小麥糖轉(zhuǎn)運蛋白基因 TaSWEET6的克隆與表達分析

徐 磊，王偉偉，蘇世超，馬錦繡，孫 輝，房兆峰，高世慶，唐益苗，趙昌平，蔣 濤

(1.首都師范大學生命科學學院，北京 100048； 2.北京市農(nóng)林科學院北京雜交小麥工程技術研究中心，北京100097)

小麥糖轉(zhuǎn)運蛋白基因 TaSWEET6的克隆與表達分析

徐 磊1，王偉偉2，蘇世超2，馬錦繡2，孫 輝2，房兆峰2，高世慶2，唐益苗2，趙昌平2，蔣 濤2

(1.首都師范大學生命科學學院，北京 100048； 2.北京市農(nóng)林科學院北京雜交小麥工程技術研究中心，北京100097)

植物SWEET基因家族是一類糖轉(zhuǎn)運蛋白，參與生殖發(fā)育、衰老、逆境響應等多個生理過程。為研究小麥SWEET基因?qū)δ婢趁{迫的響應及其在花藥發(fā)育過程中的功能，采用同源克隆的方法從普通六倍體小麥中克隆出 TaSWEET6基因(GenBank登錄號為KU936097)后對其進行染色體定位、同源蛋白序列比對和系統(tǒng)進化樹分析，同時分析 TaSWEET6基因于普通六倍體小麥在正常生長情況下及非生物脅迫條件下不同組織器官中和光溫敏雄性不育小麥BS366在不同發(fā)育時期的花藥中的表達模式。序列分析結果表明， TaSWEET6基因包含1個732 bp的完整開放閱讀框，編碼243個氨基酸。跨膜結構分析得知，TaSWEET6蛋白包含2個Mtn3_slv跨膜結構域和1個起連接作用的跨膜-螺旋。系統(tǒng)進化樹分析表明，TaSWEET6蛋白與大麥處于同一分支，其親緣關系最近。中國春缺四體定位表明， TaSWEET6基因位于7D染色體上。表達分析表明， TaSWEET6基因在小麥根、莖、葉、種子、小花(除去雄蕊)、各時期雄蕊中均有表達，小孢子時期雄蕊表達量最高；在低溫、干旱、NaCl和ABA脅迫處理下， TaSWEET6基因表達均有上調(diào)；光溫敏雄性不育系BS366在不育環(huán)境(低溫短日照)下， TaSWEET6 基因在雄蕊發(fā)育關鍵時期(二分體時期)高度表達。說明小麥 TaSWET6基因可能參與了多種逆境應答反應，并在小麥雄蕊發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。

小麥；糖轉(zhuǎn)運蛋白；非生物脅迫；雄性不育

SWEET基因家族編碼具有2個MtN3/saliva保守跨膜結構域的糖轉(zhuǎn)運蛋白[1]，因該蛋白作為糖轉(zhuǎn)運載體參與糖的運輸被命名為SWEET[2-3]。MtN3結構域最早在苜蓿根部結瘤素中被發(fā)現(xiàn)[4]。此后，在動物、植物、細菌等生物中也被相繼發(fā)現(xiàn)[1]。與其他生物相比，植物中分布的SWEET基因最多，如擬南芥有17個、水稻有21個、高梁有21個[5-6]。研究表明，SWEET基因參與調(diào)控糖在韌皮部的長距離離子運輸、生殖發(fā)育、衰老、生物和非生物脅迫應答等[7]。如擬南芥中 AtSWEET11和 AtSWEET12在韌皮部薄壁組織表達，可以將葉片中的蔗糖轉(zhuǎn)運至維管束中。 AtSWEET11和 AtSWEET12在氨基酸水平上同源度高達88%，各自的T-DNA插入突變體與對照相比較沒有明顯的形態(tài)學表型變化，但 AtSWEET11和 AtSWEET12的雙突變體表現(xiàn)為植株矮小，葉片中蔗糖、己糖含量增加，維管束中蔗糖含量減少[8-9]。水稻中， Xa13/Os8N3/OsSWEET11在小花和雄蕊中的表達量遠高于其他組織，其轉(zhuǎn)基因沉默植株表現(xiàn)為花粉母細胞在單核花粉期停止發(fā)育，并且未成熟的花粉開始退化，導致雄配子育性降低或者高度雄性不育[10]。同時，還發(fā)現(xiàn) Os11N3/OsSWEET14突變體生長延遲和籽粒變小[11]。擬南芥 RPG1/AtSWEET8編碼一個花粉母細胞和絨氈層特異表達的蛋白，在花粉外壁外層的形成過程中起重要作用[2,12]。 RPG1/AtSWEET8在胚囊中也表達，可能參與到雌配子發(fā)育過程的調(diào)節(jié)。擬南芥 SAG29/AtSWEET15受低溫、高鹽和干旱脅迫誘導，其超量表達轉(zhuǎn)基因植株對高鹽脅迫高度敏感，并且其根系細胞耐受力減弱[13-14]。抑制 OsSWEET11或 OsSWEET14的表達使水稻白葉枯病菌的抗性提升[10-11]。

