蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)蛛絲功能化平臺(tái)的建立

林森珠，陳格飛,2，孟清

1 東華大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)研究所，上海 201620

2 卡羅林斯卡學(xué)院老年癡呆癥研究中心，瑞典 斯德哥爾摩 14157

蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)蛛絲功能化平臺(tái)的建立

林森珠1，陳格飛1,2，孟清1

1 東華大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)研究所，上海 201620

2 卡羅林斯卡學(xué)院老年癡呆癥研究中心，瑞典 斯德哥爾摩 14157

林森珠, 陳格飛, 孟清. 蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)蛛絲功能化平臺(tái)的建立. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(12): 1704-1714.

Lin SZ,Chen GF, Meng Q. Construction of spider silk functional platform via intein trans-splicing. Chin J Biotech, 2016, 32(12): 1704-1714.

為建立高效快捷的蛛絲功能化修飾平臺(tái)，蛋白質(zhì)內(nèi)含子的反式剪接技術(shù)被首次應(yīng)用于重組蛛絲的功能化修飾。在體外通過Ssp DnaB的反式剪接作用，在蛋白質(zhì)水平上將12 kDa泛素相關(guān)修飾蛋白(SUMO) 與蛛絲蛋白 (W2CT) 連接形成功能化蛛絲蛋白SUMOW2CT。修飾后SUMOW2CT與W2CT均能形成納米至微米級(jí)的絲纖維，但SUMOW2CT自動(dòng)成絲速度明顯下降且產(chǎn)量約為W2CT的一半。與W2CT絲纖維 (W) 相似，SUMOW2CT絲纖維 (UW) 不具有超收縮能力和對(duì)2%SDS不耐受，但機(jī)械性能低于W2CT絲纖維。功能化蛋白SUMOW2CT形成的絲纖維中SUMO蛋白仍保持著正確三維結(jié)構(gòu)，可被SUMO蛋白酶酶切。外源功能化蛋白質(zhì)雖在一定程度上降低了絲的形成速度和機(jī)械性能，但修飾上的功能化蛋白仍保持著生物活性，表明斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)的蛛絲修飾平臺(tái)成功建立，也為蛛絲的功能化修飾和應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的技術(shù)基礎(chǔ)。

重組蜘蛛絲，斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子，功能化修飾，重組葡萄狀腺絲蛋白，小分子泛素相關(guān)修飾蛋白

上海市科委攻關(guān)項(xiàng)目 (No. 14521100700)，上海市科委國(guó)際合作項(xiàng)目 (No. 14520720200)，國(guó)家外專局“高端外國(guó)專家項(xiàng)目”(No. GDW20143100071)，國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 31570721)，教育部直屬高校學(xué)校特色項(xiàng)目 (No. TS2011DHDX025) 資助。

生物材料在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有著重要的作用，可以作為傷口的縫合線、藥物載體和組織工程中的支架等。生物材料表面的化學(xué)特性極其重要，例如影響表面細(xì)胞的吸附能力，活化調(diào)節(jié)細(xì)胞繁殖、分化和存活的通路等[1-3]。作為生物材料的一種，絲纖維由于比表面積相對(duì)大、材質(zhì)柔和、吸附能力好以及容易加工改造成各種材料等特性而備受歡迎。天然的絲纖維材料，是大分子蛋白質(zhì)聚合物，由于具有良好的生物兼容性、不致毒性和潛在的生物活性等特性而被認(rèn)為是目前最具有潛能的生物材料[4]。目前最受研究者關(guān)注的蛋白質(zhì)來(lái)源天然絲纖維有蠶絲和蜘蛛絲兩種。蛛絲因?yàn)榫哂斜刃Q絲更好的機(jī)械性能和生物兼容性而備受研究者關(guān)注。但是由于蜘蛛的同類相食和蛛絲的難以收集，以及圈養(yǎng)獲得的蛛絲存在著性能的差異使得對(duì)蛛絲的研究比蠶絲緩慢許多[5]。

