朱慧果，嚴 利，王 佳

(湖南省人民醫(yī)院湖南省老年醫(yī)學研究所，中國 長沙 410016)

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NMDA干預下Rab30在PC12細胞中的表達及凋亡通路

朱慧果，嚴 利，王 佳*

(湖南省人民醫(yī)院湖南省老年醫(yī)學研究所，中國 長沙 410016)

探討興奮毒性氨基酸(NMDA)損傷干預下Rab30在PC12細胞中的表達及其凋亡通路，發(fā)現(xiàn)NMDA干預可能通過下調(diào)Rab30和GM130的表達，使高爾基體結(jié)構(gòu)破裂成片，并可能通過上調(diào)GAAP和Caspase-3的表達，誘導PC12細胞的凋亡和死亡.

PC12細胞；Rab30；神經(jīng)退行性疾??；興奮毒性氨基酸；凋亡

高爾基體(Golgi apparatus，GA)在神經(jīng)退行性疾病病理條件下和各種損傷機制(興奮毒性氨基酸、鈣超載、炎癥因子、氧自由基等)下會出現(xiàn)應激反應，其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，甚至發(fā)生碎裂[1-3].Rab30作為一種重要的調(diào)節(jié)型的運輸?shù)鞍?，參與維持非神經(jīng)細胞高爾基體結(jié)構(gòu)完整[4]，可能參與損傷機制下神經(jīng)細胞高爾基體碎裂的調(diào)控，從而導致神經(jīng)元喪失.本研究對PC12細胞進行興奮氨基酸毒性(NMDA)損傷干預，并借助細胞培養(yǎng)技術(shù)、MTT法檢測PC12細胞存活率、Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡、Western-blot法檢測目的蛋白表達情況等實驗技術(shù)，從細胞及分子水平研究NMDA干預下Rab30在PC12細胞中的表達并探討其凋亡通路.本研究希望為神經(jīng)退行性疾病的病因及病理機制提供理論和實踐依據(jù)，進而為神經(jīng)退行性疾病藥物治療提供新的靶點.

1 實驗材料與試劑

PC12細胞株(購自中國科學院上海細胞生物研究所)；1640培養(yǎng)基(Hyclone)，胎牛血清和胰酶消化液(Gibco)，青-鏈霉素溶液(碧云天)，NMDA 和MTT(Sigma)，Rab30(ORIGENE)，GAAP和GM130(Proteintech)，Caspase-3(CST)，Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡(長沙維爾生物有限公司)，BCA蛋白定量試劑盒(Wellbio)，HRP goat anti-mouse IgG(Proteintech)，HRP goat anti-rabbit IgG(Proteintech)，Super ECL Plus 超敏發(fā)光液(Thermo pierce)，顯影液和定影液(WellBiology).

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng)

PC12細胞株用完全培養(yǎng)基(含胎牛血清10%和1640培養(yǎng)液90%及100 U/mL 青-鏈霉素混合液)，pH值調(diào)至7.2～7.4, 于37 ℃下，5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1～2天換液，待PC12細胞生長匯合率達80%左右，用0.05%胰蛋白酶消化，一分為二傳代，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗研究.

藥物濃度配制及實驗分組：將25 mg NMDA溶于1 mL DMSO溶液中，儲液濃度為169.9 mmol/L.取2.9 μL加入到10 mL完全培養(yǎng)基中，終濃度為50 μmol/L.PC12細胞分別經(jīng)正常情況下培養(yǎng)5 h(正常組)、加入50 μmol/L NMDA培養(yǎng)5 h(NMDA組)后進行以下實驗.

2.2 檢測細胞存活率

采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測細胞存活率，待細胞長至70～80%時，取出96孔板，吸去舊的培養(yǎng)基，分別加入上述已配制好的含藥培養(yǎng)基，設正常組和50 μmol/L NMDA組，每組設3個復孔.處理5 h后，每孔加入20 μL 5 g/L的MTT溶液，37 ℃下，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后取出，棄上清，每孔中加入150 μL二甲基亞砜，完全溶解后用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm處測定其吸光度A，計算PC12細胞的存活率.