小麥是全球最重要的糧食作物之一。然而，關于小麥SWEET基因及其表達調(diào)控等目前還未見報道。鑒于此，本研究擬采用同源克隆的方法從普通六倍體小麥中克隆出SWEET基因后對其進行染色體定位、同源蛋白序列比對和系統(tǒng)進化樹分析，同時研究其在低溫、干旱、高鹽和ABA等環(huán)境脅迫處理下的組織特異性表達情況及其在小麥雄性不育中的表達調(diào)控機制，旨在為進一步研究小麥SWEET基因參與逆境脅迫反應及其在雄性不育中的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料及其處理

光溫敏雄性不育系BS366及普通六倍體小麥京花9號和揚麥12由本實驗室保存，中國春及其缺四體(N7AT7B、N7BT7A、N7DT7B)由中國農(nóng)業(yè)科學院葉興國研究員提供。

將京花9號的種子置于培養(yǎng)間于25 ℃、16 h·d-1光照水培培養(yǎng)，待幼苗水培生長2周(14 d)后進行干旱(濾紙吸干水，空氣中晾干)、高鹽(250 mmol·L-1NaCl)、脫落酸(200 mol·L-1ABA)、低溫(4 ℃)脅迫處理，然后分別在0、1、2、5、10、24 h后取各處理幼苗葉片，液氮冷凍，-80 ℃保存，用于目的基因的脅迫表達分析。將揚麥12種植于北京海淀田間，根、莖、葉、小花(除雄蕊)取于花藥減數(shù)分裂前期，雄蕊分別取于減數(shù)分裂前(premeiosis stage)、減數(shù)分裂時期(meiosis stage)及小孢子期(young microspore stage)，種子取于開花后15 d，液氮冷凍，-80 ℃保存，用于目的基因的組織特異性表達分析。挑選籽粒飽滿的中國春及其缺四體小麥種子，水培生長2周(14 d)，取幼苗葉片于液氮冷凍，-80 ℃保存，用于基因染色體定位。光溫敏雄性不育系BS366種植于北京(長日照、高溫)和安徽阜陽(短日照、低溫)田間，待小麥挑旗以后，分別取減數(shù)分裂前(premeiosis stage)、二分體時期(dyad stage)、四分體時期(tetrad stage)和小孢子期(young microspore stage)的雄蕊，取材方法參照Tang等[15]的方法，液氮冷凍，-80 ℃保存，用于分析目的基因在可育環(huán)境下和不育環(huán)境下雄蕊中的表達特性。

1.2 DNA和RNA的提取及cDNA的合成

利用 CTAB 法提取小麥葉片基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。用Trizol法提取小麥不同組織器官及幼苗的總RNA，經(jīng) DNase I(Promega，美國)處理后作為模板，以Oligo dT為引物，用 PrimeScriptTMRT reagent Kit(Takara，日本)反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 TaSWEET6基因的克隆