蠶絲來(lái)源的絲纖維在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域被應(yīng)用了幾十年，為了提高蠶絲纖維的表面化學(xué)特性，研究者們通過化學(xué)交聯(lián)法或者基因工程融合表達(dá)的方法在蠶絲纖維中引入具有結(jié)合功能或者催化功能的多肽，如引入細(xì)胞結(jié)合多肽[3,6]、生長(zhǎng)因子[4,7]、親和結(jié)構(gòu)[8]、增強(qiáng)綠色熒光蛋白[9]和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子[10]等。最近，又新發(fā)現(xiàn)的一種比化學(xué)交聯(lián)法更有效的方法，即通過控制蠶絲的膜的形成過程來(lái)載入功能性抗體[11]。由于蛛絲的研究相對(duì)蠶絲落后，蛛絲來(lái)源的絲纖維，還未商業(yè)化應(yīng)用。目前，國(guó)內(nèi)外科學(xué)家已經(jīng)嘗試在細(xì)菌、酵母、植物、昆蟲、哺乳類細(xì)胞以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中制備重組蛋白[4,12-13]。異源制備的重組蛛絲蛋白質(zhì)在體外能夠加工成為各種各樣的類絲結(jié)構(gòu)，如纖維、膜和泡沫等[4,14-19]。為了進(jìn)一步提高重組蛛絲纖維的生物活性，已經(jīng)有研究者通過基因重組技術(shù)，將短的細(xì)胞結(jié)合多肽修飾重組蛛絲蛋白上，并被證實(shí)能夠提高重組絲纖維的生物親和性[20-21]。此外，更大蛋白，如誘導(dǎo)礦物質(zhì)化蛋白以及抗菌肽，也已用來(lái)和蛛絲蛋白融合表達(dá)，最終形成的絲狀復(fù)合物不僅具有了絲纖維的特性而且擁有外源蛋白的特性[22-27]。近期研究者還將蛛絲蛋白和生物素結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合表達(dá)，形成的絲纖維能夠捕捉帶有生物素修飾的復(fù)合物[28]。

圓網(wǎng)蜘蛛能夠制備6種絲纖維和1種類膠物質(zhì)，其中包裹絲因?yàn)樗鼜?qiáng)度和彈性的完美結(jié)合，是幾種絲中韌性最好的絲，也是近幾年來(lái)除了拖絲之外備受研究者關(guān)注的蛛絲。我們實(shí)驗(yàn)室前期研究的三帶金蛛Argiope trifasciata來(lái)源的含有兩個(gè)重組模塊以及C端非重復(fù)區(qū)的重組葡萄狀絲蛋白 (W2CT) 可以在大腸桿菌中高效表達(dá)，并且能夠在體外生理環(huán)境下手動(dòng)拉成絲[17]。

基于前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，我們?cè)O(shè)想這種簡(jiǎn)單易表達(dá)的，并且在生理?xiàng)l件下容易成絲的絲纖維能否像蠶絲或者拖絲那樣在絲纖維表面展示功能性蛋白，從而對(duì)該絲進(jìn)行功能化修飾。以往的功能化修飾的方法中，化學(xué)交聯(lián)法具有一定的隨機(jī)性，效率相對(duì)較低，蛋白質(zhì)融合表達(dá)，雖然可以將蛋白質(zhì)特意修飾在N端或者C端，但由于蛛絲蛋白的特殊性 (高度重復(fù)性)，在構(gòu)建重組克隆的過程中，容易導(dǎo)致額外的同源重組，致使構(gòu)建克隆和蛋白質(zhì)表達(dá)失敗的風(fēng)險(xiǎn)性比較高。另外當(dāng)需要對(duì)多個(gè)蛛絲進(jìn)行多個(gè)活性蛋白分別修飾的時(shí)候，就涉及到構(gòu)建多個(gè)克隆，增加了實(shí)驗(yàn)的工作量。因而，在本實(shí)驗(yàn)中，我們引入了蛋白質(zhì)內(nèi)含子。將釀酒酵母來(lái)源的12 kDa小分子泛素相關(guān)修飾蛋白 (Small ubiquitin-related modifier，SUMO) 作為模式功能性的蛋白來(lái)修飾蛛絲蛋白。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Ssp DnaB S0斷裂蛋白質(zhì)介導(dǎo)的反式剪接，可以成功地將一個(gè)12 kDa的蛋白質(zhì)在體外蛋白質(zhì)水平上連接到重組蛛絲蛋白的N端，形成的融合蛋白不僅具有自動(dòng)成絲的特性，而且維持了SUMO蛋白的正確折疊，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)的蛛絲功能化修飾的可行性，為蛛絲的高效快捷功能化修飾提供技術(shù)平臺(tái)。