2.3 檢測細胞凋亡率

按照Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡試劑盒(KGA108)說明書檢測PC12細胞凋亡率.正常組和NMDA組各處理5 h后，用不含EDTA的胰蛋白酶進行消化，以冰冷PBS洗滌2次，離心(2 000 r/min，5 min)后收集約(1～5)×105細胞.除去上清液，滴入500 μL Binding buffer懸浮細胞，加入5 μL Annexin V-FITC及5 μL PI使用液使其混勻，置于室溫下避光5～15 min后，1 h內(nèi)采用流式細胞儀檢測其熒光強度.采用專業(yè)軟件Cell Quest對所得數(shù)據(jù)進行收集、儲存和分析.

2.4 Western blot蛋白印跡法檢測各目的蛋白在PC12細胞中的表達

將孵育好的PC12細胞分正常組、NMDA組，用預冷的PBS洗滌，離心(3 000 r/min，2 min)，吸除上清液.加入50 μL RIPA裂解液混勻；冰上蛋白裂解約30 min后用離心機離心(4 ℃,12 000 r/min，15 min)，取離心后的上清液進行蛋白濃度檢測.按照BCA蛋白定量試劑盒(Wellbio)說明書進行操作，將蛋白經(jīng)過電泳，將Rab30(23 k),GM130(130 k),GAAP(30 k),Caspase-3(32 k),β-actin(42 k)切片轉(zhuǎn)膜，浸入封閉液中1 h.用1*TBST將一抗按照一定比例稀釋(具體比例見表1)，將膜與一抗一起孵育，4 ℃過夜.用1*TBST稀釋HRP標記的二抗(Proteintech)，稀釋比例為1∶3 000，將膜與稀釋后的二抗一同孵育40～60 min.用ECL顯色曝光，將曝光后的底片掃描，并用Quantity one專業(yè)灰度分析軟件進行分析.

預制裝配式混凝土結(jié)構(gòu)有多種形式，如剪力墻結(jié)構(gòu)，框架結(jié)構(gòu)，框架剪力墻結(jié)構(gòu)和部分框架剪力墻結(jié)構(gòu)。由于預制裝配式結(jié)構(gòu)的預制構(gòu)件全部通過連接節(jié)點連接，所以混凝土結(jié)構(gòu)在大范圍內(nèi)尚未廣泛使用。與傳統(tǒng)建筑方法相比，預制建筑物具有更多的連接界面和接縫，而裝配式混凝土結(jié)構(gòu)中的節(jié)點是裝配式建筑的薄弱環(huán)節(jié)，在連接節(jié)點的處理問題上，國內(nèi)的技術(shù)手段目前并不是很成熟。但裝配式建筑結(jié)構(gòu)在環(huán)保、節(jié)能和施工上與現(xiàn)澆相比優(yōu)點比較突出。

表1 各種抗體的貨源、貨號及稀釋比例表

2.5 統(tǒng)計學處理

3 實驗結(jié)果

3.1 MTT比色法檢測PC12細胞存活率比較

由表2可知，經(jīng)損傷干預后各組的吸光度明顯低于正常組(P<0.05).NMDA組吸光度A為0.149 7±0.035 7，與正常組0.257 2±0.009 3相比明顯減少，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05).

表2 MTT法檢測PC12細胞存活率各損傷干預組與正常組的比較

注：a與正常組比較，均P<0.05.

