved in the pathogenesis of HPH in rats. Siah2 may down-regulate PHD3 by targeting it for proteasomal degradation.

Prolyl hydroxylase 3; Siah2; Hypoxia-induced pulmonary hypertension

國家自然科學基金(No.30971329)

1 湖南省老年醫(yī)院 老年醫(yī)學研究所呼吸疾病研究室

戴愛國(1966-)，男，博士后，博士生導師，主任醫(yī)師，主要從事慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘等研究。

潘 坤(1981-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事阻塞性肺疾病、肺動脈高壓研究。

R562

A

1005-9202(2016)23-5805-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.014