1 材料與方法

1.1 克隆的構(gòu)建、表達(dá)以及斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)的反式剪接

將兩端引入BSaⅠ和BfuAⅠ限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的模式蛋白SUMO以及蛛絲蛋白W2CT的編碼基因，分別經(jīng)BSaⅠ和BfuAⅠ限制性內(nèi)切酶 (Fermentas公司) 酶切，再由T4DNA連接酶 (Fermentas公司) 分別連入經(jīng)過改造的表達(dá)載體pERBnH和pEHRBc (表達(dá)載體帶有2個(gè)限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)BSaⅠ和BfuAⅠ；6個(gè)His的純化標(biāo)簽 (用H表示)；Ssp DnaB S0斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的N端片段或者C端片段) 獲得重組質(zhì)粒pEURBnH和pEHRBcW2CT，預(yù)表達(dá)的重組融合蛋白為SUMORBnH和HRBcW2CT (圖1)。

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入BL21 DE3 (Novagen)細(xì)胞中，37 ℃培養(yǎng)至A600約為0.8時(shí)，分別加入終濃度為0.8 mmol/L的IPTG，25 ℃過夜誘導(dǎo)表達(dá)。室溫7 500 r/min離心 5 min收集細(xì)胞，緩沖液 (50 mmol/L NaH2PO4，pH 8.0，300 mmol/L NaCl) 重懸細(xì)胞后，在冰上超聲破碎90次，每次5 s (JY92-Ⅱ超聲破碎儀器，寧波新芝生物科技股份有限公司，中國(guó))。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)C端前體蛋白HRBcW2CT形成包涵體，N端前體蛋白SUMORBnH是可溶性的。HRBcW2CT包涵體通過用8 mol/L尿素以及超聲波破碎來(lái)協(xié)助溶解，溶解的混合物在室溫下10 000 r/min，離心30 min，保留上清液，將上清液梯度透析到4 mol/L的尿素，然后透析液轉(zhuǎn)入預(yù)處理的Ni-NTA柱(Qiagen，Germany)，并梯度沖洗來(lái)降低尿素的濃度 (從4 mol/L到0 mol/L)，C端前體最后被平衡在50 mmol/L K3PO4緩沖液 (pH 7.5) 中并被保留在柱子上備用?？扇苄缘鞍譙UMORBnH根據(jù)Ni-NTA柱 (Qiagen，Germany) 純化手冊(cè)直接進(jìn)行非變性純化，但是在最后一步N端前體被保留在柱子上，并且用50 mmol/L K3PO4緩沖液 (pH 7.5) 平衡。

蛋白質(zhì)的剪接反應(yīng)是將保留在柱子上的N前體 (SUMORBnH-Beads) 和C前體 (Beads-HRBcW2CT) 進(jìn)行摩爾比2∶1混合后加入終濃度1 mmol/L的DTT (二硫蘇糖醇)，在4 ℃過夜剪接。所得的穿柱液就是我們所需要的修飾的融合蛋白SUM0W2CT。蛛絲蛋白W2CT的獲得方法，參見我們前期的實(shí)驗(yàn)[17]。

圖1 質(zhì)粒構(gòu)建、蛋白表達(dá)和反式剪接流程圖Fig. 1 Flow chart for plasmid construction, protein expression and split intein trans-splicing.

1.2 重組蜘蛛絲的制備及其定量

750 μL相同濃度 (1 mg/mL) 的蛋白質(zhì)溶液SUMOW2CT和W2CT在與200 μL的Ni-NTA柱子混合后，固定在旋轉(zhuǎn)儀器上的同一個(gè)圓周的位置，轉(zhuǎn)速20 r/min、25 ℃。分別在0、2、4、6、24 h，挑出絲放于緩沖液中拍照記錄絲的形成速度。24 h后，將所成的絲挑出，用足量的磷酸鉀緩沖液沖洗后，平鋪在光學(xué)顯微鏡下拍照觀察絲的形態(tài)。隨后兩組絲分別被溶解在含有10%的SDS溶液中，通過SDS-PAGE膠，對(duì)比形成絲的蛋白質(zhì)的量。

