張家寧 丁 軻 郭思?jí)?韓 濤 陳湘寧

(北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院；食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室；農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測(cè)與控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206)

液質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)糧谷制品中4種單端孢霉烯類真菌毒素

張家寧 丁 軻 郭思?jí)?韓 濤 陳湘寧

(北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院；食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室；農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測(cè)與控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206)

建立糧谷制品中4種單端孢霉烯類真菌毒素的液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用分析方法。樣品經(jīng)乙腈/水溶液(84∶16，V/V)提取后用Mycosep?226多功能柱凈化，Agilent ZORBAX Bonus-RP色譜柱分離，液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)測(cè)定。結(jié)果表明，樣品中4種單端孢霉烯類真菌毒素在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均不低于0.995，檢出限為2～5 μg/kg，3個(gè)加標(biāo)水平下平均回收率為73.19%～107.39%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.46%～13.24%。表明該方法凈化效果好、靈敏度高，適用于同時(shí)檢測(cè)單種糧谷制品中4種單端孢霉烯類真菌毒素的殘留量。

單端孢霉烯類真菌毒素 液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜 糧谷制品

單端孢霉烯類真菌毒素是鐮刀菌毒素中一大族化學(xué)性質(zhì)相關(guān)的真菌毒素，目前已知的有200多種[1]。單端孢霉烯類真菌毒素對(duì)人畜健康有很大的危害[2-6]，且其污染已成為糧食減產(chǎn)和質(zhì)量下降的主要原因，對(duì)全球的糧食貿(mào)易具有重要影響[7]。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，單端孢霉烯類真菌毒素廣泛存在于各種糧食作物(如小麥、玉米、大麥、燕麥等)和加工產(chǎn)品(如啤酒和面包等)，多見于潮濕環(huán)境中儲(chǔ)藏的發(fā)霉糧食中[2]。經(jīng)常從受污染的糧食和飼料中被檢出的有4種：T-2毒素、HT-2毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇DON及玉米赤霉烯酮ZEA，具有分布范圍廣、污染糧食及其制品的種類多等特點(diǎn)。

單端孢霉烯類真菌毒素的檢測(cè)方法主要有薄層色譜法(TLC)[8]，氣相色譜法(GC)[9]，氣質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS)[10]，高效液相色譜法(HPLC)[11]和液質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS或LC-MS/MS)[12-16]等。其中，液質(zhì)聯(lián)用法以其快速、靈敏和檢測(cè)范圍大等優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用于谷物、飼料、嬰兒食品等基質(zhì)中的單端孢霉烯類真菌毒素多目標(biāo)檢測(cè)。采用多功能凈化柱結(jié)合LC-MS/MS方法同時(shí)檢測(cè)糧谷制品(小麥粉、玉米粉)中的4種單端孢霉烯類真菌毒素：T-2毒素、HT-2毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇DON及玉米赤霉烯酮ZEA。

1 材料與設(shè)備

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)樣品：不同品牌不同產(chǎn)地的7種小麥粉、玉米粉。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(5 mg)、玉米赤霉烯酮(5 mg)、T-2毒素(5 mg)、HT-2毒素(100.0±0.20 μg/mL)，均用甲醇溶解并定容至10.0 mL作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，濃度為100 μg/mL，于 4 ℃條件下避光保存；10 mmol/L乙酸銨溶液，乙酸銨為色譜純。

1.2 儀器設(shè)備

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：Agilent 1200-ESI 6410，美國(guó)安捷倫公司；Mycosep?226、Mycosep?227多功能凈化柱：Pribolab；BF-2000氮?dú)獯蹈蓛x：北京八方世紀(jì)有限公司；SUPER SERIES超純水系統(tǒng)：艾科普。

