殼聚糖培養(yǎng)對間充質(zhì)干細(xì)胞干性相關(guān)基因表達(dá)的作用

何啟艇　邱波　龔明

[摘要] 目的 比較殼聚糖薄膜培養(yǎng)和常規(guī)平板培養(yǎng)對間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）干性相關(guān)基因表達(dá)的影響。 方法 從臍帶中分離MSCs并分別進(jìn)行殼聚糖薄膜培養(yǎng)和常規(guī)平板培養(yǎng)。采用Real-time RT-PCR和Western blot方法檢測MSCs干性相關(guān)基因Nanog、Sox2、c-Myc、Oct-4 mRNA及其蛋白的表達(dá)。 結(jié)果 殼聚糖薄膜培養(yǎng)的MSCs能形成類球狀體。殼聚糖薄膜培養(yǎng)的MSCs干性相關(guān)基因Nanog、Sox2、c-Myc、Oct-4 mRNA及其蛋白的表達(dá)水平較常規(guī)培養(yǎng)組顯著增加，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。 結(jié)論 與常規(guī)培養(yǎng)的MSCs比較，殼聚糖薄膜培養(yǎng)的MSCs能形成類球狀體，更能保持MSCs的干性。

[關(guān)鍵詞] 殼聚糖；間充質(zhì)干細(xì)胞；干性；骨關(guān)節(jié)炎

[中圖分類號] R329.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）10（b）-0004-04

[Abstract] Objective To investigate the effects of cultivation modes （chitosan membrane and conventional plate） on the stemness of mesenchymal stem cells （MSCs） by comparing the related genes expression. Methods MSCs were isolated from umbilical cords and cultured on chitosan membrane and conventional plate. mRNA expression concerned with stemness related genes including Nanog， Sox2， c-Myc and Oct-4 were assayed by real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction. Corresponding proteins were detected by Western blot. Results Spheroid was formed by MSCs cultured on chitosan membrane. Compared with MSCs cultured on conventional plate， mRNA and protein expression levels of Nanog， Sox2， c-Myc and Oct-4 increased significantly in chitosan membrane-cultured MSCs， with statistically significant differences （P < 0.01）. Conclusion Compared with conventional culture， chitosan membrane-cultured MSCs can form spheroid， moreover， chitosan membrane can maintain the stemness of MSCs.

[Key words] Chitosan membrane； Mesenchymal stem cells； Stemness； Osteoarthritis

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種以關(guān)節(jié)軟骨退行性變?yōu)橹饕±硖卣鞯募膊?，其治療仍是臨床尚未解決的問題。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有多向分化功能。研究發(fā)現(xiàn)，MSCs經(jīng)誘導(dǎo)可以轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨，對實(shí)驗(yàn)性O(shè)A具有治療作用[1-2]。目前體外常規(guī)培養(yǎng)（two-dimensional culture，2D培養(yǎng)）不能夠維持MSCs的性狀穩(wěn)定，主要表現(xiàn)在MSCs在常規(guī)的平板培養(yǎng)過程中發(fā)生衰老和向成骨細(xì)胞自主分化、增殖能力減退，嚴(yán)重影響了MSCs作為細(xì)胞治療功能的發(fā)揮。本文旨在觀察殼聚糖薄膜培養(yǎng)對人臍帶MSCs干性相關(guān)基因表達(dá)的作用，探討殼聚糖薄膜培養(yǎng)對MSCs干性的影響，為進(jìn)一步探討殼聚糖薄膜培養(yǎng)的MSCs在OA軟骨修復(fù)中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 MSCs的培養(yǎng)

本研究得到武漢大學(xué)人民醫(yī)院（以下簡稱“我院”）倫理委員會(huì)同意，取得患者及其家屬知情同意并簽署知情同意書。臍帶來自我院婦產(chǎn)科一分娩后健康產(chǎn)婦。用含100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素的PBS（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，中國）充分洗滌臍帶。用鑷子從臍帶的中間分開Wharton′s jelly組織，用剪子剪成小塊，在0.1%膠原蛋白酶I型（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）37°C條件下消化16 h，釋放MSCs。以300 r/min離心5 min收集MSCs，并在含10%胎牛血清（Hyclone，Victoria，Australia）和10 ng/mL bFGF（Peprotech，London，UK）高糖MEM/F12（Invitrogen）中培養(yǎng)，每3天更換新鮮培養(yǎng)基。當(dāng)MSCs增殖到80%匯合時(shí)，從形態(tài)學(xué)和流式細(xì)胞儀分析鑒定這些細(xì)胞為MSCs，以P1代作為種子細(xì)胞。

1.2 殼聚糖薄膜的準(zhǔn)備

用2%的殼聚糖溶液處理蓋玻片，在室溫下自然晾干，之后用0.5N NaOH處理2次，再充分用無菌水洗5次，徹底除去NaOH，最后用PBS清洗1次，制備能夠培養(yǎng)MSCs的殼聚糖薄膜。