3.2 Annexin V-FITC/PI法檢測細胞凋亡率結(jié)果

注：*與正常組早期凋亡率比較，P<0.05；▲與正常組總凋亡率比較，P<0.05 圖1 Annexin V-FITC/PI法檢測各損傷干預組與正常組PC12細胞凋亡率比較 Fig.1 The apoptosis rate comparison of PC12 cell between the intervention group and the control group with Annexin V-FITC/PI method

由表3、圖1和圖2可知，正?；畹腜C12細胞(雙陰性細胞)主要分布在流式細胞分析圖中的左下象限，Annexin V-FITC及 PI均低染(Annexin V-PI-)；早期凋亡的細胞或死亡的細胞分布在流式分析圖的右下象限，Annexin V-FITC高染而 PI低染(Annexin V+PI-)；晚期死亡或凋亡的細胞分布在圖的右上象限，Annexin V-FITC及PI均高染(Annexin V+PI+)[5].結(jié)果顯示未經(jīng)損傷干預的正常組PC12細胞絕大部分均為雙陰性細胞(圖2A，左下象限)，約占99.15%；正常組細胞結(jié)構(gòu)完整,無明顯細胞凋亡或死亡；而經(jīng)損傷干預后兩組細胞的凋亡率明顯增加，NMDA組的早期凋亡率及總凋亡率與正常組比較顯著增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05).

表3 Annexin V/PI雙染法檢測PC12細胞的凋亡率比較

注：a與正常組的早期凋亡率比較，P<0.05；b與正常組的總凋亡率比較，P<0.05.

A：正常組 B：NMDA組圖2 Annexin V-FITC/PI法檢測PC12細胞的凋亡率Fig.2 The apoptosis rate of PC12 cells detected by Annexin V-FITC/PI method

3.3 Western blot法檢測目的蛋白在PC12細胞中的表達情況

由圖3和圖4可知，經(jīng)損傷處理后NMPA組中的GAAP和Caspase-3在PC12細胞中表達較正常組的顯著增加，Rab30和GM130較正常組的表達下降.Rab30在NMDA組中的蛋白表達(0.127 6±0.002 4)與正常組(0.227 2±0.002 0)比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)； GM130在NMDA組中的蛋白表達(0.181 1±0.004 1)與正常組(0.270 4±0.005 3)比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；GAAP在NMDA組中的蛋白表達(0.562 5±0.016 4)與正常組(0.284 2±0.004 2)比較，均P<0.05，有統(tǒng)計學意義；Caspase-3在NMDA組中的蛋白表達(0.573 2±0.001 9)與正常組(0.323 2±0.000 6)比較，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05).

注：*，#，★，◆，與正常組比較，P<0.05.圖3 損傷干預組與正常組各目的蛋白相對表達水平比較Fig.3 The comparison of the relative expression level of target protein between the intervention group and the normal group

A：正常組；B：NMDA組圖4 蛋白免疫印跡法檢測Rab30， GM130， GAAP和Caspase-3的表達情況Fig.4 The expression of GAAP, GM130, Caspase-3 and Rab30 by Western blot

4 討論

神經(jīng)退行性疾病是腦細胞和脊髓細胞中的神經(jīng)元喪失的一種疾病狀態(tài)，興奮性氨基酸在神經(jīng)退行性疾病中起著非常重要的作用.當神經(jīng)細胞受到興奮性氨基酸毒性作用后，可引起細胞內(nèi)鈣離子超載，產(chǎn)生大量的活性氧物質(zhì)，最終導致神經(jīng)元死亡[6-7].本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)PC12細胞株經(jīng)NMDA處理后，PC12細胞的存活率減少，凋亡率增加，GAAP和Caspase-3蛋白量表達增加.NMDA很可能是通過增加胞內(nèi) Ca2+濃度，使鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡，進而導致PC12細胞死亡.

