草莓花青素的微波提取工藝研究

◎ 段文凱，尹 濤，解玲琴

（1.臺州科技職業(yè)學(xué)院，浙江 臺州 318000；

2.臺州學(xué)院，浙江 臺州 318000；3.臺州恩澤醫(yī)院，浙江 臺州 318000）

草莓花青素的微波提取工藝研究

◎ 段文凱1,2，尹 濤2，解玲琴3

（1.臺州科技職業(yè)學(xué)院，浙江 臺州 318000；

2.臺州學(xué)院，浙江 臺州 318000；3.臺州恩澤醫(yī)院，浙江 臺州 318000）

草莓（Fragaria×ananassa Duch）屬薔薇科、草莓屬多年生草本植物，含有大量花色素，是很好的天然色素資源。本文采用微波萃取、樹脂吸附等技術(shù)，研究不同條件下的萃取得率和不同樹脂的吸附解析能力。結(jié)果表明，草莓色素微波萃取的最優(yōu)條件為75%乙醇+1%鹽酸為萃取劑、微波功率400 W、溫度60 ℃、提取時間75 s、料液比（W/V）1∶6，色素提取純化最佳樹脂為AB-8樹脂，最優(yōu)洗脫劑為80%乙醇，洗脫體積為140 mL，最大吸附率達(dá)93.5%，最大解析率達(dá)80%，在最佳條件下，草莓色素的提取收率為38.5%.該研究將為草莓果實加工工藝提供重要的理論依據(jù)，具有重要的應(yīng)用價值。

草莓；花青素；微波提??；樹脂吸附

隨著科技的發(fā)展，人們對食品添加劑和色素的安全性越來越重視，天然色素的開發(fā)利用已成為食品添加劑和色素發(fā)展使用的總趨勢。合成色素雖具有色澤鮮艷，著色力強，穩(wěn)定性好，成本較低等優(yōu)點，但合成色素不易降解、化學(xué)合成等特性使其具有嚴(yán)重的慢性毒性和致癌性[1,2]，因而迫切需要尋找一種安全友好的色素替代合成色素。天然食用色素具有色澤自然鮮艷、生物可降解、安全、無毒等優(yōu)點，已越來越受到人們的關(guān)注。

花青素是一種類黃酮類天然色素，廣泛存在于草莓、楊梅、葡萄等自然有色植物中[3]，具有很強的抗氧化能力[4]，并可預(yù)防心腦血管疾病、降低心臟病等的發(fā)病危險[5,6]，是一種應(yīng)用前景十分廣闊的植物功能成分[7-9]。

草莓是薔薇科草莓屬植物的通稱，屬多年生草本植物。草莓中含有豐富的維生素和花青素，是一種很好的花色素類色素資源。我國草莓栽培面積和產(chǎn)量一直居世界首位[9]，雖然我國草莓資源豐富，但仍未很好地開發(fā)利用，大多數(shù)僅用于榨汁或直接食用。近年來，研究人員已研究出多種草莓保鮮的工藝技術(shù)[10-12]，但離真正解決草莓貯藏變質(zhì)問題仍很大差距。開展草莓的加工工藝研究不僅可解決草莓的保鮮貯存問題，還可擴(kuò)大草莓的消費領(lǐng)域。草莓天然色素巨大的應(yīng)用價值及良好的功效為草莓加工工藝提供一條很好的應(yīng)用研究途徑。本實驗通過微波輔助萃取草莓花色素，以AB-8大孔吸附樹脂純化草莓花色素，以期找出草莓色素提取的最佳工藝，為草莓色素和植物天然色素的開發(fā)利用提供重要的理論依據(jù)，具有重要的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與器材

草莓采收于實驗室，選果實成熟，色澤鮮艷,大小相近。除去葉、果柄 ,洗凈 ,瀝干水分放于冰箱中冷藏備用。

主要試劑：矢車菊素標(biāo)準(zhǔn)品（Cyanidin-3-O-g1ucoside），購于Extrasynthèse公司；DPPH（2,20-dipheny1-1-picry1hydrazy1）購自于Sigma公司；乙腈（色譜純），甲酸，乙醇，均購自上?；瘜W(xué)試劑有限公司。

主要儀器：微波萃取儀（CEM MARS Xpress，CEM Cooperation，Mattews，NC，USA），HPLC（Waters Corp），HPLC-MS（Waters Corp），冷凍真空干燥儀（美國Thermo公司），超聲萃取儀（寧波江南儀器有限公司），超低溫冰箱（三洋，日本松下公司），分光光度計（北京普析通用有限公司），高速冷凍離心機(jī)（美國Thermo公司）。