2 試驗(yàn)方法

2.1 樣品前處理

2.1.1 毒素提取

稱取小麥粉或玉米樣品25.0 g (精確至0.1 g)于500 mL具塞錐形瓶中, 加入100 mL乙腈/水(84∶16，V/V)提取液，浸泡15 min，超聲震蕩40 min，過濾，取8 mL 濾液，過MycoSep?227或MycoSep?226多功能柱，取過柱后液體4 mL，N2吹干，甲醇溶液定容至1 mL。

2.1.2 多功能柱的選擇和樣品凈化

根據(jù)已有研究[18-19]，選取Mycosep?226、Mycosep?227柱進(jìn)行樣品凈化，將2種多功能凈化柱的過柱效果進(jìn)行比較。

選取1種面粉樣品作為空白，按照2.1.1的方法進(jìn)行樣品提取，取8 mL的濾液后，向面粉中加入不同濃度梯度的4種真菌毒素標(biāo)樣，分別過Mycosep?226、Mycosep?227柱，進(jìn)行過柱效果比較試驗(yàn)，用方差分析比較其是否存在差異。

2.2 液相色譜-質(zhì)譜條件的選擇

2.2.1 液相色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Bonus-RP柱(50 mm×2.1 mm，3.5 μm)。

保持流速(0.2、0.3、0.4、0.5 mL/min)、柱溫(30、40、50、60 ℃)及流動(dòng)相比例3個(gè)條件中的其中2個(gè)不變，改變另外1個(gè)，測(cè)定濃度為100 ng/mL的4種真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜峰面積，確定出最佳的流速、柱溫及流動(dòng)相比例。

2.2.2 質(zhì)譜條件

離子源: 電噴霧離子源，離子源溫度: 300 ℃；干燥氣流速: 6 L/min；離子化模式：電噴霧電離正離子模式(ESI+)和負(fù)離子模式(ESI-)；質(zhì)譜掃描方式：多反應(yīng)檢測(cè)(MRM)；掃描范圍：100～500 amu；用SIM 選擇離子掃描做定量分析；離子駐留時(shí)間：300 msec；霧化氣壓力為15 psig(1 psig=6 894.76 Pa)。

在試驗(yàn)條件一定的情況下，分別以正離子模式和負(fù)離子模式對(duì)4種真菌毒素進(jìn)行檢測(cè)，毛細(xì)管傳輸電壓在2 000～5 000 V的范圍內(nèi)，碎裂電壓在 50～250 V之間選擇；并在MRM監(jiān)測(cè)下，選擇4種真菌毒素監(jiān)測(cè)的子離子峰出峰狀態(tài)最好時(shí)的碰撞能量值。

2.3 4種真菌毒素的定量分析

2.3.1 方法的線性范圍及定量限

以本方法確定的試驗(yàn)條件，將配置的混合系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，以峰面積(Y)對(duì)相應(yīng)真菌毒素的濃度(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行回歸分析，得到線性回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)。

如2.1.1的方法，準(zhǔn)確稱取若干份相同的面粉樣品各25 g，向面粉中添加4種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，并逐步減少添加量，降低面粉中4種真菌毒素的濃度，處理后上機(jī)檢測(cè)。直到在儀器信噪比為3∶1 時(shí)，SIM 掃描中選擇離子不再有峰出現(xiàn)，此時(shí)面粉中4種真菌毒素的濃度即為方法的檢出限(LOD)；再根據(jù)儀器信噪比為10∶1 時(shí)計(jì)算定量下限(LOQ)。

2.3.2 方法的回收率與精密度

如2.1.1的方法，準(zhǔn)確稱取若干份相同的面粉樣品各25 g，向面粉中加入與2.1.2中等量的不同濃度梯度的4種真菌毒素標(biāo)樣，混勻，靜置0.5 h。按上述建立的方法對(duì)毒素進(jìn)行提取、MycoSep?226柱凈化、上機(jī)檢測(cè)。同時(shí)對(duì)不加毒素的面粉樣品進(jìn)行檢測(cè)。每1個(gè)樣品做3個(gè)平行，重復(fù)測(cè)定3次。通過結(jié)果計(jì)算回收率，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(精密度)。