調(diào)取NCBI的UNIGENE數(shù)據(jù)庫中Ta.23687的所有EST序列，利用在線工具CAP3(http://doua.prabi.fr/software/cap3)對EST序列進行拼接，將拼接好的序列在Gramene的普通六倍體小麥基因組數(shù)據(jù)庫(IWGSC1.0+popseq)中進行Blastn同源比對分析，然后選取相似度達100%的序列Traes_7DL_015FBEE0C.1設計引物SWEET-cDNA-F/SWEET-cDNA-R(表1)。以揚麥12的小孢子時期雄蕊cDNA為模板進行PCR擴增。擴增體系20 μL，包括2×TransTaqHigh Fidelity PCR SuperMix(Transgen，北京) 10 μL、模板DNA(100 ng· L-1)1 μL、上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL、ddH2O 7 μL。擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。目的片段純化后克隆到pEASY-Blunt Zero(Transgen,北京) 載體上，經(jīng)PCR和酶切鑒定后測序(北京六合華大基因公司)。

1.4 TaSWEET6蛋白的生物信息學分析

利用Pfam(http://pfam.xfam.org/)和TMHMM(www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/) 預測TaSWEET6蛋白的跨膜結構。

以TaSWEET6蛋白序列為目標序列，在Phytozome11 (www.phytozome.jgi.doe.gov/) 和Gramene (www.gramene.org/) 網(wǎng)站搜索，獲得粗山羊草 (Aegilopstauschii)、烏拉爾圖小麥(Triticumurartu)、大麥(Hordeumvulgare)、短柄草(Brachypodiumdistachyon)、玉米(Zeamays)、高粱(Sorghumbiocolor)、水稻(Oryzasativa)、大豆(Glycinemax)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)的同源蛋白序列，并對以上蛋白序列在Pfam (http://pfam.xfam.org/) 中進行保守結構域分析。運用ClustalW (http:// www.ebi.ac.uk/clustalw/) 以默認參數(shù)進行多序列比對分析，使用DNAMAN輸出序列比對結果，在MEGA 5.0軟件中輸出基于neighbor-joining法構建的系統(tǒng)進化樹，bootstrap值設置為1 000次重復。

1.5 TaSWEET6基因的染色體定位

運用Primer Premier 5.0軟件，結合小麥基因組序列，根據(jù) TaSWEET6基因的基因組序列設計特異性引物SWEET-DNA-F/SWEET-DNA-R(表1)。以中國春及其缺四體DNA為模板進行PCR擴增。擴增體系20 μL， 包括2×TransTaq-T PCR SuperMix(Transgen，北京) 10 μL、模板DNA(100 ng· L-1)1 μL、上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL、ddH2O 7 μL。擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠分離，使用凝膠成像系統(tǒng)(UVP，美國)采集圖像。

1.6 TaSWEET6基因的表達分析

根據(jù) TaSWEET6基因cDNA序列設計表達分析所用引物SWEET-qPCR-F/SWEET-qPCR-R(表1)。以小麥Actin基因為內(nèi)參，以1.2中得到的cDNA為模板進行實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析。PCR反應體系為20 μL，包括2× SYBR Premix ExTaq10 μL、上下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL、cDNA模板100 ng，其余用ddH2O補足。PCR擴增于Illumina Eco real-time PCR儀上進行，反應程序為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，進行40個循環(huán)后增加熔解曲線環(huán)節(jié)。每次反應作3次生物學重復，并采用2-△△Ct法計算基因相對表達量，同時計算其標準差。

表1 本研究所用引物序列

Table 1 Sequence of primers used in this study

引物名稱Primername引物序列(5'-3')Primersequence(5'-3')SWEET-cDNA-FCAACCCACAACCAACCCTTCSWEET-cDNA-RTGCAAGCCAATGCTTATCTGTCCSWEET-DNA-FCCTCTACGTCACGGTCAGTACATACSWEET-DNA-RACGAGGGCAGACGACAGTGGTTCSWEET-qPCR-FCGGTCACCGTGGACAGATAAGCSWEET-qPCR-RGAGGGCAGACGACAGTGGTTCActin-FTACTCCCTCACAACAACCGActin-RAGAACCTCCACTGAGAACAA

