劉進兵，鐘志堅，張宇，袁夢潔

(邵陽學(xué)院 生物與化學(xué)工程系，湖南 邵陽，422000)

噻二唑硫醚席夫堿酪氨酸酶抑制活性研究

劉進兵，鐘志堅，張宇，袁夢潔

(邵陽學(xué)院 生物與化學(xué)工程系，湖南 邵陽，422000)

以二硫化碳和氨基硫脲為起始原料，縮合得到2-氨基-5-巰基-1,3,4噻二唑，再經(jīng)硫醚化、縮合得到噻二唑硫醚席夫堿，目標(biāo)化合物經(jīng)核磁和質(zhì)譜表征。對部分化合物進行了酪氨酸酶抑制活性考察，所測試的化合物都表現(xiàn)出一定的酪氨酸酶抑制活性，其中化合物8活性最好，強于陽性對照曲酸。優(yōu)選化合物8進行了抑制機理探討，結(jié)果表明其為不可逆抑制劑，同時對化合物8進行了分子對接研究。

噻二唑硫醚；席夫堿；酪氨酸酶抑制活性

酪氨酸酶是一種多酚氧化酶，兩個銅離子活性中心與三個組氨酸殘相連形成四面體結(jié)構(gòu)[1,2]。酪氨酸酶是黑色素生物合成的關(guān)鍵酶，在動植黑色素合成過程中起著重要作用，與人的毛發(fā)、皮膚顏色密切相關(guān)，因此廣泛存在于微生物和動植物[3,4]。酪氨酸酶在人體內(nèi)過量表達會導(dǎo)致色素沉著性疾病，如雀斑、黃褐斑、老年斑等皮膚病，嚴(yán)重的會導(dǎo)致皮膚癌[5]。酪氨酸酶也和果蔬褐變有密切關(guān)系，酪氨酸酶抑制劑也可以用作食品保鮮劑[6]。同時酪氨酸酶與昆蟲的蛻皮及傷口愈合，為開發(fā)生物殺蟲劑指明方向[7]。由于酪氨酸酶抑制劑在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、食品工業(yè)、化妝品領(lǐng)域有著重要的用途，開發(fā)新型高效低毒的酪氨酸酶抑制劑并探討其作用機制成為了科學(xué)界的研究熱點。

雜環(huán)是一類具有生物活性多樣性的物質(zhì)，噻唑一類重要的含硫、氮雜環(huán)化合物，噻二唑是頭孢唑啉、頭孢西酮等頭孢類藥物的重要中間體。研究表明1,3,4-噻二唑類化合物是設(shè)計生物活性分子的重要先導(dǎo)化合物，具有抗腫瘤、抗菌、抗氧化、抗抑郁、抗菌消炎等生物活性[8,9]。本文以氨基硫脲和二硫化碳為起始原料合成2-氨基-5-巰基-1,3,4噻二唑，再經(jīng)硫醚化、縮合得到噻二唑硫醚席夫堿，并考察了其酪氨酸酶抑制活性、抑制機理和抑制動力學(xué)特性，合成路線如下(圖1)：

1.R1= Bz； 2.R1= 烯丙基；

3.R1= Bz，R2= 4-羥基-3-甲氧基苯基；

4.R1= Bz，R2=5-溴-2-羥基苯基；

5.R1= Bz，R2= 2-甲氧基苯基；

6.5.R1= Bz，R2=5-氯-2-羥基苯基；

7.R1= 烯丙基，R2= 4-羥基-3-甲氧基苯基；

8.R1= 烯丙基，R2=2,4-二羥基苯基；

9.R1= 烯丙基，R2=5-氯-2-羥基苯基；

10.R1= 烯丙基，R2=5-溴-2-羥基苯基；

11.R1= 烯丙基，R2=3-氯苯基；

12.R1= 烯丙基，R2= 3-羥基苯基；

13.R1= 烯丙基，R2= 2-羥基苯基；

14.R1= 烯丙基，R2=4-羥基苯基.

