王俊虹 吳 繪 魏茂提

(武警后勤學院，天津300309)

BALB/c小鼠免疫重組蓖麻毒素B鏈蛋白的免疫機制研究①

王俊虹 吳 繪 魏茂提②

(武警后勤學院，天津300309)

目的：探討重組蓖麻毒素B鏈蛋白(rRTB)免疫雌性BALB/c小鼠的免疫機制。方法：雌性BALB/c小鼠分為rRTB組和PBS組，間隔14 d皮下多點注射，共4次。間接ELISA分析小鼠血清抗體效價和抗體分型，采用流式細胞儀檢測脾細胞因子IFN-γ和IL-4。結(jié)果：血清IgG效價達到1∶107以上，且攻毒后產(chǎn)生二次免疫應答，與PBS對照組差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；IgG1達到1∶105以上，與PBS對照組差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；IgG2a未發(fā)生明顯變化。細胞因子檢測結(jié)果表明IFN-γ的表達量與PBS組差異無統(tǒng)計學意義，而IL-4的表達量顯著提高(P<0.05)。結(jié)論：rRTB蛋白免疫可刺激小鼠產(chǎn)生高水平的特異性抗體和細胞因子，誘導以IgG1為主的抗體和Th2優(yōu)勢應答，為候選疫苗的研制奠定基礎。

蓖麻毒素；B鏈蛋白；免疫應答；生物恐怖

蓖麻毒素(Ricin toxin,RT)是一種廣泛存在的植物性毒素，屬于Ⅱ型核糖體失活蛋白(RIP)，由A、B兩條鏈構成，A鏈(RTA)具有使核糖體失活的能力，是毒性鏈，B鏈(RTB)是一種半乳糖結(jié)合型蛋白，是結(jié)合鏈[1]。RT具有很強的毒性作用，幾乎可以和所有的真核細胞結(jié)合，因此是標準的毒素戰(zhàn)劑和生物恐怖劑[2]。隨著多個恐怖組織研制RT的消息頻頻出現(xiàn)[3]，發(fā)展安全、有效的防治方法就顯得尤為重要，已成為世界各國研究的熱點。

目前關于RT的疫苗研究主要集中在類毒素[4]和A鏈蛋白[5-8]，而關于B鏈蛋白的疫苗研制較少。本室制備的重組蛋白rRTB(E.coliM15/pQE80L-RTB誘導表達)經(jīng)小鼠攻毒保護實驗和體外中和實驗，結(jié)果說明rRTB可以完全抵抗5×LD50劑量的天然RT攻毒[9]。本研究旨在利用rRTB皮下多點免疫雌性BALB/c小鼠，探討其免疫機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 重組蛋白和天然毒素 重組蛋白rRTB(E.coliM15/pQE80L-RTB表達、純化獲得)、天然RT均由我室制備。

1.1.2 主要試劑和儀器 山羊抗鼠IgG、IgG1、IgG2a(HRP標記)、ELISA用顯色液均購自北京天根生物公司；其他化學試劑為國產(chǎn)分析純。液相內(nèi)毒素清除劑(北京天恩澤基因科技有限公司)；Coulter Epics XL型流式細胞儀(美國BD公司)。

1.1.3 實驗動物 6～8周齡雌性BALB/c小鼠，體重18～20 g(軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心)，動物質(zhì)量合格證號：SCXK-(軍)2014-005。

1.2 方法

1.2.1 免疫接種 小鼠分為4組，每組5只。25 μg/只rRTB溶液皮下多點注射(PBS稀釋)，共4免，間隔周期14 d。

1.2.2 血清抗體和抗體亞型檢測 ①每次免疫一周、攻毒后一周尾靜脈取血，室溫留取血清，-20℃保存。②包被酶標板：RTB濃度為5 μg/ml，包被液稀釋，100 μl/孔。③間接ELISA法檢測：二抗抗體分別為HRP標記羊抗鼠IgG、IgG1、IgG2a(1∶5 000稀釋)。④酶標儀讀取A450的吸光度。