神經(jīng)退行性疾病的本質(zhì)是神經(jīng)元的喪失，高爾基體的形態(tài)改變或破裂是神經(jīng)退行性疾病共同出現(xiàn)的特征.一旦高爾基體的結(jié)構(gòu)及功能遭受破壞，將會導致蛋白質(zhì)、脂質(zhì)結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)運的異常，神經(jīng)元細胞功能紊亂，最終導致疾病的發(fā)生[8-9].Rab蛋白是一類小分子調(diào)節(jié)型GTP結(jié)合蛋白(small GTP-binding proteins)，最近的研究表明Rab30主要定位于高爾基體中，并且在非神經(jīng)細胞中維持高爾基體結(jié)構(gòu)完整，Rab30的沉默表達可導致正常高爾基體弓形結(jié)構(gòu)破裂成片[2].在筆者研究中發(fā)現(xiàn)，Rab30經(jīng)NMDA損傷干預后在PC12細胞中的表達下調(diào)，因此，筆者推斷Rab30很可能參與損傷干預下神經(jīng)細胞中高爾基體破裂的調(diào)控作用，但具體如何調(diào)控還需進一步研究.

高爾基體基質(zhì)蛋白130(Golgi matrix protein 130，GM130) 是高爾基體順面網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中一個重要的基質(zhì)蛋白，可作為高爾基體結(jié)構(gòu)定位的標記物，GM130表達量下降可作為高爾基體破壞比較敏感的分子標志[10-11].本研究中經(jīng)藥物處理后的PC12細胞存活率減少，凋亡率增加，GM130相對表達量較正常組明顯下降.因此，筆者推斷NMDA損傷干預很可能通過下調(diào)GM130的表達來影響高爾基體的形態(tài)及結(jié)構(gòu)，誘導PC12細胞死亡.

有研究證明高爾基體抗凋亡蛋白(Golgi anti-apoptotic protein，GAAP)主要定位在高爾基體上[12-13].本實驗發(fā)現(xiàn)經(jīng)損傷處理后GAAP蛋白表達量較正常組明顯增加，因此筆者推斷GAAP的高表達很可能是因PC12細胞經(jīng)損傷干預后，在應激狀態(tài)下做出應答，通過高表達可延緩高爾基體結(jié)構(gòu)的破裂，但抗凋亡蛋白仍不足以抵抗各種損傷，最終出現(xiàn)了PC12細胞的凋亡或死亡.目前對GAAP這種最新發(fā)現(xiàn)的蛋白研究不多，GAAP蛋白的高表達與PC12細胞凋亡具體機制及相互關(guān)系還需進一步探討.

天冬氨酸特異性酶半胱氨酸蛋白酶-3(Cysteinyl aspartate-specific protease, Caspase-3)是細胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶及執(zhí)行者[14-15].在本研究中，經(jīng)損傷干預后PC12的凋亡率明顯增加，Caspase-3蛋白表達量亦明顯增加.Caspase-3是神經(jīng)元凋亡的易感因子，興奮氨基酸毒性可導致Caspase-3被激活，最終導致神經(jīng)元的損傷.因此，NMDA損傷干預很可能是通過調(diào)控凋亡蛋白Caspase-3的表達，誘導PC12細胞的死亡，故研究Caspase-3的抑制劑或抑制其活性，可在一定程度上減緩或阻止神經(jīng)退行性疾病的進程.

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(編輯 WJ)

The Expression and Apoptosis Pathway of Rab30 in PC12 Cells Under NMDA Interventions

ZHUHui-guo,YANLi,WANGJia*

(Hunan Institute of Gerontology, Hunan Provincial People’s Hospital, Changsha 410016, China)

In this work, we report a study of the expression and apoptosis pathway of Rab30 in PC12 cells under injury interventions of NMDA. Our results show that NMDA interventions are likely to break the structure of golgi into pieces through downgrading the expression of Rab30 and GM130, leading to the induction of the apoptosis of PC12 cells through adjusting the expression of GAAP and Caspase-3.

PC12 cells; Rab30; neurode-generative diseases; NMDA; apoptosis

10.7612/j.issn.1000-2537.2016.06.006

2016-09-01

湖南省自然科學基金資助項目(14JJ2143)；湖南省衛(wèi)計委計劃資助項目(B2012-121)

Q189

A

1000-2537(2016)06-0032-05

*通訊作者,E-mail：13875888342@163.com