圖1 目標(biāo)化合物的合成

Fig.1 Synthetic route of the target compounds

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

醛、酮購置于上海達瑞試劑有限公司，酪氨酸酶、L-多巴，曲酸從Sigma-Aldrich公司購得，其他試劑及溶劑為市售分析純，未進一步純化。熔點儀為SGW?X-4(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，未校正；核磁共振儀為Bruker400or300型(德國Bruker公司)；質(zhì)譜儀為LCMS-2010A型(日本島津)；紅外為VECTOR22型(德國Bruker公司)；元素分析儀為Vario EL(德國Elementar公司)紫外分光光度計為UV-2100(北京萊伯泰科儀器有限公司)。

1.2 化合物合成

2-氨基-5-硫醚1,3,4噻二唑的合成按文獻合成方法進行合成[8]。

Compound1.收率98.71%.淡黃色固體,熔點:156.5—159.1oC;1H NMR(DMSO-d6,500MHz)δ7.36-7.25(m,7H,NH2,ph-H),4.30(s,2H,CH2),;13C NMR(DMSO-d6,125MHz)δ170.3,149.9,137.4,129.5,129.0,127.9,38.9;MS(ESI):m/z(100%)224(M+)。

Compound 2.收率52.48%.淡黃色固體，熔點:112.3-112.8oC;1H NMR(DMSO-d6,500MHz)δ7.32(s,2H,NH2),5.91-5.84(m,1H,CH),5.16(dd,J=44.7,13.5Hz,2H),3.70(d,J=7.0Hz,2H,CH2);13C NMR(DMSO-d6,125MHz)δ170.4,149.8,133.9,119.1,37.8;MS(ESI):m/z(100%)174(M+)。

2-氨基-5-硫醚1,3,4噻二唑席夫堿的合成。

取5mmol 2-氨基-5-硫醚1,3,4噻二唑加入到25mL圓底燒瓶中，加入10mL無水乙醇，攪拌下加入不同取代基的芳香醛6mmol和催化量的TBAB，回流反應(yīng)，用TLC跟蹤反應(yīng)進程，反應(yīng)完畢后冷卻至室溫，有固體析出，抽濾，濾餅用無水乙醇洗三次，用無水乙醇重結(jié)晶。如冷卻至室溫后無固體析出，采用柱層析分離得產(chǎn)品。

Compound 3.收率49.89%，淡黃色固體,熔點:178.1—180.1oC;1H NMR(DMSO-d6,500MHz)δ10.33(s,1H,OH),8.72(s,1H,CH),7.58(s,1H,Ph-H),7.50-7.46(m,2H,Ph-H),7.37-7.28(m,4H,Ph-H),6.96(d,1H,J=8.2Hz,Ph-H),4.58(s,2H,CH2),3.86(s,3H,CH3);13C NMR(DMSO-d6,125MHz)δ174.8,169.0,162.3,153.2,148.7,136.9,129.6,129.1,128.2,126.5,116.1,111.5,55.9,37.5;MS(ESI):m/z(100%)358(M+)。

Compound 4.收率84.94%.淡黃色固體,熔點:146.0—148.7oC;1H NMR (CDCl3,500MHz) δ 11.80 (s,1H,OH),8.93 (s,1H,CH),7.56-7.52 (m,2H,Ph-H),7.43 (d,J=7.2Hz,1H,Ph-H),7.36-7.30 (m,3H,Ph-H),6.95 (d,J=8.8Hz,1H,Ph-H),4.56 (s,2H,CH2);13C NMR (CDCl3,125 MHz) δ 174.8,169.0,162.3,153.2,148.7,136.9,129.6,129.1,128.2,126.5,116.1,111.5,55.9,37.5;MS (ESI):m/z(100%)405 (M+)。

Compound 5.收率43.06%，淡黃色固體,熔點:95.9—97.3oC;1H NMR (DMSO-d6,500 MHz) δ 9.08 (s,1H,CH),8.59 (d,J=6.9Hz,1H,Ph-H),8.05 (d,J=7.6Hz,1H,Ph-H),7.65 (t,J=7.3Hz,1H,Ph-H),7.47 (d,J=7.4Hz,1H,Ph-H),7.42-7.25 (m,4H,Ph-H),7.10 (d,J=8.1Hz,1H,Ph-H),4.59 (s,2H,CH2),3.92(s,3H,CH3);13C NMR (DMSO-d6,125 MHz) δ 174.9,167.7,163.7,160.9,151.1,137.4,136.9,136.2,129.1,128.0,122.6,121.5,112.9,56.4,37.8;MS (ESI):m/z(100%) 342 (M+)。