2.4 面粉樣品及糧谷制品的檢測(cè)

選取不同產(chǎn)地、不同品牌的7種小麥粉、玉米粉樣品：5種小麥粉，2種玉米粉；7種面粉的采購地點(diǎn)有4種為大型超市，3種為集貿(mào)市場(chǎng)散稱面粉。7種面粉樣品分別稱取25 g，如2.1.1的方法提取、凈化，上機(jī)檢測(cè)，每個(gè)樣品做3個(gè)平行，重復(fù)測(cè)定3次。

3 結(jié)果與分析

3.1 多功能柱的選擇

選取一種面粉樣品作為空白進(jìn)行過柱效果回收率實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見表1，通過對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)論如下：對(duì)于DON、HT-2、T-2毒素，Mycosep?226、Mycosep?227的差異并不顯著(P>0.05)：DON的過柱效果Mycosep?227略優(yōu)于Mycosep?226；HT-2和T-2 則是采用Mycosep?226柱效高。對(duì)于ZEA，Mycosep?226、Mycosep?227的差異極顯著(P<0.01)，Mycosep?226的回收率明顯高于Mycosep?227。綜合4種單端孢霉烯類真菌毒素同時(shí)凈化的柱效分析，Mycosep?226柱為最優(yōu)選擇。

表1 不同多功能柱的回收效率比較

3.2 液相色譜-質(zhì)譜條件

3.2.1 液相色譜條件

經(jīng)過試驗(yàn)可得，最適柱溫40 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。流動(dòng)相采用乙酸銨水溶液(A)-乙腈溶液(B)體系，流速為0.3 mL/min，梯度條件：0～0.1 min，B為10%；0.1～2 min，B由10%升到50%；2～10 min，B由50%升到80%；10～15 min，B為80%；15～16 min，B由80%降至10%；16～20 min，B保持10%。

3.2.2 質(zhì)譜條件

4種真菌毒素的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 4種真菌毒素的質(zhì)譜參數(shù)

注：*為定量離子。

3.2.2.1 DON正負(fù)離子掃描模式的選擇

4種真菌毒素同時(shí)檢測(cè)的條件下，當(dāng)DON的電離模式為ESI-時(shí)，母離子為295，此條件下DON出峰的峰形較差，響應(yīng)值較低。改用ESI+電離模式監(jiān)測(cè)，DON可以加和鈉離子，母離子為319，峰形有很大改善，且響應(yīng)值增大，所以確定其質(zhì)譜條件為ESI+電離模式，母離子為319。

DON含羧基可以使用負(fù)離子模式，因?yàn)樵谝话闱闆r下可以電離為R-COO-；但在乙酸銨存在的流動(dòng)相中，羧酸根不容易電離成負(fù)離子，這時(shí)負(fù)離子監(jiān)測(cè)的靈敏度下降，所以在正離子ESI+電離模式峰形較好，響應(yīng)值較高。

3.2.2.2 毛細(xì)管傳輸電壓對(duì)ZEA質(zhì)譜檢測(cè)的影響

毛細(xì)管傳輸電壓是加在毛細(xì)管入口端的電壓。正離子模式電壓范圍2 000～5 500 V，負(fù)離子模式一般2 000～4 000 V，根據(jù)化合物極性及利于電離的原則可適當(dāng)調(diào)高或調(diào)低，半圓柱體形電極和毛細(xì)管之間的電位差是恒定的500 V(正離子模式，前者電壓高，負(fù)離子模式，后者電壓高)，若毛細(xì)管傳輸電壓過高，導(dǎo)致半圓柱體形電極電壓過高，易產(chǎn)生放電破壞化合物，從而影響其監(jiān)測(cè)結(jié)果。