1.2 花青素測定方法

色素總含量的測定參考Kim等[13]及Zhou等[14]所述方法 ，將萃取液分別用pH 1.0和pH 4.5的緩沖液以1∶3的比例混勻，然后在520 nm和700 nm下分別測定吸光度，按公式（1）計算：

式中：A520為520 nm下的吸光值，A700為700 nm下的吸光值；花青素含量按矢車菊素計算，其摩爾消光系數(shù)為29 600，分子量為484.48，當(dāng)溶液A值為1時，溶液的花青素含量為16.38 μg/mL。

1.3 微波萃取方法

取一定量的新鮮草莓，用乙醇做萃取劑，微波（400 W、60 ℃）萃取5 min，測量草莓花色素含量。

1.3.1 溶劑及最佳提取濃度的確定

在參考大量花青素提取工藝和提取溶劑的安全問題后，選擇乙醇作為花色素的提取溶劑，并確定乙醇的最佳提取濃度，準(zhǔn)確稱取4份5 g新鮮草莓，分別加入濃度為25%、50%、75%、100%的乙醇溶液各20 mL，微波（400 W、60 ℃）萃取5 min，4 000 r/min離心5 min，取上清液測草莓花色素含量。

1.3.2 最佳鹽酸提取濃度的確定

取5 g新鮮草莓，加入20 mL 75%乙醇，分別加入0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2%的鹽酸，搖勻，微波（400 W、60 ℃）萃取5 min，4 000 r/min離心5 min，取上清液測草莓花色素含量。

1.3.3 最佳料液比的確定

分別稱取5 g新鮮草莓4份，按1∶4、1∶6、1∶8、1∶10的比例與75%的乙醇溶液混合，于60 ℃水浴中提取60 min，冷卻至室溫，4 000 r/min離心5 min，取上清液測草莓花色素含量。

1.3.4 最佳提取溫度的確定

準(zhǔn)確稱取5 g新鮮草莓4份，分別取濃度為75%的乙醇溶液20 mL混合，于40、60、80、100℃水浴中加熱提取60 min，冷卻至室溫，4 000 r/min離心5 min，取上清液測草莓花色素含量。

1.3.5 最佳提取時間的確定

準(zhǔn)確稱取5 g新鮮草莓4份，加入6倍體積的萃取劑，分別于60 ℃水浴中加熱提取5、10、15、20 min，冷卻至室溫，定容至相同體積，4 000 r/min離心5 min，取上清液測草莓花色素含量。

1.4 大孔樹脂的靜態(tài)吸附與解析方法

在草莓有效成分的純化中，樹脂的選擇十分重要，所選的樹脂不僅要對純化的成分具有較強的吸附力，而且應(yīng)是可逆吸附，易于洗脫。本實驗選用兩種型號的常用樹脂，通過對比兩種樹脂對草莓色素含量的吸附率和洗脫率，確定適宜的樹脂。

1.4.1 不同樹脂對草莓花色素的吸附

準(zhǔn)確稱取2.000 g預(yù)處理好的AB-8大孔樹脂于100 mL錐形瓶中，加入50 mL用設(shè)定pH值的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液稀釋的花青素粗提物，用封口膜密封，置于設(shè)定溫度恒溫振蕩器上，吸附率公式如式（2）：

式中，Q為吸附率，A0為吸附前溶液中花青素質(zhì)量濃度，mg/mL；A1為吸附后溶液中花青素質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.4.2 樹脂解析實驗

準(zhǔn)確稱取2.000 g吸附飽和的AB-8大孔樹脂于100 mL錐形瓶中，加入50 mL設(shè)定濃度乙醇溶液，用保鮮膜封口，置于設(shè)定溫度恒溫振蕩器上，以110 r/min的轉(zhuǎn)速振蕩，每隔設(shè)定時間取0.5 mL花青素解析液，測定吸光值，按公式（3）計算花青素解析率：

式中，P為解析率，A0為吸附前溶液中花青素質(zhì)量濃度，mg/mL；A1為吸附后溶液中花青素質(zhì)量濃度，mg/mL；A2為解析液中花青素質(zhì)量濃度，mg/mL；V1為吸附液的體積，mL；V2為解析液體積，mL。