1.3 雜合蛛絲上修飾蛋白的活性檢測(cè)

SUMOW2CT在旋轉(zhuǎn)儀上所形成的絲被挑出，用1 mL的50 mmol/L K3PO4緩沖液 (pH 7.5)充分沖洗后分為兩組。第1組用于檢測(cè)SUMO的活性，在第1組中加入100 μL緩沖液，SUMO酶以及終濃度1 mmol/L的DTT，25 ℃反應(yīng)4 h。將絲取出溶解于10%的SDS溶液中，再混合回溶液中，加入上樣緩沖液，SDS-PAGE膠檢測(cè)樣品。第2組作為對(duì)照，是為了檢測(cè)絲中是否吸附游離的SUMOW2CT，第2組的處理方法與第1組一樣除了沒有加SUMO蛋白酶。浸泡上清取出，加入上樣緩沖液，通過SDS-PAGE膠，檢查是否具有游離的SUMOW2CT。

1.4 重組蛛絲性能測(cè)試

來(lái)自蛋白質(zhì)溶液W2CT的重組絲 (W) 和來(lái)自蛋白質(zhì)溶液SUMOW2CT的重組絲 (UW)被手動(dòng)拉出，并固定在C形卡上[17]。

固定在C型卡上的絲分別取10根用于超收縮和化學(xué)抵抗性檢測(cè)。即將C型卡中間的橋折疊，然后在絲上加入50 μL的去離子水或者2% SDS溶液，光學(xué)顯微鏡下放大倍數(shù)1 000倍拍照檢測(cè)。

每種絲取10根用于在溫度為 (22.0±2) ℃，濕度約為40%的條件下測(cè)定絲的力學(xué)性能(Agilent T150 UTM，Agilent technologies，美國(guó))。

2 結(jié)果與討論

蜘蛛絲纖維經(jīng)過長(zhǎng)久的自然進(jìn)化，綜合品質(zhì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于現(xiàn)階段的人工合成材料，被認(rèn)為是最具有潛力的生物材料，在醫(yī)學(xué)尤其是組織工程方面具有十分誘人的應(yīng)用前景。蜘蛛絲主要由高分子量的絲素蛋白組成，絲素蛋白由于N端非重復(fù)區(qū)、中間占90%含量的重復(fù)區(qū)和C端非重復(fù)區(qū)組成，其中中間的重復(fù)區(qū)對(duì)蛛絲的性能具有決定性的作用[16]。在本實(shí)驗(yàn)中，兩個(gè)重復(fù)模塊的三帶金蛛Argiope trifasciata來(lái)源的包裹絲再加上C端非重復(fù)區(qū)重組包裹絲絲蛋白(W2CT) 和實(shí)驗(yàn)室比較容易獲得的模式蛋白SUMO被用來(lái)進(jìn)行試驗(yàn)。只有具有正確三維結(jié)構(gòu)的SUMO蛋白才能夠被SUMO蛋白酶識(shí)別并且酶切下來(lái)，因而我們通過檢測(cè)絲纖維上SUMO是否可以被SUMO蛋白酶酶切來(lái)判斷重組包裹絲可否展示活性的蛋白。從而來(lái)驗(yàn)證通過蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)的蛛絲的功能化修飾是否具有可行性。