質(zhì)譜條件優(yōu)化過程中，正離子模式下毛細(xì)管傳輸電壓在2 000～5 500 V的改變對(duì)3種真菌毒素(DON、HT-2、T-2)的檢測(cè)結(jié)果影響不顯著，只需改變碎裂電壓和碰撞能量來優(yōu)化檢測(cè)條件；但負(fù)離子模式下毛細(xì)管傳輸電壓的改變對(duì)ZEA的出峰情況有顯著影響，經(jīng)試驗(yàn)證明，毛細(xì)管傳輸電壓在2 000～4 000 V的范圍內(nèi)選擇，2 500 V時(shí)ZEA的出峰情況最好。因此，正離子模式(ESI+)毛細(xì)管傳輸電壓選擇4 000 V；負(fù)離子模式(ESI-)毛細(xì)管傳輸電壓選擇2 500 V。

3.3 4種真菌毒素的定量分析結(jié)果

3.3.1 方法的線性范圍及定量限

以峰面積(Y)對(duì)相應(yīng)真菌毒素的濃度(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行回歸分析(見表3)，結(jié)果表明4種單端孢霉烯類真菌毒素在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)在0.995以上，定量下限5～20 μg/kg。4種真菌毒素在測(cè)定方法定量限時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)溶液TIC圖見圖1。

表3 4種單端胞霉烯族真菌毒素的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量下限

圖1 4種單端孢霉烯類真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的TIC圖

3.3.2 方法的回收率與精密度

本方法采用4種單端孢霉烯類真菌毒素最低的面粉作為空白樣品基質(zhì)，測(cè)定其精密度及回收率，結(jié)果見表4，3個(gè)加標(biāo)水平下平均回收率為73.19%～107.39%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.46%～13.24%，符合痕量分析的要求。

3.3.3 樣品提取環(huán)節(jié)對(duì)方法回收率影響的分析

根據(jù)3.1過Mycosep?226柱得到的4種毒素的回收率(提取后序環(huán)節(jié)回收率)結(jié)果與3.3.2過Mycosep?226柱得出的整個(gè)分析方法4種毒素回收率(方法回收率)的結(jié)果進(jìn)行比較，用方差分析的方法分析樣品提取環(huán)節(jié)對(duì)4種真菌毒素回收率的影響。若P>0.05，則差異不顯著，即樣品提取環(huán)節(jié)對(duì)方法回收率影響不大；P<0.05，則差異顯著，說明樣品前處理環(huán)節(jié)對(duì)方法回收率影響顯著。

表4 4種單端孢霉烯類真菌毒素添加回收率和精密度

樣品前處理包括樣品提取和過柱凈化，2.3.2方法回收率的測(cè)定是在樣品前處理時(shí)就加入4種真菌毒素的標(biāo)樣，2.1.2則是在過柱之前添加，兩者結(jié)果相比較，則可檢驗(yàn)出樣品提取環(huán)節(jié)對(duì)方法回收率的影響。結(jié)果見表5：4種真菌毒素在過柱前添加標(biāo)樣測(cè)定回收率的值與方法回收率的值相比都有顯著差異， HT-2和T-2差異極顯著。這說明在樣品提取環(huán)節(jié)4種真菌毒素均有不同程度的顯著損失。本試驗(yàn)選取了已有研究中最優(yōu)的提取方法，但樣品提取環(huán)節(jié)仍有顯著損失，開發(fā)新的提取方法將損失降到最低可作為今后的研究方向。

表5 提取后序環(huán)節(jié)回收率和方法回收率的比較

注:P>0.05為差異不顯著，P<0.05為差異顯著，P<0.000 1為差異極顯著。

3.4 面粉樣品及糧谷制品的檢測(cè)

對(duì)7種小麥粉、玉米粉樣品進(jìn)行檢測(cè)，DON，HT-2，T-2 3種真菌毒素的檢出率為100%，僅1、3、4、5號(hào)面粉樣品中檢出含有ZEA，且4號(hào)集貿(mào)市場(chǎng)所購細(xì)玉米粉中4種真菌毒素含量均為最高。