1.2.3 IFN-γ、IL-4檢測 ①去除內(nèi)毒素：按說明書操作。②脾淋巴細胞培養(yǎng)：在四免后一周，隨機選取免疫小鼠5只，頸椎脫臼處死后無菌取脾臟，剪碎、研磨擠壓成單細胞懸液后，離心、棄掉上清，溶紅細胞30 s后PBS洗2次，吹打均勻，以臺盼蘭拒染法進行活細胞計數(shù)，要求活細胞數(shù)在90%以上；加1 ml 1640細胞培養(yǎng)基(10%FBS)重懸，調(diào)整細胞至1×107個/ml。③流式細胞術檢測細胞因子：24孔板中加入細胞(2～4)×107個/孔；CD28 1 μg/ml；CD49d 1 μg/ml；GolgiStop 1 μg/ml；rRTB蛋白濃度和作用時間采用2×2析因設計實驗方法進行優(yōu)化；1640細胞培養(yǎng)基(10%FBS)至1.5 ml終體積。經(jīng)作用后，1 500 r/min離心5 min后棄上清收集細胞，加入工作濃度的BD固定/透膜液250 μl重懸，4℃避光20 min；1 500 r/min離心5 min后棄上清，150 μl PBS重懸細胞，分為3管分別加入不同組合的單克隆抗體(CD3e-FITC、CD4-PECY5、CD8-APC、IFNγ-PE、IL-4-PE、Rat IgG1-PE)，避光4℃反應30 min。各管加入1 ml PBS重懸，1 500 r/min離心5 min后棄上清，重復2次；加入4%多聚甲醛150 μl，避光4℃保存，1周內(nèi)用流式細胞儀分析。

1.3 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS17.0和Graphpad軟件進行統(tǒng)計?？贵w效價經(jīng)幾何均數(shù)數(shù)據(jù)變換后用方差分析。計量資料采用成組t檢驗、秩和檢驗、析因設計的方差分析；計數(shù)資料采用一般χ2和Fisher精確檢驗進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 IgG、IgG1、IgG2a分析 經(jīng)四次免疫后，小鼠血清IgG效價達到1∶107，攻毒后產(chǎn)生了二次免疫應答；IgG1的效價可達到1∶106，而IgG2a的血清效價最高只可達1∶102。PBS組血清IgG、IgG1、IgG2a則無明顯變化(圖1)。

2.2 細胞因子檢測

2.2.1 作用條件的優(yōu)化 rRTB免疫小鼠脾細胞因子IFN-γ和IL-4的檢測經(jīng)析因設計方差分析確定蛋白的最佳刺激劑量和作用時間。表1結(jié)果表明：蛋白刺激劑量(10、20 μg/ml)和作用時間(12、24 h)兩個主效應對細胞因子IFN-γ和同型對照IgG1無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；對IL-4的表達有顯著性差異(P<0.05)，即在蛋白刺激劑量為10 μg/ml、作用時間為12 h時表達量最高。

2.2.2 IFN-γ、IL-4的檢測 圖2顯示rRTB劑量為10 μg/ml、作用時間為12 h的刺激條件下，細胞因子IL-4的表達量與同型對照IgG1組比較有顯著性差異(P<0.05)，而IFN-γ表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖1 不同時期血清中抗體效價水平Fig.1 Antibody titers of sera after each immunization and challenge trial

GroupsIFN?γ12h24hIL?412h24hIgG112h24h10μg/ml311±097244±0582114±4011891±274243±071251±06320μg/ml291±066324±0921166±355708±235301±081198±055

圖2 rRTB免疫小鼠脾臟細胞因子水平Fig.2 Levels of cytokine of rRTB in spleen after immunity

3 討論

作為重要的潛在性生物恐怖劑，RT的發(fā)展具有廣泛的民用價值和軍事意義。由于RT具有來源廣泛、制備容易、毒性高的特點，易被恐怖分子利用，因此發(fā)展有效的防治手段，研發(fā)有效的預防性疫苗，已成為國際上研究的趨勢，美軍傳染病醫(yī)學研究所(USAMRIID)一直致力于毒素預防措施的研究[10]。

RT相關的生防疫苗研制主要集中在類毒素和基于A鏈亞單位。其中，經(jīng)甲醛化處理后的全毒素能有效抵抗致死劑量的毒素攻毒[3]。RiVax是基于A鏈亞單位的突變體，由美國Texas大學Vitetta科研小組研發(fā)，在不使用佐劑的情況下，可以抵抗經(jīng)腹腔攝入的10×LD50的天然毒素的攻擊，由于可凍干保存而適用于軍隊使用。在我國，2008年韓艷輝等[7]將RTA突變體和相思子毒素A鏈(ATA)突變體嵌合表達，獲得二價候選疫苗，該疫苗能抵抗致死劑量的天然AT和RT混合物攻毒。然而，上述兩種疫苗均由于安全問題而未能在人體使用。

本室采用E.coliM15/pQE80L-RTB表達、純化獲得的重組蛋白rRTB，經(jīng)小鼠攻毒保護實驗和體外中和實驗，結(jié)果說明rRTB皮下多點注射雌性BALB/c小鼠，25 μg/只，免疫4次(間隔14 d免疫)，可以完全抵抗5×LD50劑量的天然RT攻毒，本實驗則進一步探討其免疫機制。小鼠血清IgG和抗體亞型分析結(jié)果顯示：四免后IgG的效價達107以上，IgG1為106，且攻毒后產(chǎn)生二次免疫應答，均與PBS組差異有顯著性(P<0.05)；而IgG2a則無明顯