2 結果與分析

2.1 TaSWEET6基因的克隆及其編碼蛋白的跨膜結構分析

以揚麥12小孢子時期雄蕊的cDNA為模板，利用引物SWEET-cDNA-F/SWEET-cDNA-R進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，得到大小為800 bp左右的單一條帶(圖1)。將目的片段純化、克隆并測序后，得到長度為806 bp的序列，開放閱讀框為732 bp，編碼243個氨基酸。經(jīng)Blast比較分析，該基因與 OsSWEET6B(LOC_Os01g42090.1)相似，暫命名為 TaSWEET6。利用Pfam(http://pfam.xfam.org/)和TMHMM分析 TaSWEET6基因所編碼的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)其含有2個Mtn3_slv跨膜結構域和1個起連接作用的跨膜-螺旋，進一步說明 TaSWEET6基因?qū)儆赟WEET基因家族。

M：DL2000; 1：擴增產(chǎn)物 Amplified products.

圖1 TaSWEET6基因的RT-PCR擴增產(chǎn)物

Fig.1 Amplified products of TaSWEET6 gene by RT-PCR

2.2 TaSWEET6同源蛋白序列的比對及進化分析

將TaSWEET6蛋白序列提交至Phytozome11(https://phytozome.jgi.doe.gov/)和Gramene(http://www.gramene.org/)網(wǎng)站進行Blastp比對，結果發(fā)現(xiàn)，其與來源于粗山羊草(EMT16545.1)、烏拉爾圖小麥(EMS47629.1)、短柄草(Bradi2g42990.1)、玉米(GRMZM2G 157675)、高粱(Sobic.003G213000.1)、水稻(LOC_Os01g42090.1)、擬南芥(AT5G62850.1)、大麥(MLOC_17346.2)、大豆(GLYMA08G02890.1)的SWEET蛋白序列相似性分別為86%、85%、82%、82%、81%、75%、53%、86%、56%。所有SWEET蛋白均包含2個Mtn3_slv結構域，且位置完全相同(圖2A)。利用neighbor joining法構建進化樹，結果(圖2B)表明，單子葉和雙子葉植物SWEET蛋白分別聚為兩類，小麥與大麥親緣關系最近。

2.3 TaSWEET6基因的染色體定位

根據(jù)六倍體普通小麥數(shù)據(jù)庫序列信息(Traes_7DL_015FBEE0C.1)，小麥 TaSWEET6基因位于7D染色體上。為了進一步確認其染色體定位信息，利用7D基因組特異性引物SWEET-DNA-F/SWEET-DNA-R對中國春和中國春缺四體材料N7AT7B、N7BT7A、N7DT7B進行擴增，結果(圖3)顯示，這對引物在中國春與中國春缺四體材料N7AT7B、N7BT7A中均擴增出預期大小的條帶，只有N7DT7B中沒有擴增出對應的條帶，說明小麥 TaSWEET6基因位于7D染色體上。

2.4 TaSWEET6基因的組織特異性表達

利用qRT-PCR對 TaSWEET6基因在揚麥12減數(shù)分裂前期不同組織器官及不同發(fā)育階段的花藥中的表達模式進行分析，結果(圖4)發(fā)現(xiàn)，該基因在根、莖、葉、種子、小花(除去雄蕊)、減數(shù)分裂前雄蕊、減數(shù)分裂時期雄蕊和小孢子期雄蕊中均有表達，而各時期雄蕊中的相對表達量較高，其中，小孢子時期雄蕊表達量最高，大約是根中的35倍。表明該基因在小麥雄蕊中特異性表達。