1.5 花青素干燥方法

真空干燥：取一定量花色素純化液，在50 ℃下濃縮，濃縮液置于蒸發(fā)皿中，50 ℃揮發(fā)水分，成流動性較差的浸膏，50 ℃真空干燥得色素粉末。

2 結(jié)果與討論

2.1 草莓花色素微波提取的最適條件

2.1.1 乙醇濃度對提取的影響

乙醇濃度對草莓花青素提取的影響如圖1所示。由圖1可知，草莓色素收率隨乙醇濃度增加而提高，當(dāng)乙醇濃度達(dá)75%后，再升高乙醇濃度草莓花色素提取量呈略有下降的趨勢，高濃度的乙醇阻礙植物次級代謝產(chǎn)物的釋放；因此，確定乙醇濃度75%時為最佳乙醇濃度。

圖1 乙醇濃度對草莓花青素提取的影響圖

2.1.2 鹽酸濃度對色素提取的影響

花青素在酸性環(huán)境下穩(wěn)定，在堿性環(huán)境下則易降解，萃取劑酸濃度對色素萃取收率有較大影響，如圖2所示。由圖2可知，鹽酸濃度增加到1%時，色素收率達(dá)到最大，繼續(xù)增加鹽酸濃度，并不能提高色素的收率，這可能是鹽酸濃度過高并不利于草莓花色素的穩(wěn)定性。綜合考慮，后續(xù)實驗選擇1%的鹽酸作為萃取劑。

圖2 鹽酸濃度對草莓花青素提取的影響圖

2.1.3 料比對提取的影響

料液比對草莓色素萃取得率的影響如圖3所示，由圖3可知，草莓色素收率隨料液比增加而增大，但到一定程度后，繼續(xù)增大料液比，對收率影響較小。這可能是因為料液比增大有利于目的產(chǎn)物充分接觸萃取溶劑，但當(dāng)料液比增大至一定量時，目的產(chǎn)物與溶劑接觸完全，再繼續(xù)增大，并不能增大分子碰撞的概率，同時浸提液越多，濃縮干燥能耗也越大，溶劑用量也越大，綜合考慮，選擇料比為1∶6為實驗的料液比。

圖3 料液比對草莓花青素提取的影響圖

2.1.4 溫度對萃取的影響

圖4表明，色素在80 ℃以下收率值變化不大，尤其是60 ℃以下。溫度高于60 ℃時，色素收率稍有增加，其原因可能是該溶液為色素粗提液，隨著溫度的升高可能其中的糖類等物質(zhì)發(fā)生改變，而使得顏色變深。在一定階段內(nèi)，隨著溫度的升高提取效果也在不斷變優(yōu)異，但如果繼續(xù)升溫，提取效果反而降低。因為雖然升溫有利于色素的溶出，但花青素的穩(wěn)定性較差，溫度升高，花青素會發(fā)生氧化、聚合，導(dǎo)致提取率下降；溫度低時，花青素與蛋白質(zhì)、纖維等分離較慢，也會導(dǎo)致提取率下降。100 ℃時花青素的穩(wěn)定性降低，使得收率變小。故初步確定提取溫度為60 ℃時的提取效果最好。

圖4 溫度對草莓花青素提取的影響圖

2.1.5 萃取時間對提取的影響

理論上提取時間越長，越有利于花青素溶解提取，提取量越大。但由實驗結(jié)果可知，花青素的提取量隨提取時間的不同而不同，如圖5所示。隨著處理時間的增加，收率逐漸增加，但時間過長會導(dǎo)致體系溫度過高，而引起草莓花青素破壞，從而出現(xiàn)收率下降。

圖5 萃取時間對草莓花青素提取的影響圖

2.2 大孔樹脂的篩選

將萃取液減壓濃縮，蒸發(fā)乙醇進(jìn)樣。

2.2.1 不同型號的大孔吸附樹脂對草莓花色素的吸附情況

取4 g AB-8、D101樹脂，加入25 mL色素（含量為：0.021 mg/L）再加入50 mL pH 1.0的緩沖液，160 r/min搖床震蕩20、40、60、80、100、120 min和360 min，測定上清液色素含量，按公式（4）計算吸附率。

式中：C0為花青素吸附前的濃度，C1為花青素吸附后的濃度；由圖6中的結(jié)果可看出，AB-8對草莓花色素的吸附率較高，對草莓花色素的吸附能力較強，吸附率達(dá)93.5%，效果最佳。

圖6 靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線圖

AB-8樹脂是一種球狀、弱極性聚合物吸附劑，其結(jié)構(gòu)中僅有非離子化功能基，并附加親水基團(tuán)?；讵毺氐募庸し椒?，AB-8樹脂具有較大的比表面和適宜的孔徑，草莓花色素是可溶于水的弱極性有機(jī)化合物，與AB-8大孔吸附樹脂的表面極性相匹配。這些特性都決定了其對草莓花色素具有較高的吸附能力。根據(jù)實驗結(jié)果，后續(xù)的實驗選擇AB-8樹脂作為吸附劑，研究其對草莓花色素的吸附與解吸情況。