GB 2761—2005《食品中真菌毒素限量》中對(duì)小麥、玉米、大麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇DON和玉米赤霉烯酮ZEA做了限量，要求 DON≤1 000 μg/kg，ZEA≤60 μg/kg，由表6可知，3、4號(hào)玉米粉的ZEA均超過國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)。但至今為止，我國(guó)尚未出臺(tái)HT-2、T-2限量的具體標(biāo)準(zhǔn)，基于對(duì)實(shí)際檢測(cè)的應(yīng)用需要，我國(guó)對(duì)HT-2、T-2等真真菌毒的限量標(biāo)準(zhǔn)有待完善。

表6 7種面粉樣品的檢測(cè)結(jié)果

4 結(jié)論

本研究結(jié)合使用多功能凈化柱，建立了一種同時(shí)檢測(cè)糧谷制品中4種單端孢霉烯類真菌毒素的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法。結(jié)果表明，多功能凈化柱Mycosep?226對(duì)4種真菌毒素的同時(shí)凈化效果優(yōu)于Mycosep?227，能使4種真菌毒素均達(dá)到較高的回收率，而Mycosep?227柱僅對(duì)其中3種效果較好，綜合考慮，Mycosep?226為最優(yōu)選擇。此外，該方法對(duì)于單端孢霉烯類真菌毒素的多目標(biāo)檢測(cè)，具有快速、靈敏、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，適用于糧谷制品(如面粉等)中4種真菌毒素的同時(shí)測(cè)定，也為其他基質(zhì)中多種單端孢霉烯類真菌毒素多目標(biāo)同時(shí)檢測(cè)提供了參考。

從樣品檢測(cè)的結(jié)果看，隨機(jī)抽取的7種樣品有2種ZEA超標(biāo)，且DON，HT-2，T-2這3種真菌毒素的檢出率為100%。由此可見，我國(guó)對(duì)于控制糧谷制品中單端孢霉烯類真菌毒素含量的監(jiān)管力度有待加強(qiáng)，相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn)有待完善。

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Determination of Four kinds of Trichothecenes in Grain-products by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

Zhang Jianing Ding Ke Guo Simeng Han Tao Chen Xiangning

(Department of Food Science and Engineering, Beijing University of Agriculture,Beijing Laboratory of Food Quality and Safety,Beijing Key Laboratory of Agricultural Product Detection and Control of Spoilage Organisms and Pesticide Residue,Beijing 102206)

A simultaneous determination method for four kinds of trichothecenes in grain-products was established using high performance liquid chromatography-tendem mass spectrometry (LC-MS/MS). Samples were sequentially extracted by 84% acetonitrile-water solution，and then the extracts were cleaned up with Mycosep?226，separated by Agilent ZORBAX Bonus-RP column and detected by LC-MS/MS. Results indicate as follows：high correlation coefficients(r ≥ 0.995)of four trichothecenes were obtained within their respective linear ranges, and the detection limit for them ranges from 2 to 5 μg/kg；and the average recovery rates in the above three matrices spike at three levels were between 73.19%～107.39%，with a relative standard deviation (RSD) varying from 1.46% to 13.24%. This indicates that this method was of good purification effect and high sensitivity, and suitable for the simultaneous detection of four kinds of trichothecenes in grain-products.

trichothecenes，LC-MS/MS，grain-products

TS201.6

A

1003-0174(2016)12-0153-06

北京市自然科學(xué)基金(14L00184)，北京市屬高等學(xué)校高層次人才引進(jìn)與培養(yǎng)計(jì)劃(CIT&TCD2015 4045)，北京市重點(diǎn)建設(shè)學(xué)科資助(PXM2009_014207_078172)，2015年北京農(nóng)學(xué)院學(xué)位與研究生教育改革與發(fā)展(2015YJS034)

2015-03-31

張家寧，女，1990年出生，碩士，食品安全檢測(cè)技術(shù)

丁軻，男，1978年出生，副教授，博士，食品營(yíng)養(yǎng)與安全