2.1 功能化蛛絲蛋白的制備

蛋白質(zhì)內(nèi)含子是一類介導(dǎo)它兩端的蛋白質(zhì)外顯子通過肽鍵進(jìn)行連接，然后自身從前體蛋白質(zhì)中剪切出來(lái)的蛋白質(zhì)。其中S0斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子是在微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子的基礎(chǔ)上，將蛋白質(zhì)內(nèi)含子斷裂成10 kDa左右的N端前體和6 kDa左右的C端前體，N端前體和C端前體在體外仍能夠識(shí)別對(duì)方，進(jìn)行高效剪接，因而具有很高的通用性。最近Hauptmann和他的合作伙伴利用蛋白質(zhì)內(nèi)含子隨機(jī)性剪接獲得了含有天然蛛絲蛋白大小的重組鞭毛狀腺絲蛋白的混合物，解決了大分子量的蛛絲難以表達(dá)的難題，為蜘蛛絲的人工合成開拓了新的方法[29]。在本實(shí)驗(yàn)中的蛋白質(zhì)內(nèi)含子Ssp DnaB S0在外顯子是W2或者C8CT的時(shí)候具有約80%?90%的剪接活性因而被用在本實(shí)驗(yàn)中作為修飾的媒介[17]。構(gòu)建含有N端蛋白質(zhì)內(nèi)含子和C端蛋白質(zhì)內(nèi)含子表達(dá)載體后 (圖1，Vector)，只要將功能蛋白質(zhì)基因以及蛛絲蛋白的基因酶切連接進(jìn)入載體中(圖1，Plasmid)，表達(dá)產(chǎn)物體外剪接后即可以實(shí)現(xiàn)蛛絲蛋白在蛋白水平上的修飾 (圖1，Splicing product)。蛋白質(zhì)內(nèi)含子的引入，不僅能夠使得蛛絲的修飾高效快捷而且解決蜘蛛絲蛋白與不同蛋白質(zhì)融合表達(dá)有可能導(dǎo)致不表達(dá)的風(fēng)險(xiǎn)。例如當(dāng)對(duì)于3種不同來(lái)源的蜘蛛絲，需要分別被3種不同的功能蛋白進(jìn)行修飾時(shí) (圖2)，如果通過基因工程的手段在基因水平上構(gòu)建融合克隆的話，需要構(gòu)建9個(gè)克隆隨后表達(dá)9個(gè)蛋白質(zhì)，每個(gè)蛋白都有可能因?yàn)橹虢z重復(fù)片段的特點(diǎn)導(dǎo)致難以構(gòu)建克隆或者難以表達(dá) (圖2A)。蛋白質(zhì)內(nèi)含子的引入后，卻只需要6個(gè)克隆表達(dá)6個(gè)前體蛋白。其中3個(gè)表達(dá)N端前體蛋白 (功能蛋白基因與N端蛋白質(zhì)內(nèi)含子基因融合表達(dá)后的前體蛋白)，另外3個(gè)是C端前體蛋白 (C端蛋白質(zhì)內(nèi)含子分別與3種絲纖維蛋白進(jìn)行融合表達(dá))。蛋白質(zhì)內(nèi)含子分子量相對(duì)較小，與外顯子融合的時(shí)候，降低了克隆和表達(dá)的難度。此外6 kDa的C端蛋白質(zhì)內(nèi)含子前體與絲纖維基因融合表達(dá)的時(shí)候，融合蛋白難以表達(dá)的風(fēng)險(xiǎn)明顯小于大分子功能蛋白與蛛絲融合表達(dá)。再者在蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)的修飾系統(tǒng)中，只有3個(gè)融合蛋白質(zhì)需要考慮到可能由于蛛絲的重復(fù)片段的存在會(huì)導(dǎo)致難以克隆與表達(dá)的問題，即3個(gè)C端蛋白質(zhì)前體，一旦這3個(gè)都能表達(dá)，那么在體外混合，通過蛋白質(zhì)水平的反式剪接，就可以獲得我們想要的9個(gè)功能性蛋白 (圖2B)。總體說來(lái)，蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)的蛛絲功能化，能夠有效減少克隆構(gòu)建和蛋白質(zhì)表達(dá)的數(shù)目，降低克隆構(gòu)建和蛋白質(zhì)表達(dá)的風(fēng)險(xiǎn)，減少了實(shí)驗(yàn)研究的難度，縮短了時(shí)間，從而能有效加快實(shí)驗(yàn)進(jìn)程和降低實(shí)驗(yàn)成本。

圖2 蛛絲蛋白功能化修飾方法比較Fig. 2 Comparison Analysis on different silk protein functionalized methods. (A) Silk protein fused with active protein by genetical method. (B) Silk protein functionalized via S0 split intein trans-splicing.

