鋅離子對燈盞花素與溶菌酶相互作用的影響

鄭茂東，顏 娟，王愛萍，趙秀花，徐今寧

（河北北方學院附屬第一醫(yī)院，河北 張家口 075000）

鋅離子對燈盞花素與溶菌酶相互作用的影響

鄭茂東，顏 娟，王愛萍，趙秀花，徐今寧

（河北北方學院附屬第一醫(yī)院，河北 張家口 075000）

目的 在模擬人體生理條件下，研究Zn2＋對燈盞花素與溶菌酶相互作用的影響。方法 采用紫外光譜法、熒光光譜法研究Zn2＋對燈盞花素與溶菌酶相互作用機制、作用力類型的影響。結果 有無Zn2＋存在，燈盞花素與溶菌酶的熒光猝滅機制均為靜態(tài)猝滅和非輻射能量轉移；燈盞花素與溶菌酶的結合常數(shù)(K)分別為1．24×106L／mol和1．08×106L／mol，結合位點數(shù)(n)分別為1．05和1．19，結合距離(r)分別為1．96 nm和2．05 nm，其作用力均以疏水作用為主。結論 Zn2＋不改變燈盞花素與溶菌酶的作用機制，但能使兩者結合的結合常數(shù)、結合距離、結合位點數(shù)發(fā)生改變。

鋅離子；燈盞花素；溶菌酶；熒光光譜法

溶菌酶（LYSO）是一種廣泛存在于生物體內的小分子堿性蛋白，能與許多內源性、外源性物質結合，具有抗菌、消炎、抗病毒等生物功能[1]。溶菌酶是藥物發(fā)揮藥效的一種重要載體，常被用作研究藥物小分子與蛋白相互作用的模型蛋白，為研究藥物在體內的分布、藥效的發(fā)揮提供依據(jù)。燈盞花素（BR）是從中藥燈盞花中提取的黃酮類有效成分，其主要有效成分燈盞乙素是一種黃酮苷類化合物，具有擴張腦血管、增加腦血流量等作用[2]。鋅為人類機體必需的、具有重要生理功能的微量元素，在生物體內與蛋白質相互結合并被轉運的過程中，可能會對其他小分子物質與蛋白質的相互作用過程產生影響[3]。本研究中采用紫外光譜法和熒光光譜法，在模擬人體生理條件下，研究Zn2＋對BR與溶菌酶相互作用的影響，并探討其猝滅機制，得出有無Zn2＋存在時兩者的結合常數(shù)、結合位點數(shù)、結合距離。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1．1 儀器與試藥

熒光光度計（Peltier電子恒溫裝置，美國Varian公司）；電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；TU－1901型紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；pHS－3C型數(shù)字酸度計（上海雷磁儀器廠）。緩沖溶液選擇0．02mol／L的Na2HPO4－NaH2PO4緩沖溶液（pH＝7．40，內含0．15mol／L的NaCl，其離子強度接近人體生理條件）；燈盞花素（昆明龍津藥業(yè)股份有限公司，批號為20140512－1），配制成1．08×10－4mol／L的貯備液；溶菌酶（美國sigma公司），配制成1．05×10－4mol／L的貯備液；其他試劑均為分析純，試驗用水為二次蒸餾水。1．2 試驗方法

移取1．05×10－6mol／L溶菌酶溶液2．0m L，置1 cm石英池中，用可調式移液器逐次加入定量的BR和BR－Zn2＋溶液，混合均勻，分別在298，303，308 K溫度下，以280 nm為激發(fā)波長，記錄290～500 nm波長范圍內的熒光光譜。

2 結果

2．1 熒光光譜

溶菌酶分子中因含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基而能發(fā)射較強的內源熒光，因而溶菌酶是內源性熒光物質。由圖1可見，固定溶菌酶濃度時，熒光發(fā)射光譜隨BR或BR－Zn2＋濃度的變化而變化。隨著BR濃度的增加，溶菌酶熒光發(fā)射峰的強度有規(guī)律地降低，同時伴隨著峰位藍移，說明BR能與溶菌酶結合并猝滅其內源性熒光；此外，隨著BR的加入，溶菌酶的色氨酸殘基周圍環(huán)境極性減弱、疏水性增強。加入Zn2＋前后，溶菌酶的峰形未發(fā)生明顯變化，但猝滅程度和藍移效果明顯增大。由此表明，Zn2＋的存在對BR與溶菌酶的結合產生了顯著影響，可能導致溶菌酶肽鏈進一步卷曲折疊，使其內部的疏水結構加強，從而增強色氨酸殘基周圍的疏水性[4]。