1.3 分組

在殼聚糖薄膜24孔板接種MSCs細(xì)胞使其密度分別為100、500、1000 個(gè)/cm2，并以同樣的細(xì)胞密度接種在常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞板。每3天更換新鮮α-MEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）。所有細(xì)胞均在5% CO2，37°C條件下培養(yǎng)，兩者使用的培養(yǎng)基完全相同。

1.4 實(shí)時(shí)定量RT-PCR（Real-time RT-PCR）檢測

采用Real-time RT-PCR檢測殼聚糖薄膜和普通平板培養(yǎng)的MSCs細(xì)胞干性相關(guān)基因的表達(dá)。

自P1代獲得的MSCs以相同密度接種到殼聚糖薄膜和常規(guī)平板培養(yǎng)后72 h，收集MSCs，用RNA提取試劑盒（Invitrogen）提取總RNA，先用逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（TIANSGEN，中國）轉(zhuǎn)錄成cDNA，取2 μL cDNA為PCR擴(kuò)增的模板。用SYBR Green PCR Master Mix （Roche Diagnostics，Basel，Switzerland）在PCR儀（Bio-Rad）定量分析。用GAPDH進(jìn)行歸一化處理，靶基因的表達(dá)用mRNA改變與參考基因比較的倍數(shù)表示。Real-time RT-PCR引物見表1。

1.5 蛋白印跡法（Western blot）

采用Western blot檢測MSCs細(xì)胞干性相關(guān)基因蛋白的表達(dá)。從殼聚糖薄膜和普通平板培養(yǎng)獲得的MSCs用預(yù)冷的RIPA緩沖液裂解30 min，然后4°C 16 000 r/min離心10 min，收集上清液，用BCA試劑盒（Beyotime）檢測總蛋白量。取20 μg總蛋白用10%SDS-PAGE蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜到0.22 μm PVDF膜上。用含5%脫脂牛奶的TBST（10 mmol/L Tri-HCl，150 mmol/L NaCl，0.25% Tween-20，pH 7.5）室溫下封閉1 h，然后加入多克隆兔抗人Nanog、Sox2、OCT4、c-Myc一抗（所有1∶300稀釋，Abcam）孵育過夜。用TBST洗滌后，膜在室溫下與羊抗兔IgG-HRP二抗孵育1 h。ECL（Invitrogen）顯色，灰度掃描儀進(jìn)行定量分析，GAPDH作為對照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 殼聚糖薄膜培養(yǎng)的MSCs細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變

與常規(guī)貼壁培養(yǎng)的MSCs相比，殼聚糖薄膜上培養(yǎng)的MSCs起先較為分散，1 d后聚合成小克??；2 d后形成的克隆增大，呈較為松散的類球體。7 d后消化殼聚糖薄膜上實(shí)心緊密的類球體，與培養(yǎng)時(shí)間相同的常規(guī)平板培養(yǎng)比較，MSCs形態(tài)較小。殼聚糖薄膜培養(yǎng)及常規(guī)培養(yǎng)對MSCs形態(tài)的影響見圖1。

2.2 殼聚糖薄膜培養(yǎng)對MSCs干性相關(guān)基因Nanog、Sox2、c-Myc和Oct-4 mRNA表達(dá)的影響

殼聚糖薄膜培養(yǎng)的MSCs干性相關(guān)基因Nanog、Sox2、c-Myc和Oct-4 mRNA的表達(dá)水平較常規(guī)培養(yǎng)組顯著增加，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見表2。

2.3 殼聚糖薄膜培養(yǎng)對MSCs干性相關(guān)基因Nanog、Sox2、c-Myc和Oct-4蛋白表達(dá)的影響

與常規(guī)培養(yǎng)組MSCs干性相關(guān)基因Nanog、Sox2、c-Myc和Oct-4蛋白的表達(dá)水平比較，殼聚糖薄膜培養(yǎng)組蛋白的表達(dá)水平顯著增高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見圖2、表3。