此外，實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)過程中，6個(gè)組氨酸的純化標(biāo)簽被融合在N端蛋白質(zhì)內(nèi)含子的C末端和C端蛋白質(zhì)內(nèi)含子的N末端，當(dāng)反式剪接反應(yīng)發(fā)生后，前體和剪接副產(chǎn)物因?yàn)槎加械鞍踪|(zhì)內(nèi)含子所以都具有6個(gè)組氨酸純化標(biāo)簽，而剪接產(chǎn)物(SUMOW2CT) 沒有，這給蛋白質(zhì)純化提供了便利。將剪接反應(yīng)直接在Ni-NTA純化柱上進(jìn)行，這種純化柱上剪接，節(jié)省掉了傳統(tǒng)的剪接方法的4個(gè)步驟：1) 前體蛋白質(zhì)從柱上洗脫；2) 透析掉咪唑；3) 反式剪接反應(yīng)；4) 再過柱子獲得穿柱液 (圖3A)。柱上剪接反應(yīng)結(jié)束后，所得到的穿柱液就是我們所需要的目的蛋白質(zhì) (圖3B)。

實(shí)驗(yàn)中N端前體蛋白SUMORBnH和C端前體蛋白HRBcW2CT在1 L LB溶液中的表達(dá)量約為60 mg/L，經(jīng)過剪接反應(yīng)，獲得的剪接產(chǎn)物約30 mg/L (圖4)，和融合表達(dá)獲得的6×His-sumo-W2CT相比，產(chǎn)量并沒有太多的變化[17]。高效率剪接活性的S0蛋白質(zhì)內(nèi)含子的引入，以及柱上剪接的可行性 (80%的柱上剪接效率) (圖4，泳道2)，使得剪接后蛋白質(zhì)的獲得量并沒有減少。高剪接效率的斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的柱上剪接，不僅降低了由于這些步驟所帶來(lái)的蛋白質(zhì)產(chǎn)量的損失，而且也給修飾蛋白質(zhì)純化節(jié)省了時(shí)間和成本。并且剪接產(chǎn)物中沒有任何額外的純化標(biāo)簽的污染 (圖4，泳道3)。

圖3 柱上剪接流程圖Fig. 3 Comparison analysis on different silk protein functionalized methods. (A) Silk protein fused with active protein by genetical method. (B) Silk protein functionalized via S0 split intein trans-splicing.

圖4 重組絲蛋白的功能化的修飾-反式剪接Fig. 4 Recombinant spider silk functionalized by SUMO via intein trans splicing. M: marker; 1: mixture contains N-precursor protein (SUMORBnH-Beads) and C-precursor protein (Beads-HRBcW2CT); 2: splicing product from trans-splicing reaction; 3: flow though from Ni-NTA beads (SUMOW2CT).

2.2 功能化蛛絲的形成，產(chǎn)量的檢測(cè)以及功能蛋白的生物活性的檢測(cè)

在蛋白質(zhì)自動(dòng)成絲實(shí)驗(yàn)過程中，為了使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具有可比性，兩種相同濃度的蛋白質(zhì)溶液被用于做平行試驗(yàn)。一種蛋白質(zhì)溶液是只含有W2CT，另外一種蛋白質(zhì)溶液修飾的融合蛋白即SUMOW2CT。在自發(fā)成絲的過程中，由于絲的形成需要一定的剪切力，所以200 μL的Ni-NTA被加入到旋轉(zhuǎn)儀上的溶液中。在我們的預(yù)實(shí)驗(yàn)過程中，Ni-NTA的加入能夠有效加快自動(dòng)成絲的速度。在成絲的過程中，我們發(fā)現(xiàn)，W2CT (圖5，A-E)的成絲速度明顯快于SUMOW2CT (圖5，F(xiàn)-J)，W2CT在旋轉(zhuǎn)儀上2 h (圖5B) 就已經(jīng)明顯有絲的形成，而SUMOW2CT (圖5G) 卻還沒有明顯地成絲。4 h的時(shí)候 (圖5，C和H) 也是一樣。只有在6 h的時(shí)候SUMOW2CT才明顯出現(xiàn)絲纖維(圖3I)，這說明在絲的形成過程中，蛋白質(zhì)的N末端的靈活性對(duì)于絲的形成起著至關(guān)重要的作用。這與之前研究中發(fā)現(xiàn)的重組包裹絲單個(gè)重復(fù)模塊的N端的結(jié)構(gòu)具有一定的活動(dòng)性是一致的[30]。相同時(shí)間24 h后所成的絲的蛋白質(zhì)含量進(jìn)行對(duì)比 (圖6，泳道1和2)，發(fā)現(xiàn)W絲的蛋白質(zhì)含量是UW的1.8倍。進(jìn)一步說明在相同的條件下，修飾后的蛛絲蛋白雖然仍能夠自發(fā)形成絲纖維，但是成絲的能力有所下降。

圖5 重組絲成絲能力分析Fig. 5 Fiber assembling ability analysis. (A-E) W fibers formed from protein W2CT. (F-Z) UW fibers formed from protein SUMOW2CT. Protein was added to the 1 mL centrifuge tube and fixed on rotor with a speed of 20 r/min for 0 h (A, F); 2 h (B, G); 4 h (C, H); 6 h (D, I); 24 h (E, J).