2.5 逆境脅迫下 TaSWEET6基因的表達

為進一步了解 TaSWEET6基因?qū)δ婢趁{迫的響應，利用qRT-PCR技術，分析在低溫、高鹽、干旱和脫落酸(ABA)處理下小麥幼苗中該基因的表達情況。結果表明，該基因?qū)Φ蜏孛{迫敏感，表達量持續(xù)上升，在10h時表達量上升至處理前的44倍，達到最高值，隨后表達水平下降，但仍然高于處理前水平(圖5A)；在NaCl脅迫處理下，該基因表達量在2 h時達到最高值，大約為處理前表達量的40倍，隨后表達水平下降，但表達量仍然維持在一個穩(wěn)定的水平，約為處理前表達量的20倍(圖5B)；干旱處理2 h后，該基因表達量急劇上升至最高，隨后表達水平下降(圖5C)，表明 TaSWEET6表達受干旱脅迫誘導；在ABA脅迫處理下，該基因表達量穩(wěn)步上升，在10 h時表達量達到最高值，隨后略有下降(圖5D)。以上結果表明， TaSWEET6參與這些非生物脅迫應答反應過程。

圖2 TaSWEET6與其他9種植物SWEET蛋白的序列比對(A)和系統(tǒng)進化分析(B)

M：DL2000

1:根；2:莖；3:葉；4:小穗(除去雄蕊)；5:種子；6:減數(shù)分裂前雄蕊；7:減數(shù)分裂時期雄蕊；8:小孢子期雄蕊。

1:Root; 2:Stem; 3:Leaf; 4:Spikelet (remove the anther); 5:Seed; 6:Anther at premeiosis stage; 7:Anther at meiosis stage; 8:Anther at young microspore stage.

圖4 TaSWEET6基因在不同組織器官中的相對表達量

Fig.4 Relative expression level of TaSWEET6 gene in different organs of wheat

2.6 TaSWEET6基因在光溫敏雄性不育系BS366中的表達

為進一步明確 TaSWEET6基因在小麥雄性不育中的調(diào)控機制，利用小麥雄性不育系BS366分析 TaSWEET6基因在可育環(huán)境下和不育環(huán)境下雄蕊中的表達特性。結果(圖6)表明，該基因在不育環(huán)境下二分體時期雄蕊中高度表達，約為可育環(huán)境下二分體時期雄蕊中表達量的26倍，說明 TaSWEET6基因在可育環(huán)境下和不育環(huán)境下雄蕊中差異表達。

圖5 在4 ℃低溫(A)、NaCl(B)、干旱(C)和ABA(D)脅迫下小麥幼苗中 TaSWEET6基因的相對表達量

F1～F4分別表示在可育環(huán)境下的減數(shù)分裂前、二分體期、四分體期和小孢子期；S1～S4分別表示在不育環(huán)境的減數(shù)分裂前、二分體期、四分體期和小孢子期。

F1～F4 indicated premeiosis stage,dyad stage,tetrad stage and young microspore stage under fertile condition,respectively; S1～S4 indicated premeiosis stage, dyad stage,tetrad stage and young microspore stage under sterile condition,respectively.

圖6 光溫敏雄性不育系BS366在可育環(huán)境與不育環(huán)境下的雄蕊中 TaSWEET6基因的相對表達量

Fig.6 Relative expression level of TaSWEET6 in the anthers of the wheat TGMS line BS366 under fertile and sterile conditions

3 討 論

SWEET蛋白在植物中廣泛存在，且在擬南芥、水稻、短柄草、高粱、玉米等植物中均有報道[7]，但小麥作為世界最大的作物，尚未見SWEET相關基因研究報道。本研究首次通過RT-PCR技術從小麥中克隆獲得 TaSWEET6的全長cDNA序列。序列分析表明， TaSWEET6基因所編碼的氨基酸序列與水稻、擬南芥等植物SWEET氨基酸序列同源性高，且含有2個Mtn3_slv保守結構域，屬于SWEET基因家族。