圖1 308 K時燈盞花素對溶菌酶熒光猝滅圖

2．2 熒光猝滅機制

引起溶菌酶熒光猝滅的原因有動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅作用2種。動態(tài)猝滅是猝滅劑和熒光物質分子因擴散和碰撞導致熒光物質減弱的過程，假設BR對溶菌酶熒光的猝滅為動態(tài)猝滅，其猝滅過程應遵循 Stern－Volmer方程[5]：

其中，F(xiàn)0和 F分別為溶菌酶和BR作用前后的熒光強度，[Q]為BR的濃度，KSV為Stern－Volmer動態(tài)猝滅常數(shù)（L／mol），Kq為雙分子動態(tài)猝滅速率常數(shù)[L／（mol·s）]，τ0為猝滅劑不存在時熒光分子的平均壽命。

按照試驗方法分別測定298，303，308 K時BR對溶菌酶的熒光猝滅光譜，結果見表1。

表1 燈盞花素與溶菌酶作用的相關參數(shù)

生物大分子熒光平均壽命大約為10～8s，各類猝滅劑對生物大分子最大碰撞猝滅常數(shù)為2．0×1010L／（mol·s），BR與溶菌酶作用的熒光猝滅速率常數(shù) Kq遠大于此最大值，初步判斷此過程是靜態(tài)猝滅；同時，隨溫度的升高，BR與溶菌酶作用的猝滅速率常數(shù)降低。由此進一步證實，BR與溶菌酶的熒光猝滅不是由于分子碰撞引起的動態(tài)猝滅，而是由BR與溶菌酶形成復合物而引起的靜態(tài)猝滅。Zn2＋存在時，BR對溶菌酶的猝滅程度增加，但猝滅類型沒有發(fā)生改變，仍為靜態(tài)猝滅。

2．3 結合常數(shù)(K)和結合位點數(shù)(n)

對于靜態(tài)猝滅，結合常數(shù)和結合位點數(shù)可由公式2計算得到[6]：

以lg（F0－F）／F對lg[Q]作圖，根據(jù)直線的斜率和截距求出BR和BR－Zn2＋與溶菌酶相應的結合常數(shù)(K)和結合位點數(shù)(n)，結果見表1?？梢姡琙n2＋存在時，BR與溶菌酶的結合常數(shù)增加，n都約等于1，表明Zn2＋參與了BR與溶菌酶的作用。K增加可能是Zn2＋先與BR結合形成配合物，再與溶菌酶分子結合形成三元配合物。從臨床醫(yī)學和藥學2個角度考慮，此過程Zn2＋的參與降低了BR的游離濃度，即增強了BR與溶菌酶的結合作用，使BR在血漿中的貯留時間相應延長，藥物釋放更緩慢，藥物療效更持久，有利于藥物持久緩釋發(fā)揮藥效。

2．4 與溶菌酶色氨酸殘基間的距離

根據(jù)F?ster偶極－偶極非輻射能量轉移理論，如果供體的熒光光譜與受體的紫外光譜有足夠的重疊，且兩者之間的距離小于7nm，可判定供體與受體之間可能發(fā)生非輻射能量轉移，導致熒光猝滅。結合BR和BR－Zn2＋的紫外吸收光譜和溶菌酶的熒光光譜的疊加圖[7]，求得供體和受體之間的距離 r分別為2．05 nm和1．96 nm。BR與溶菌酶足夠靠近（r＜7 nm），可推斷BR與溶菌酶發(fā)生了非輻射能量轉移而使溶菌酶發(fā)生熒光猝滅。Zn2＋存在時，BR與溶菌酶的猝滅類型未發(fā)生改變，但與溶菌酶色氨酸殘基的距離發(fā)生了一定改變。

2．5 與溶菌酶結合的熱力學性質

分子間的作用力主要包括范德華力、疏水作用力、氫鍵、靜電引力等[8]。分別測定在298，303，308 K下BR和BR－Zn2＋與溶菌酶作用的相關熱力學參數(shù)，結果見表2。

表2 BR與溶菌酶相互作用的熱力學參數(shù)