變化。應用流式細胞技術進行脾細胞中Th1類細胞因子(IFN-γ)、Th2類細胞因子(IL-4)的檢測，結(jié)果表明IFN-γ表達量無顯著性差異(P>0.05)，而IL-4的表達量有顯著性提高(P<0.05)。以上結(jié)果提示：重組蛋白rRTB免疫小鼠后能誘導以IgG1為主的抗體和Th2優(yōu)勢應答，但不能誘導IgG2a和Th1優(yōu)勢應答，這為進一步研究蓖麻毒素B鏈疫苗奠定了基礎。

[1] Joachim S,Alexander W,Matthias FM.Ribosome-inactivating and related proteins [J].Toxins (Basel),2015,7(5):1556-1615.

[2] Vance DJ,Greene CJ,Rong Y,etal.Comparative adjuvant effects of type II heat-labile enterotoxins in combination with two different candidate ricin toxin vaccine antigens [J].Clin Vaccine Immunol,2015,22(12):1285-1293.

[3] Dong N,Luo L,Wu J,etal.Monoclonal antibody,mAb 4C13,an effective detoxicant antibody against ricin poisoning [J].Vaccine,2015,33(32):3836-3842.

[4] Han YH,Gao S,Xin WW,etal.A recombinant mutant abrin A chain expressed in Escherichia coli can be used as an effective vaccine candidate [J].Hum Vaccin Immunother,2011,7(8):838-844.

[5] Wang JH,Gao S,Zhang T,etal.A recombinant chimeric protein containing B chains of ricin and abrin is an effective vaccine candidate [J].Hum Vaccin Immunother,2014,10(4):1-7.

[6] Zhang T,Kang L,Gao S,etal.Truncated abrin A chain expressed in Escherichia coli:A promising vaccine candidate[J].Hum Vaccin Immunother,2014,10(9):2648-2655.

[7] 韓艷輝,張 弢,康 琳,等.重組蓖麻、相思子毒素A鏈嵌合突變體的制備與分析 [J].生物技術通訊,2011,22(4):453-457.

[8] Marconescu PS,Smallshaw JE,Pop LM,etal.Intradermal administration of Rivax protects mice from mucosal and systemic ricin intoxication [J].Vaccine,2010,28(32):5315-5322.

[9] Hansel TT,Kropshofer H,Singer T,etal.The safety and side effects of monoclonal antibodies [J].Nat Rev Drug Discov,2010,9(4):325-338.

[10] Abboud N,Chow SK,Saylor C,etal.A requirement for FcR in antibody-mediated bacterial toxin neutralization [J].J Exp Med,2010,207(11):2395-2405.

[收稿2016-10-27]

(編輯 倪 鵬)

Study on immune mechanism of a recombinant ricin B chain protein against ricin intoxication in BALB/c mice

WANG Jun-Hong,WU Hui,WEI Mao-Ti.

Logistics University of PAP，Tianjin 300309，China

Objective:To explore the immunity provided to BALB/c mice by immunization with the recombinant ricin B chain protein (rRTB).Methods:Female BALB/c mice were randomly selected into rRTB-vaccinated group and PBS group.Mice were subcutaneously (s.c.) injected four times with 14 days immunization time interval.Changes of antibodies (IgG,IgG1and IgG2a) in serum were detected by ELISA.Meanwhile,the expression of IL-4 and IFN-γ were detected by flow cytometry.Results:The mean IgG titers reached 106after the fourth immunization and a strong secondary response was induced in vaccinated mice when challenged with toxin.There was significant difference between rRTB-vaccinated group and PBS group (P<0.05).The same result was shown in IgG1.However,no changed was detected in IgG2a.Meanwhile,there was significant difference for IL-4 between two groups (P<0.05),while no significant difference for IFN-γ was observed.Conclusion:rRTB can produce higher levels of antigen-specific antibodies (IgG and IgG1),and cytokine (IL-4) of splenocytes,which means the recombinant protein can induce the Th2-type immune response and trigger a good immune response.rRTB may be a potentially valuable vaccine candidate against human exposure to AT.

Ricin toxin;B chain protein;Immune response;Bioterrorism

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.12.006

①本文受武警后勤學院開放基金項目(WHKF201503)和軍事預防醫(yī)學“2110”三期工程建設項目資助。

王俊虹(1977年-)，女，博士，講師，主要從事生物戰(zhàn)劑的偵檢與防治方面研究，E-mail：wangjunhong11007@163.com。

R392

A

1000-484X(2016)12-1758-03

②天津市職業(yè)與環(huán)境危害防制重點實驗室，天津300309。