3 討論

OA的軟骨細(xì)胞數(shù)量減少，只要能使軟骨細(xì)胞的數(shù)量增加并且恢復(fù)原有的軟骨形態(tài)，就能明顯改善OA的癥狀。MSCs是一種具有多向分化潛能和自我復(fù)制能力的多潛能未分化細(xì)胞，由于易于分離，體外培養(yǎng)的擴(kuò)增能力、可塑性、免疫抑制特性、自分泌和旁分泌介導(dǎo)的效應(yīng)、向受傷部位遷徙能力及表型穩(wěn)定等方面的優(yōu)勢使其成為治療OA的研究熱點(diǎn)[1-4]。研究發(fā)現(xiàn)羊OA模型關(guān)節(jié)腔注射標(biāo)記的MSCs后，MSCs能分化成軟骨細(xì)胞并附著于病變軟骨部位[5]。關(guān)節(jié)腔注射MSCs能夠抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變[6-7]。Saulnier等[2]將MSCs注射到兔OA膝關(guān)節(jié)內(nèi)，發(fā)現(xiàn)早期治療能夠減輕關(guān)節(jié)軟骨的破壞。OA主要病理特征是關(guān)節(jié)軟骨的損傷，將MSCs移植到病灶處分化成軟骨細(xì)胞進(jìn)行軟骨修復(fù)，具有非常廣闊的發(fā)展前景[8]。

MSCs作為修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨的種子細(xì)胞，其臨床應(yīng)用必須進(jìn)行體外MSCs擴(kuò)增。雖然目前已從多種組織分離提取到MSCs，但體外擴(kuò)增培養(yǎng)MSCs是關(guān)鍵的一步。常規(guī)平板培養(yǎng)（2D培養(yǎng)）不能夠維持MSCs的性狀穩(wěn)定，MSCs在傳代培養(yǎng)過程中逐漸喪失干細(xì)胞特性，表現(xiàn)為衰老，增殖能力下降，向成骨細(xì)胞自主分化、遷徙能力顯著降低等，嚴(yán)重影響了MSCs作為細(xì)胞治療功能的發(fā)揮[9-11]，阻礙了其臨床應(yīng)用。目前的MSCs擴(kuò)增培養(yǎng)方法使MSCs隨著培養(yǎng)傳代其干性相關(guān)基因的表達(dá)下降以至消失，不適當(dāng)?shù)捏w外培養(yǎng)條件是引起上述改變的主要原因[12]。采用懸滴培養(yǎng)的三維（three-dimensional，3D）培養(yǎng)環(huán)境下MSCs細(xì)胞能夠形成類球狀體，高密度的類球狀體提供了細(xì)胞生長的微環(huán)境，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用。這種形態(tài)被認(rèn)為可以實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞增殖、分化和凋亡等機(jī)制調(diào)控[13-14]。

殼聚糖是廣泛存在于大自然界中的甲殼素衍生物，具有很好的生物相容性、無免疫原性、低毒性的特點(diǎn)，其來源廣泛，成本低廉，操作簡便。研究發(fā)現(xiàn)，利用殼聚糖薄膜培養(yǎng)MSCs能夠克服平板培養(yǎng)的缺點(diǎn)，表現(xiàn)為MSCs附在殼聚糖薄膜上可以形成類球狀體，類似懸滴培養(yǎng)的3D培養(yǎng)模式，在傳代過程中很好地保持了干性，使得其增殖能力提高[15]。MSCs在殼聚糖薄膜上培養(yǎng)能夠形成類球狀體，其轉(zhuǎn)分化效率顯著加強(qiáng)[16-18]。本研究結(jié)果也顯示MSCs在殼聚糖薄膜上形成類球狀體，細(xì)胞增殖能力顯著提高。

殼聚糖薄膜和附在其上的MSCs相互作用可能提供了更適宜MSCs生長的類似于體內(nèi)的3D微環(huán)境，影響了MSCs細(xì)胞骨架最終形成類球狀體。研究發(fā)現(xiàn)，類球狀體的形成與RHO/ROCK激酶通路及細(xì)胞膜上CD44相互作用有關(guān)，在殼聚糖薄膜上MSCs通過自身表面上的CD44相互作用黏附在一起激活RHO/ROCK激酶通路，并且產(chǎn)生更多的細(xì)胞外分子，如層粘連蛋白、纖維連接蛋白等，促進(jìn)細(xì)胞間的黏附、遷徙、細(xì)胞骨架重新排列，最終形成類球狀體，干性相關(guān)基因上調(diào)，MSCs增殖能力增強(qiáng)[19]。用CD44抗體阻斷CD44受體或者用Y27632混合物阻斷RHO/ROCK激酶通路，會(huì)導(dǎo)致干性基因的表達(dá)受抑制，干性基因下調(diào)，干性相關(guān)基因的維持與細(xì)胞骨架的重排及類球狀體的形成有關(guān)[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干性相關(guān)基因Nanog、Sox2、c-Myc和Oct-4的表達(dá)水平與常規(guī)平板培養(yǎng)比較顯著增高，表明殼聚糖薄膜上培養(yǎng)的MSCs類球狀體的形成較常規(guī)平板培養(yǎng)更有助于維持MSCs干性相關(guān)基因的表達(dá)。是否與上述信號通路的激活相關(guān)需進(jìn)一步研究。

綜上所述，與常規(guī)平板培養(yǎng)比較，MSCs在殼聚糖薄膜上培養(yǎng)能夠形成類球狀體，干性相關(guān)基因的表達(dá)顯著上調(diào)，表明殼聚糖薄膜培養(yǎng)的MSCs在傳代過程中更好地保持了干性。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Delling U，Brehm W，Ludewig E，et al. Longitudinal evaluation of effects of intraarticular mesenchymal stromal cell administration for the treatment of osteoarthritis in an ovine model [J]. Cell Transplant，2015，24（11）：2391-2407.