在眾多植物中，MtN3/saliva/SWEET類基因?qū)Ψ巧锩{迫均有響應?？扇苄蕴鞘侵参锊豢苫蛉钡慕M分，SWEET作為糖轉(zhuǎn)運載體參與糖的運輸，被運輸?shù)街参锊煌慕M織和細胞器中[16]。在脅迫環(huán)境下，植物體內(nèi)糖含量會明顯增加，以此來降低體內(nèi)滲透勢，有利于植物在逆境下維持正常生長，提高了植物抗逆能力[17]。擬南芥 AtSWEET17基因的突變體植株在低溫或低氮脅迫下，對比野生型植株葉片中的果糖含量增加。 AtSWEET17在葉和根系的液泡中均有表達，過表達 AtSWEET17在低溫脅迫下葉片中的果糖減少[18-21]。 AtSWEET16和 AtSWEET17是同源基因，在低溫或低氮脅迫下均能引起 AtSWEET16表達下調(diào)， AtSWEET16超量表達植株表現(xiàn)出更高的發(fā)芽率和耐寒性增強， AtSWEET16可以促進蔗糖、葡萄糖和果糖的轉(zhuǎn)運，其超量表達植株在糖水平上有顯著的改變[22]。在低溫、高鹽、干旱和ABA等逆境脅迫條件下， TaSWEET6被強烈誘導上調(diào)表達，推測可能參與ABA相關抗逆信號傳導網(wǎng)絡途徑，但該基因是否參與調(diào)節(jié)果糖、葡萄糖等的運輸還需要進一步研究。

大量研究表明，植物SWEET基因表達具有花組織特異性且參與植物生殖發(fā)育過程。如擬南芥中 RPG1/AtSWEET8和 RPG2/AtSWEET13在花藥中特異表達，并且參與花粉壁外層形成[13-23]；擬南芥 RPG1/SWEET8和 RPG2/SWEET13均在雄蕊中特異性表達，參與到花粉原外壁沉積和花粉壁外層形成過程，并且 rpg1rpg2雙突變體表現(xiàn)為不育。如水稻SWEET基因 OsSWEET2a、OsSWEET1a、OsSWEET4、OsSWEET15、OsSWEET3a、OsSWEET5 和 OsSWEET11在不同發(fā)育階段的小花中高度表達[16,24-25]。水稻 OsSWEET11在花藥中高度表達，其RNAi轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)為未成熟花粉發(fā)育停滯并且逐漸退化，導致雄性不育[3,10]。本研究發(fā)現(xiàn)，小麥 TaSWEET6在不同發(fā)育階段的雄蕊(減數(shù)分裂前期、減數(shù)分裂期、小孢子期)中表達量均高于其他組織，且在小孢子時期雄蕊中表達量最高，推測該基因可能參與小麥雄蕊發(fā)育過程。

雜種優(yōu)勢利用被認為是今后小麥生產(chǎn)水平大幅度提高的主要途徑之一。小麥光溫敏雄性不育系是由光、溫環(huán)境因素誘導育性基因及其網(wǎng)絡表達的控制，花粉敗育是雄性不育基因表達的最終結果。小麥光溫敏雄性不育系BS366在長日照、高溫表現(xiàn)為雄性可育，短日照、低溫表現(xiàn)為雄性不育的特性。唐忠輝等[15]報道小麥光溫敏雄性不育系BS366在低溫處理下(即不育環(huán)境)，其雄蕊細胞質(zhì)分裂異常，不能形成正常的二分體；在正常生長條件下(即可育環(huán)境)雄蕊細胞質(zhì)分裂正常，形成二分體。本研究發(fā)現(xiàn)， TaSWEET6在光溫敏雄性不育系BS366不育環(huán)境下的雄蕊中，在二分體時期表達達到最高，比可育環(huán)境下相應時期的表達提高。因此，小麥 TaSWEET6基因可能在雄蕊發(fā)育過程中起到重要作用。

[1]HAMADA M,WADA S,KOBAYASHI K,etal.Ci-Rga,a gene encoding an MtN3/saliva family transmembrane protein,is essential for tissue differentiation during embryogenesis of the ascidianCionaintestinalis[J].Differentiation,2005,73(7):364.

[2]CHEN L Q,HOU B H,LALONDE S,etal.Sugar transporters for intercellular exchange and nutrition of pathogens [J].Nature,2010,468(7323):527.

[3]YUAN M,CHU Z,LI X,etal.The bacterial pathogenXanthomonasoryzaeovercomes rice defenses by regulating host copper redistribution [J].PlantCell,2010,22(9):3164.