根據(jù)熱力學參數(shù)與作用力的關系[9]，ΔrHm＞0，Δr Sm＞0，可判定BR與溶菌酶作用力為典型的疏水作用。Zn2＋存在下，ΔrHm＞0，Δr Sm＞0，說明 Zn2＋的存在未改變BR與溶菌酶的作用力類型仍以疏水作用為主。

3 討論

人體內含有多種微量金屬離子，共同參與各種生命活動，能與藥物發(fā)生相互作用，與酶蛋白結合發(fā)揮獨特作用。由本研究結果可見，Zn2＋的存在，增大了BR與溶菌酶的結合常數(shù)，推測由于Zn2＋能與BR生成絡合物再與溶菌酶作用形成新的復合物；Zn2＋同時與BR和溶菌酶結合，在藥物與溶菌酶之間形成“離子架橋”，從而增強了BR與溶菌酶的結合常數(shù)。結合常數(shù)的增大，有利于BR在血漿中的貯存，有利于增加其在體內的作用時間，可對提高其藥效提供理論依據(jù)。

[1]Zhang HM，Xu YQ，Zhou QH，etal．Investigation of the interaction tween chlorophenols and lysozyme in solution[J]．Journal of Photochemistryand Photobiology B：Biology，2011，104（3）：405－413．

[2]鐘海軍，鄧英杰，徐春蓮，等．燈盞花素的理化性質研究[J]．中國藥房，2013，24（7）：608－610．

[3]郭 明，劉咪咪，李銘慧，等．親和毛細管電泳法研究鋅離子與人血清白蛋白的結合反應機制[J]．分析化學，2012，40（2）：268－272．

[4]蔣新宇，李文秀，陳景文．鋅離子存在下槲皮素、楊梅素與牛血清蛋白的結合[J]．無機化學學報，2008，24（10）：1 588－1 595．

[5]楊 頻，高 飛．生物無機化學原理[M]．北京：科學出版社，2002：322．

[6]宋志英，韓 冬，王 娟，等．四種呋喃香豆素類藥物與溶菌酶的作用機制及構效關系研究[J]．分析測試學報，2013，27（1）：23－31．

[7]鄭茂東，楊錦艷，郝 娟，等．中藥成分五味子甲素及其金屬離子復合物與血清白蛋白相互作用的研究[J]．分析科學學報，2010，26（4）：400－404．

[8]Ross PD，Subramanian S．Thermodynamics of protein association reactions：forces contributing to stability[J]．Biochemistry，1981，20（11）：3 096－3 102．

[9]董 露，易忠勝，伍智蔚，等．2′－羥基－2，4－二溴二苯醚與人血清白蛋白作用機制的光譜研究與計算模擬[J]．高等學?；瘜W學報，2015，29（3）：516－522．

Effect of Zinc Iron on Interaction between Breviscapine and Lysozym e

Zheng Maodong，Yan Juan，Wang Aiping，Zhao Xiuhua，Xu Jinning
（The First Affiliated Hospital of Hebei North University，Zhangjiakou，Hebei，China 075000）

Objective To study the effect of Zn2＋on the interaction between breviscapine and lysozyme under the simulative human physiological condition．M ethods The interaction between breviscapine with lysozyme，with or without Zn2＋was investigated using ultraviolet spectroscopy and fluorescence spectroscopy．Resu lts The results of fluorescence spectrometry showed that the endogenous fluorescence of lysozyme had been significantly quenched by breviscapine of fluorescence quenching were static quenching with non－radiation energy transfer．The binding parameters of breviscapine and lysozyme were as follows：with or without Zn2＋，the binding constants K were 1．24×106L／mol，1．08×106L／mol，the numbers of binding site were 1．05，1．19，binding distances were 1．96 nm，2．05 nm respectively．And the major driving force was hydrophobic force．Conclusion The results shows that the presence of Zn2＋does not affect the quenching mechanism，but changes the binding constants，the numbers of binding site and the binding distances．

Zn2＋；breviscapine；lysozyme；fluorescence spectrometry

R285．5；R282．71

A

1006－4931(2016)04－0024－03

鄭茂東（1982－），男，碩士研究生，主管藥師，研究方向為藥物與生物大分子相互作用，（電子信箱）zhengmd520＠126．com。

2015－10－14)

河北省自然科學基金資助項目，項目編號：H4014405031；河北省衛(wèi)生廳資助項目，項目編號：ZD20140167；河北省張家口市科技局資助項目，項目編號：1421132D。