圖6 通過SDS-PAGE膠對(duì)所成的絲定量Fig. 6 Quantity analysis by SDS-PAGE gel. M: marker; lane 1 and lane 2 are samples from W and UW fibers receptivity.

將所形成的絲浸泡在生理環(huán)境下，加入SUMO蛋白酶，室溫酶切結(jié)果顯示，相對(duì)于酶切前 (圖7，泳道1)，50%的絲纖維上的SUMO蛋白被酶切下來(lái) (圖7，泳道2)。相對(duì)于游離的絲纖維蛋白來(lái)說，在同等條件下100%酶切效率(圖7，泳道4和5)。導(dǎo)致絲纖維上SUMO蛋白酶切下來(lái)效率降低的原因可能為：1) 由于絲纖維蛋白質(zhì)是混聚集體，導(dǎo)致了分子的流動(dòng)性降低，從而使得局部的蛋白酶濃度低于對(duì)照組；2) 展示的SUMO蛋白只有50%展示在表面，蛋白酶沒有辦法進(jìn)入到絲纖維里面去酶切纖維內(nèi)部的SUMO蛋白，所以酶切效率降低；3) 只有50%的SUMO蛋白維持著正確的三維結(jié)構(gòu)。但是不管哪種原因?qū)е旅盖谢钚越档?，?duì)旋轉(zhuǎn)儀上自發(fā)形成的絲上的功能蛋白的活性檢測(cè)顯示，重組包裹絲W2CT能夠展示具有活性的功能蛋白，也說明了蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)的蛛絲功能化修飾的成功。

圖7 SDS-PAGE膠檢測(cè)SUMO酶酶切Fig. 7 SUMO protease digestion result was analyzed by SDS-PAGE gel. M: marker; 1: fibers before mixing with SUMO protease; 2: fibers mixed with SUMO protease for 4 h; 3: buffer extracting from fibers' leaching; 4: protein solution SUMO-W2CT before mixing with SUMO protease; 5: protein solution SUMO-W2CT mixed with SUMO protease for 4 h.

2.3 功能化蛛絲的性能檢測(cè)

雖然絲的成絲速度受到了影響，但是研究發(fā)現(xiàn)，兩種蛋白溶液旋轉(zhuǎn)儀上旋轉(zhuǎn)4 h后，都形成了絲的聚集物，該絲的聚集物在1 000倍顯微鏡下都可以清楚地看到納米級(jí)到微米級(jí)左右的絲纖維 (圖8A和C)。隨后，為進(jìn)一步研究修飾后絲的性能是否有影響，絲從蛋白溶液中被拉出和固定在C型卡上。并且進(jìn)行了超收縮和化學(xué)抵抗性測(cè)試。和W2CT形成的絲一樣，SUMOW2CT形成的絲不具有超收縮能力，并且在2%的SDS溶液中1 s內(nèi)就被溶解 (圖8B和D)。這說明外源蛋白的引入，并沒有對(duì)絲的超收縮、化學(xué)抵抗性產(chǎn)生以及表面結(jié)構(gòu)并產(chǎn)生影響。但是進(jìn)一步的機(jī)械性能檢查發(fā)現(xiàn)，修飾后的絲的性能即彈性有所下降 (表1，圖9)，從而導(dǎo)致了絲的整體性能的下降。所以通過剪接修飾的絲，雖然并沒有影響絲的超收縮和化學(xué)抵抗性，但是卻對(duì)絲的機(jī)械性能產(chǎn)生一定程度的影響，使得絲的彈性降低。蛋白修飾的引入使得絲的機(jī)械性能的降低這一缺陷，可以通過制備雜合絲來(lái)改善絲的性能。我們的雜合絲研究發(fā)現(xiàn)，通過在包裹絲中引入拖絲成分，能夠有效提高絲的機(jī)械性能，因而后期如果功能性修飾包裹絲所形成的絲性能如果達(dá)不到實(shí)驗(yàn)的要求可以采用修飾雜合絲的方法來(lái)克服這一困難。