Compound 6.收率49.92%.淡黃色固體,熔點:148.2—150.7oC;1H NMR (CDCl3,500 MHz) δ 11.79 (s,1H,OH),8.95 (s,1H,CH),7.44-7.30 (m,7H,Ph-H),7.00 (d,J=8.6Hz,1H,Ph-H),4.57 (s,2H,CH2);13C NMR (CDCl3,125 MHz) δ 170.4,166.7,164.8,160.2,135.6,132.6,132.3,129.3,128.9,128.1,124.6,119.4,118.9,38.4;MS (ESI):m/z(100%) 362 (M+)。

Compound 7.收率26.64%.淡黃色固體,熔點:65.5-67.4oC;1H NMR (CDCl3,500 MHz) δ 8.65 (s,1H,CH),7.66 (s,1H,Ph-H),7.34 (d,J=8.1Hz,1H,Ph-H),7.02 (d,J=8.1Hz,1H,Ph-H),6.01-5.97 (m,1H,CH),5.29 (dd,J=69.6,13.5Hz,2H),3.97 (s,3H,CH3),3.96 (d,J=7.0Hz,2H,CH2);13C NMR (CDCl3,125 MHz) δ 174.5,166.6,162.7,151.4,147.4,132.0,128.0,127.3,119.6,114.6,109.3,56.2,36.7;MS (ESI):m/z(100%) 308 (M+)。

Compound 8.收率47.83%.淡黃色固體,熔點:152.7-154.9oC;1H NMR (DMSO-d6,500 MHz) δ 11.53 (s,1H,OH),10.73 (s,1H,OH),8.93 (s,1H,CH),7.69 (d,J=8.7Hz,1H,Ph-H),6.46 (d,J=8.7Hz,1H,Ph-H),6.38 (s,1H,Ph-H),6.00-5.95 (m,1H,CH),5.28 (dd,J=76.8,13.5Hz,2H),3.96 (d,J=6.8Hz,2H,CH2);13C NMR (DMSO-d6,125 MHz) δ 174.1,167.1,165.5,163.4,162.0,134.0,133.1,120.0,112.6,109.8,102.8,36.7;MS (ESI):m/z(100%) 294 (M+)。

Compound 9.收率31.42%.淡黃色固體,熔點:125.9-127.5oC;1H NMR (CDCl3,500 MHz) δ 11.80 (s,1H,OH),8.97 (s,1H,CH),7.43 (s,1H,Ph-H),7.41 (d,J=8.7Hz,1H,Ph-H),7.01 (d,J=8.7Hz,1H,Ph-H),6.01-5.97 (m,1H,CH),5.31 (dd,J=68.7,13.5Hz,2H),3.97 (d,J=6.9Hz,2H,CH2);13C NMR (CDCl3,125 MHz) δ 170.7,166.7,164.8,160.3,135.5,132.6,131.8,124.6,119.9,119.4,118.9,36.6;MS (ESI):m/z(100%) 312 (M+)。

Compound 10.收率28.41%.淡黃色固體,熔點:104.7-105.9oC;1H NMR (CDCl3,500 MHz) δ 11.82 (s,1H,OH),8.96 (s,1H,CH),7.58 (s,1H,Ph-H),7.55 (d,J=8.8Hz,1H,Ph-H),6.96 (d,J=8.8Hz,1H,Ph-H),6.01-5.97 (m,1H,CH),5.31 (dd,J=68.7,13.5Hz,2H),3.97 (d,J=6.9Hz,2H,CH2);13C NMR (CDCl3,125 MHz) δ 170.7,166.6,164.8,160.7,138.3,135.7,131.8,119.9,119.6,111.4,36.6;MS (ESI):m/z(100%) 356 (M+)。

Compound 11.收率 6.72%.淡黃色固體,熔點:79.3-81.2oC;1H NMR (CDCl3,500 MHz) δ 8.84 (s,1H,CH),7.97 (s,1H,Ph-H),7.81 (d,J=7.6Hz,1H,Ph-H),7.54 (d,J=6.4Hz,1H,Ph-H),7.46-7.43 (m,1H,Ph-H),6.01-5.97 (m,1H,CH),5.37 (dd,J=68.7,13.5Hz,2H),3.98 (d,J=6.9Hz,2H,CH2);13C NMR (CDCl3,125 MHz) δ 168.7,165.0,153.8,139.7,134.6,131.9,130.3,129.5,126.7,119.8,119.4,36.6;MS (ESI):m/z(100%) 296 (M+)。