[4]Gamas P,DE CARVALHO NIEBEL F,LESCURE N,etal.Use of a subtractive hybridization approach to identify newMedicagotruncatulagenes induced during root nodule development [J].MolecularPlant-MicrobeInteractions,1996,9(4):233.

[5]BAKER R F,LEACH K A,BRAUN D M.SWEET as sugar:new sucrose effluxers in plants [J].MolecularPlant,2012,5(4):766.

[6]FENG L,FROMMER W B.Structure and function of SemiSWEET and SWEET sugar transporters [J].TrendsinBiochemicalSciences,2015,40(8):480.

[7]YUAN M,WANG S.Rice MtN3/Saliva/SWEET family genes and their homologs in cellular organisms [J].MolecularPlant,2013,6(3):665.

[8]HAYDON M J,BELL L J,WEBB A A R.Interactions between plant circadian clocks and solute transport [J].JournalofExperimentalBotany,2011,62(7):2333.

[9]CHEN L Q,QU X Q,HOU B H,etal.Sucrose efflux mediated by SWEET proteins as a key step for phloem transport [J].Science,2012,335(6065):207.

[10]CHU Z,YUAN M,YAO J,etal.Promoter mutations of an essential gene for pollen development result in disease resistance in rice [J].Genes&Development,2006,20(10):1250.

[11]ANTONY G,ZHOU J,HUANG S,etal.Rice xa13 recessive resistance to bacterial blight is defeated by induction of the disease susceptibility gene Os-11N3 [J].PlantCell,2010,22(11):3864.

[12]CHEN L Q,LIN I W,QU X Q,etal.A cascade of sequentially expressed sucrose transporters in the seed coat and endosperm provides nutrition for theArabidopsisembryo [J].PlantCell,2015,114:134585.

[13]GUAN Y F,HUANG X Y,ZHU J,etal.RUPTUREDPOLLENGRAIN1,a member of the MtN3/saliva gene family,is crucial for exine pattern formation and cell integrity of microspores inArabidopsis[J].PlantPhysiology,2008,147(2):852.

[14]SEO P J,PARK J M,KANG S K,etal.AnArabidopsissenescence-associated protein SAG29 regulates cell viability under high salinity [J].Planta,2011,233(1):189.

[15]TANG Z,ZHANG L,YANG D,etal.Cold stress contributes to aberrant cytokinesis during male meiosis I in a wheat thermosensitive genic male sterile line [J].PlantCellandEnvironment,2011,34(3):389.

[16]ALLEN A M,THOROGOOD C J,HEGARTY M J,etal.Pollen-pistil interactions and self-incompatibility in the Asteraceae:new insights from studies ofSeneciosqualidus(Oxford ragwort) [J].AnnalsofBotany,2011,108(4):687.

[17] 劉 暢,姜 晶,韓曉雪,等.植物中SWEET基因家族研究進展 [J].植物生理學報,2014,50(9):1367.

LIU C,JIANG J,HAN X X,etal.Research advances inSWEETgene family in plants [J].PlantPhysiologyJournal,2014,50(9):1367.

[18]HE F,KANG J,ZHOU X,etal.Variation at the transcriptional level among Chinese natural populations ofArabidopsisthalianain response to cold stress [J].ChineseScienceBulletin,2008,53(19):2989.

[19]YAMADA K,OSAKABE Y,MIZOI J,etal.Functional analysis of anArabidopsisthalianaabiotic stress-inducible facilitated diffusion transporter for monosaccharides [J].JournalofBiologicalChemistry,2010,285(2):1138.

[20]CHARDON F,BEDU M,CALENGE F,etal.Leaf fructose content is controlled by the vacuolar transporter SWEET17 inArabidopsis[J].CurrentBiology,2013,23(8):697.

[21]GUO W J,NAGY R,CHEN H Y,etal.SWEET17,a facilitative transporter,mediates fructose transport across the tonoplast ofArabidopsisroots and leaves [J].PlantPhysiology,2014,164(2):777.