[2] Saulnier N，Viguier E，Perrier-Groult E，et al. Intra-articular administration of xenogeneic neonatal Mesenchymal Stromal Cells early after meniscal injury down-regulates metalloproteinase gene expression in synovium and prevents cartilage degradation in a rabbit model of osteoarthritis [J]. Osteoarthritis Cartilage，2015，23（1）：122-133.

[3] Caldwell KL，Wang J. Cell-based articular cartilage repair：the link between development and regeneration [J]. Osteoarthritis Cartilage，2015，23（3）：351-362.

[4] 趙培慶，王連慶，李濤.間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中長鏈非編碼RNA調(diào)控作用研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2015， 12（18）：35-38.

[5] Delling U，Brehm W，Metzger M，et al. In vivo tracking and fate of intra-articularly injected superparamagnetic iron oxide particle-labeled multipotent stromal cells in an ovine model of osteoarthritis [J]. Cell Transplant，2015，24（11）：2379-2390.

[6] Chen K，Man C，Zhang B，et al. Effect of in vitro chondrogenic differentiation of autologous mesenchymal stem cells on cartilage and subchondral cancellous bone repair in osteoarthritis of temporomandibular joint [J]. Int J Oral Maxillofac Surg，2013，42（2）：240-248.

[7] Freitag J，Dan B，Boyd R，et al. Mesenchymal stem cell therapy in the treatment of osteoarthritis：reparative pathways，safety and efficacy-a review [J]. Bmc Musculoskeletal Disorders，2016，17（1）：1-13.

[8] Yiying QI，Chen G，F(xiàn)eng G. Osteoarthritis prevention and meniscus regeneration induced by transplantation of mesenchymal stem cell sheet in a rat meniscal defect model [J]. Experimental & Therapeutic Medicine，2016，12（1）：95-100.

[9] Phermthai T，Suksompong S，Tirawanchai N，et al. Epigenetic analysis and suitability of amniotic fluid stem cells for research and therapeutic purposes [J]. Stem Cells Dev，2013， 22（9）：1319-1328.

[10] Redaelli S，Bentivegna A，F(xiàn)oudah D，et al. From cytogenomic to epigenomic profiles：monitoring the biologic behavior of in vitro cultured human bone marrow mesenchymal stem cells [J]. Stem Cell Res Ther，2012，3（6）：47.

[11] Faghihi F，Mirzaei E，Ai J，et al. Differentiation Potential of Human Chorion-Derived Mesenchymal Stem Cells into Motor Neuron-Like Cells in Two- and Three-Dimensional Culture Systems [J]. Mol Neurobiol，2016， 53（3）：1862–1872.

[12] Frith JE，Thomson B，Genever PG. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential [J]. Tissue Eng Part C Methods，2010，16（4）：735-749.

[13] Wang W，Itaka K，Ohba S，et al. 3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells [J]. Biomaterials，2009，30（14）：2705-2715.

[14] Liu BH，Yeh HY，Lin YC，et al. Spheroid Formation and Enhanced Cardiomyogenic Potential of Adipose-Derived Stem Cells Grown on Chitosan [J]. Bioresearch Open Access，2013，2（1）：28-39.

[15] Huang YJ，Hsu SH. Acquisition of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem-like phenotypes within chitosan-hyaluronan membrane-derived 3D tumor spheroids [J]. Biomaterials，2014，35（38）：10070–10079.

[16] Cheng N，Wang S，Young T. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities [J]. Biomaterials，2012，33（6）：1748-1758.

[17] Yang CM，Huang YJ，Hsu SH. Enhanced autophagy of adipose-derived stem cells grown on chitosan substrates [J]. Bioresearch Open Access，2015，4（1）：89-96.

[18] Liu BH，Hsi-Yi Y，Lin YC，et al. Spheroid formation and enhanced cardiomyogenic potential of adipose-derived stem cells grown on chitosan [J]. Bioresearch Open Access，2013，2（1）：28-39.

[19] Cheng NC，Wang S，Young TH. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities [J]. Biomaterials，2012，33（6）：1748-1758.

[20] Huang GS，Dai LG，Yen BL，et al. Spheroid formation of mesenchymal stem cells on chitosan and chitosan-hyaluronan membranes [J]. Biomaterials，2011，32（29）：6929-6945.

（收稿日期：2016-06-30 本文編輯：程 銘）