Compound 12.收率58.31%.淡黃色固體,熔點:156.2-158.1oC;1H NMR (DMSO-d6,500 MHz) δ 9.92 (s,1H,OH),8.84 (s,1H,CH),7.47 (s,1H,Ph-H),7.44 (d,J=7.6Hz,1H,Ph-H),7.39-7.33 (m,1H,Ph-H),7.07 (d,J=6.4Hz,1H,Ph-H),5.99-5.96 (m,1H,CH),5.37 (dd,J=68.7,13.5Hz,2H),3.99 (d,J=6.9Hz,2H,CH2);13C NMR (DMSO-d6,125 MHz) δ 193.6,174.3,170.0,163.5,158.5,136.2,130.7,122.3,121.5,120.0,115.6,36.6;MS (ESI):m/z(100%) 278 (M+)。

Compound 13.收率42.89%.淡黃色固體,熔點:102.2-103.4oC;1H NMR ((CDCl3,500 MHz) δ 11.82 (s,1H,OH),9.03 (s,1H,CH),7.50-7.45 (m,2H,Ph-H),7.04 (d,J=8.3Hz,1H,Ph-H),6.99 (d,J=7.4Hz,1H,Ph-H),6.03-5.97 (m,1H,CH),5.30 (dd,J=68.8,13.4Hz,2H),3.96 (d,J=6.9Hz,2H,CH2);13C NMR (CDCl3,125 MHz) δ 171.4,168.1,164.1,161.8,135.8,134.1,131.9,120.0,119.8,118.2,117.8,36.7;MS (ESI):m/z(100%) 278 (M+)。

Compound 14.收率 4.51%.淡黃色固體,熔點:96.9-100.5oC；1H NMR (DMSO-d6,500 MHz) δ 10.63 (s,1H,OH),8.76 (s,1H,CH),7.89 (d,J=8.5Hz,2H,Ph-H),6.94 (d,J=8.5Hz,2H,Ph-H),5.98-5.95 (m,1H,CH),5.28 (dd,J=77.1,13.5Hz,2H),3.96 (d,J=6.8Hz,2H,CH2);13C NMR (DMSO-d6,125 MHz) δ 175.0,169.0,163.4,162.3,133.2,133.1,126.2,119.9,116.6,36.6;MS (ESI):m/z(100%) 278 (M+)。

1.3 酪氨酸酶抑制活性測試

參照本課題組已經(jīng)建立起的篩選方法[10]進行。

1.4 抑制機理研究

參照本課題組已經(jīng)建立起的篩選方法[10]進行。

1.5 分子對接

參照文獻[11]進行。

2 結(jié)果與討論

2.1 目標(biāo)化合物的合成

以二硫化碳和氨基硫脲為起始原料，無水乙醇做溶劑，在無水碳酸鈉存在的情況下發(fā)生縮合的2-氨基-5-巰基1,3,4-噻二唑，通過改變反應(yīng)溫度得到反應(yīng)體系在回流狀態(tài)下收率最好，可以達到78%。將所得的2-氨基-5-巰基1,3,4-噻二唑分別于烯丙基溴及氯芐反應(yīng)得到相應(yīng)的硫醚化合物，其中和氯芐反應(yīng)產(chǎn)物收率幾乎是定量的，達到98.71%，然而和烯丙基溴反應(yīng)的收率只有52.48%，說明氯芐反應(yīng)活性更高。將所有相應(yīng)的硫醚與不同的醛反應(yīng)生成席夫堿，收率并不是很高，烯丙基取代的化合物收率偏低。

2.2 目標(biāo)化合物的波譜分析

從核磁共振氫譜來看，芐基硫醚在δ 4.3處的單峰是芐基碳原子上的兩個氫，烯丙基硫醚在δ 5.16處的dd峰為烯丙位碳原子上的兩個氫原子，δ 5.91處多重峰為雙鍵中間碳原子上的氫，在δ 3.70處雙峰為雙末端碳原子上的氫。形成席夫堿后原來醛基碳上氫原子位置發(fā)生變化，約在δ 8.50-9.00處。在核磁共振碳譜中，形成席夫堿后處于席夫堿上的碳原子約在δ 170左右。

2.3 化合物的酪氨酸酶抑制活性

為考察所合成的化合物對酪氨酸酶的抑制活性，采用本課題組已經(jīng)建立起的篩選方法，以曲酸為陽性對照，對所合成的噻二唑硫醚席夫堿進行了酪氨酸酶抑制活性，其結(jié)果見表1。

表1 目標(biāo)化合物酪氨酸酶抑制活性

aLogP來源于 ChemBioDraw Ultra 12.0

b取三次實驗平均值

c未測.