[22]KLEMENS P A W,PATZKE K,DEITMER J,etal.Overexpression of the vacuolar sugar carrierAtSWEET16 modifies germination,growth,and stress tolerance inArabidopsis[J].PlantPhysiology,2013,163(3):1338.

[23]SUN M X,HUANG X Y,YANG J,etal.ArabidopsisRPG1 is important for primexine deposition and functions redundantly with RPG2 for plant fertility at the late reproductive stage [J].PlantReproduction,2013,26(2):83.

[24]ALLEN A M,LEXER C,HISCOCK S J.Comparative analysis of pistil transcriptomes reveals conserved and novel genes expressed in dry,wet,and semidry stigmas [J].PlantPhysiology,2010,154(3):1347.

[25]SALTS Y,SOBOLEV I,CHMELNITSKY I,etal.Genomic structure and expression ofLestd1,a seven-transmembrane-domain proteon-encoding gene specically expressed in tomato pollen [J].IsraelJournalofPlantSciences,2005,53(2):79.

Cloning and Expression Analysis of a Sugar Transporter Protein Gene TaSWEET6 in Wheat

XU Lei1,WANG Weiwei2,SU Shichao2,MA Jinxiu2,SUN Hui2,FANG Zhaofeng2,GAO Shiqing2,TANG Yimiao2,ZHAO Changping2，JIANG Tao2

(1.College of Life Sciences,Capital Normal University,Beijing 100048,China; 2.Hybrid Technology Engineering Research Center of Wheat,Beijing Academy of Agriculture and Forestry,Beijing 100097,China)

SWEET family is a sugar transporter protein family in plants,which are involved in multiple physiological processes,including reproductive development,senescence,and abiotic stress responses. Our objectives are to analyse the expression of TaSWEET6 under various abiotic stresses and how TaSWEET6 influences the development of anther. To understand the function of TaSWEET6,qRT-PCR assays were used to quantify the expression of TaSWEET6 within different wheat organs. The expression of TaSWEET6 in anther of a photoperiod-thermos-sensitive genic male sterility line BS366 at different developmental stages under various abiotic stresses was quantified by qRT-PCR. We cloned a full-length cDNA sequence of TaSWEET6 (GenBank Accession No. KU936097) from wheat by RT-PCR,which has 806 bp in length containing a 732 bp ORF (open reading frame),encoding 243 amino acid residues. The phylogenetic analysis of TaSWEET6 indicated high similarity with the SWEET protein in barley. The chromosome localization of TaSWEET6 was confirmed by nullisomic-tetrasomic (NT) analysis,which was detected to be located on chromosome 7D in wheat.TaSWEET6 protein contains two Mnt3_slv transmembrane domains that are connected by an inversion linker helix using TMHMM tool. Expression of TaSWEET6 have been observed in different tissues of wheat organs such as root,stem,leaf,spikelet (except anther),and anther at different stages,while TaSWEET6 preferentially expressed in the young anther at microspore stage. The qRT-PCR assays detected that TaSWEET6 was up-regulated by low temperature at 4 ℃,drought,NaCl and ABA treatments. The high expression of TaSWEET6 was detected in anther of BS366 at dyad stage under sterile condition (low temperature and short day). These results provide basic information for the functional analysis of TaSWEET6 in response to various stresses,and also suggest that TaSWEET6 play a critical role in the process of wheat anther development.

Wheat; Sugar transporter; Abiotic stress; Male sterility

時間：2016-11-04

2016-04-25

2016-10-18

國家轉(zhuǎn)基因重大專項(2016ZX08002-003)；北京市農(nóng)林科學院科技創(chuàng)新能力建設專項(KJCX20140202)；國家自然科學基金項目(31371699)；北京自然科學基金項目(5131001)；北京市科技計劃項目(Z141100002314018)

E-mail:xulei_hello@163.com(徐 磊)；wangweiwei2398@126.com(王偉偉，與第一作者同等貢獻)

趙昌平(E-mail:cp_zhao@vip.sohu.com)；唐益苗(E-mail:tangyimiao@126.com)

S512.1；S330

A

1009-1041(2016)11-1411-08

網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20161104.0924.012.html