2.2.2 洗脫劑對AB-8的解析的影響

不同濃度的乙醇解吸液的解吸率如圖7所示。從圖7中可看出，當(dāng)乙醇濃度為80%時，解吸液的解析率最高，解吸效果最好。乙醇濃度過高或過低，解吸效果都會下降。

圖7 洗脫劑乙醇濃度對解析率的影響圖

2.2.3 AB-8上柱實驗

柱型號：60×1.5 cm，上樣pH 1.0，上樣量50 mL× 0.021 mg/L，上樣流速60 mL/h ，先用蒸餾水洗120 mL，再用80%的乙醇洗。

由圖8可看出，洗脫劑用量達(dá)到50 mL時，草莓花色素開始被洗脫下來，洗脫劑用量達(dá)到140 mL時，樹脂上的草莓花色素已基本上洗脫完全，故洗脫劑體積應(yīng)控制在140 mL。

圖8 上柱實驗圖

2.3 AB-8循環(huán)使用性能

準(zhǔn)確稱取5.0 g已活化的濕樹脂上柱，分別用80%乙醇溶液及蒸餾水洗凈。取配好的色素溶液在500 nm處測定吸光度A0=0.807，然后取該色素溶液50 mL進(jìn)行流動吸附，控制流速為2 mL/min，測其流出液吸光度A，結(jié)果見表1。從表1中可以看出，樹脂循環(huán)使用25次后，流出液的吸光度變化不大，樹脂的吸附能力僅降低1.5%。

表1 重復(fù)使用對樹脂的穩(wěn)定性影響表

3 結(jié)論

（1）草莓花色素最佳提取條件為最佳提取條件為以75%乙醇+1%鹽酸為萃取劑，微波功率400 W、溫度60 ℃、提取時間15 min、料液比（W/V）1∶6。從實驗結(jié)果可看出，微波和超聲波處理通過打斷色素與其結(jié)合、破碎組織細(xì)胞，在很大程度上提高草莓花色素的提取率。同時值得注意的是，微波處理過度會引起花色素的破壞。

（2）試驗用兩種大孔吸附樹脂中，AB-8樹脂對草莓花紅色素分離純化較為適宜。據(jù)靜態(tài)吸附和動態(tài)吸附實驗，初步確定AB-8型大孔樹脂純化草莓花色素的最佳工藝為：柱型號：60×1.5 cm，上樣pH 1.0，上樣量50 mL×0.021 mg/L，上樣流速60 mL/h，先用蒸餾水洗120 mL，再用80%的乙醇洗。循環(huán)使用25次以后，吸附率僅降低1.5%。

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Research on the Microwave Technology of Anthocyanin from Strawberry

Duan Wenkai1,2, Yin Tao2, Xie Lingqin3
(1.Taizhou Vocational College of Science and Technology, Taizhou 318000, China; 2.Taizhou University, Taizhou 318000, China; 3 Taizhou Enze Hospital, Taizhou 318000, China)

Strawberry (Fragaria×ananassa Duch) belongs to the Rosaceae family and contains large amounts of Anthocyanin. It’s one of the perennial herbs and a great kind of natural pigment resources. This paper uses the technologies of technical extraction and resin adsorption to observe the different extraction yields under different conditions and the analytical and adsorptional ability of different resins. The results show that the best condition of strawberry pigment’s microwave extraction is: 75% ethanol and 1% hydrochloric acid as extraction agents, microwave power is 400 W, temperature of 60 ℃, extraction time is 75 s, liquid ratio (W/V)is 1：6. The best resin is AB-8, it’s the maximum adsorption rate is 93.5%, the maximum analytica rate is 80%.The Optimal eluent is 80% ethanol, elution volume is 140mL.Under the best condition, the extract yield of strawberry pigment is 38.5%. This study will provide the important theory of strawberry fruit processing and has a great application value.

Strawberry; Anthocyanin; Microwave extraction; Resin adsorption

10.16736/j.cnki.cn41-1434/ts.2016.20.030

S668.4

浙江省教育廳一般科研項目（編號：Y201533086），感謝浙江省高等學(xué)校訪問工程師校企合作項目（一種天然增色增香劑在草莓及其他果實增色增香中的應(yīng)用）的支持 。

段文凱（1982-），博士，講師；專業(yè)方向為：生物活性物質(zhì)分離純化。