測試結(jié)果表明，目標(biāo)化合物具有一定的酪氨酸酶抑制活性，其中化合物8抑制活性最強，其IC50為1.03μM，強于陽性對照曲酸，其結(jié)構(gòu)特征是含有兩個羥基。芐基硫醚類化合物酪氨酸酶抑制活性最強的是化合物5。對比芐基硫醚和烯丙基硫醚同種醛席夫堿的抑制活性，化合物3的抑制活性強于化合物7，而化合物10的抑制活性強于化合物4，這就說明該類化合物的酪氨酸酶抑制活性不僅與形成硫醚的基團有關(guān)，還與形成席夫堿的芳香醛上取代基的種類有關(guān)。從化合物12，13的活性數(shù)據(jù)可知，羥基在苯環(huán)上的位置可能對抑制活性有影響。

為了探討這類化合物的抑制機理，優(yōu)選化合物8進行抑制機理探討，如圖2所示，以酶的濃度為橫坐標(biāo)，V為縱坐標(biāo)作圖得到一組平行線，因此化合物8對酪氨酸酶的抑制作用是不可逆的。

圖2 化合物8對酪氨酸酶的抑制機理化合物8對應(yīng)直線1-4的濃度為0,0.5,1,1.25μMFig.2 The effect of concentrations of tyrosinase on its activity for the catalysis of L-DOPA at different concentration of compound 8.The concentrations of compound 8 for curves 1-4 are 0,0.5,1 and 1.25μmol/L,respectively.

A.分子對接三維圖

B.分子對接二維圖圖3 分子對接圖Fig.3 The docking simulation between tyrosinase and inhibitor compound 8.

化合物8活性最好，選擇這個化合物與酪氨酸酶進行分子對接，對接結(jié)果如圖3所示。通過對接結(jié)果發(fā)現(xiàn)，化合物8與酪氨酸酶受體結(jié)合的總能量是-80.38 kcal/mol，這就說明化合物8能夠與酪氨酸酶形成穩(wěn)定的絡(luò)合物。化合物8與酪氨酸酶可能發(fā)生相互作用的活性位點如圖3所示。苯環(huán)上的兩個酚羥基可以分別和GLU359，ILE13形成比較牢固氫鍵，其鍵長分別為2.85?和2.98?，噻二唑環(huán)上硫原子可以與LYS345形成氫鍵，其鍵長為2.56?。烯丙基的碳碳雙鍵能夠與TRP350形成π-π疊加。

3 結(jié)論

將1,3,4-噻二唑和席夫堿拼接到一個分子中，考察其酪氨酸酶抑制活性，初步討論了構(gòu)效關(guān)系，化合物8的IC50值為1.03μM，強于陽性對照曲酸，為該類化合物中活性最強的，并對該化合物進行了抑制機理探討，結(jié)果表明其為不可逆抑制劑。同時對化合物8進行了分子對接研究，發(fā)現(xiàn)羥基在抑制酪氨酸酶的過程中起著重要作用。

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Biological evaluation of 1,3,4-thiadiazole sulfide derivatives bearing Schiff base moieties as tyrosinase inhibitors

LIU Jinbing,ZHONG Zhijian,ZHANG Yu,YUAN Mengjie

(Department of Biology and Chemical Engineering,Shaoyang University, Shaoyang 422000,China)

1,3,4-thiadiazole sulfide derivatives bearing Schiff base moieties were designed,synthesized,and their tyrosinase inhibitory activities were evaluated.Some compounds displayed potent tyrosinase inhibitory activities,especially,compound 8 showed more potent inhibitory effect than the other compounds with the IC50value of 1.03μM.The structure-activity relationships (SARs) were preliminarily discussed.Docking study also was carried out in the paper.The inhibition mechanisms study demonstrated that the inhibitory effects of compound 8 on the tyrosinase were irreversible.

thiadiazole sulfide derivatives;schiff base;tyrosinase inhibitory activities.

1672-7010(2016)04-0093-07

2016-09-16

湖南省教育廳重點項目(15A172)；邵陽學(xué)院大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實驗計劃項目

劉進兵(1974-)，男，湖南邵陽人，副教授，博士，從事藥物合成研究，E-mail:syuliujb@163.com

O0621.3

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