圖8 光學(xué)顯微鏡觀察自動(dòng)形成的絲以及手動(dòng)拉的絲的超收縮和化學(xué)抵抗性Fig. 8 Observation under light microscope (scare bar=50 μm). A,C are fibers self- assemble in centrifuge tube, while B and D are fiber drawn by hand, the shadow is 2% SDS solution.

表1 重組絲的機(jī)械性能Table 1 Mechanical property

圖9 重組絲的機(jī)械性能Fig. 9 Mechanical property of represent fibers.

3 總結(jié)

實(shí)驗(yàn)研究構(gòu)建了含有蛋白質(zhì)內(nèi)含子的載體，為后續(xù)的絲蛋白的蛋白質(zhì)功能化修飾提供了便利，并且純化標(biāo)簽的設(shè)計(jì)，S0高剪接效率的斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的應(yīng)用再加上柱上剪接的高效進(jìn)行，使得獲取修飾蛋白的步驟簡(jiǎn)單、方便。最終獲得的功能化蛛絲蛋白不帶有任何額外的純化標(biāo)簽，避免給功能化的蛛絲帶來(lái)額外的污染。

自動(dòng)旋轉(zhuǎn)儀成絲速度快、方法簡(jiǎn)便，該方法用于預(yù)實(shí)驗(yàn)中制備后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需要的材料，方法簡(jiǎn)單、方便。自動(dòng)成絲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，活性蛋白對(duì)蛛絲的蛋白W2CT的N端功能化修飾確實(shí)會(huì)影響絲的形成速度和產(chǎn)量，但是并不影響絲的形成。絲的超收縮和化學(xué)抵抗性顯示，絲的這些性能沒有得到太大的改變，雖然修飾后的絲纖維的性能有所下降。此外，絲的表面蛋白的展示活性檢測(cè)，結(jié)果表明形成的絲纖維中的外源性蛋白，仍然保持著本身的活性。即被活性蛋白修飾的包裹絲不僅具有了包裹絲本身的特性還具有了活性蛋白的特性，說明了修飾的成功，也說明了修飾平臺(tái)的確立，為蛛絲蛋白質(zhì)的功能化提供了高效快捷的技術(shù)手段。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Qing Meng. Tel: +86-21-67792651; Fax: +86-21-67792647; E-mail: mengqing@dhu.edu.cn

Construction of spider silk functional platform via intein trans-splicing

Senzhu Lin1, Gefei Chen1,2, and Qing Meng1
1 Institute of Biological Sciences and Biotechnology, Donghua University, Shanghai 201620, China
2 Center for Alzheimer Research, Karolinska Institute, Stockholm 14157, Sweden

To provide technical support for spider silk functional modification, we developed a simple and efficient functional platform via intein trans-splicing. Small ubiquitin-related modifier protein (SUMO) was fused to the recombinant spider silk protein (W2CT) by peptide bond via S0 split intein Ssp DnaB trans-splicing, resulting in a protein SUMOW2CT. However, incorporation of exogenous protein led to mechanical property defect and lower fiber yield, and also slowed down the fiber assembly velocity but no obvious differences in supercontraction and chemical resistance when compared with fibers from W2CT (W). SUMO protease digestion showed positive results on the fibers, indicating that the SUMO protein kept its native conformation and bioactive. Above all, this work provides a technical support for spider silk high simply and efficient functionalized modification.

recombinant spider silk, split intein, functionalized modification, recombinant aciniform silk protein, small ubiquitin-related modifier

Supported by:Shanghai Science and Technology Research Projects (No. 14521100700), International Cooperation Project of Shanghai Science and Technology Committee (No. 14520720200), International Experts' Project of the State Administration of Foreign Experts Affairs in China (No. GDW20143100071), National Nature Science Foundation of China Research (No. 31570721), Universities Characteristic Project of the Ministry of Education of China (No. TS2011DHDX025).

Received:April 17, 2016;Accepted:June 12, 2016