張文泉，羅國濤，鄧潔

(凱里學(xué)院，貴州 凱里 556011)

樟子松組培苗菌根化技術(shù)研究*

張文泉，羅國濤，鄧潔

(凱里學(xué)院，貴州 凱里 556011)

樟子松是我國西北干旱地區(qū)的主要造林樹種。為了獲得樟子松菌根化組培幼苗，以樟子松成熟胚為外植體，通過愈傷途徑獲得樟子松組培幼苗，接種厚環(huán)乳牛肝菌與點(diǎn)柄乳牛肝菌兩種不同的菌種，進(jìn)行菌根合成試驗(yàn)。結(jié)果表明，接種厚環(huán)乳牛肝菌后樟子松組培苗各項(xiàng)生長指標(biāo)均顯著提高。試驗(yàn)結(jié)果將為樟子松組培苗菌根化技術(shù)提供依據(jù)。

樟子松；厚環(huán)乳牛肝菌;點(diǎn)柄乳牛肝菌;組培苗；菌根化

樟子松(Pinussylvestrisvar.mongolicaLitv.)是松科(Pinaceae)松屬(Pinus)高大常綠喬木樹種，是歐洲赤松的一個(gè)地理變種，其材質(zhì)良好，防風(fēng)固沙作用顯著，且抗寒、抗旱、耐貧瘠、適應(yīng)性強(qiáng)且較速生，是中國西北地區(qū)造林及防風(fēng)固沙的主要樹種。但樟子松結(jié)實(shí)間隔期長，籽粒空癟率高，有性繁殖難以滿足生產(chǎn)上對苗木的需要[1～2]，組織培養(yǎng)能為樟子松的快繁提供一條有效的途徑。但通過組培獲得再生植株的過程是在無菌條件下進(jìn)行的，所以組培苗不存在與菌根真菌接觸的機(jī)會，導(dǎo)致苗木生長狀況較差，抵抗力較弱，成活率較低。因此，盡早對組培苗進(jìn)行高效菌根真菌的人工接種，實(shí)現(xiàn)其菌根化，是培育壯苗的重要途徑之一[3]。

厚環(huán)乳牛肝菌(SuillusgrevilleiSing.)與點(diǎn)柄乳牛肝菌(SuillusgranulatusO.Kurttee)二者均屬于擔(dān)子菌亞門(Basidiomycotina)牛肝菌科(Boletaceae)粘蓋牛肝菌屬(Suillus)，是自然界最為常見的外生菌根真菌，其具有突出的抗旱性和抗貧瘠能力，在含水量低的土壤中及在各種惡劣生境條件下常成為優(yōu)勢種群[4～8]。有研究者對內(nèi)蒙古外生菌根資源與生態(tài)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，松科樹種與牛肝菌共生現(xiàn)象普遍，在極其惡劣的生態(tài)環(huán)境和不斷退化的生態(tài)系統(tǒng)中，樟子松能夠生長良好，可能與菌根共生有重要的關(guān)系[9]。目前國內(nèi)外對樟子松實(shí)生苗進(jìn)行菌根合成試驗(yàn)報(bào)道的很少，而對樟子松組培苗進(jìn)行合成試驗(yàn)的研究尚屬空白。

因此，本文對樟子松組培苗進(jìn)行厚環(huán)乳牛肝菌、點(diǎn)柄乳牛肝菌的菌根化研究，試圖探明樟子松與厚環(huán)乳牛肝菌、點(diǎn)柄乳牛肝菌之間的菌根關(guān)系，以期為樟子松的培育壯苗以及植被建設(shè)提供新的理論及試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試種子采自內(nèi)蒙古自治區(qū)呼倫貝爾市鄂溫克族自治旗紅花爾基樟子松國家森林公園。

供試菌根真菌 厚環(huán)乳牛肝菌(標(biāo)記為G-S.g)，點(diǎn)柄乳牛肝菌(標(biāo)記為S.g)，由樟子松菌根組織分離得到。菌根采集地為紅花爾基樟子松國家森林公園，已完成分子生物學(xué)鑒定。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 組培苗的獲取

以樟子松成熟胚為外植體，采用MS+1.5mg/L 2，4-D +0.5mg/L 6-BA培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織；以MS+0.2mg/L IAA+1.5mg/L 6-BA為愈傷組織分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)不定芽，在1/4MS+0.5 mg/L NAA+0.2 mg/L IBA培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，獲得完整植株，組培苗出瓶后煉苗6個(gè)月，栽培1個(gè)月后按株型大小均勻搭配，留待接種。

1.2.2 供試固體菌劑的培養(yǎng)

將MMN營養(yǎng)液與蛭石混勻(含水量60%)，裝袋，高溫高壓滅菌1h。冷卻后，接種厚環(huán)乳牛肝菌、點(diǎn)柄乳牛肝菌兩種菌種的平板，25±2℃條件下暗培養(yǎng)室培養(yǎng)，4周后備用。

1.2.3 樟子松組培幼苗接種及培養(yǎng)

采用120mm×100mm的育苗杯，首先將滅菌蛭石放在杯底，約20mm深即可，選擇生長均勻整齊一致的樟子松組培幼苗，截根(截去主根根尖)，稱取生長旺盛的厚環(huán)乳牛肝菌、點(diǎn)柄乳牛肝菌固體菌劑30g撒于其上。菌劑必須與苗根接觸，以利于菌根的形成。空白對照采用接種30g滅活接種劑，每1個(gè)菌種及空白對照均設(shè)3次重復(fù)，每1個(gè)重復(fù)接種50株，生長5個(gè)月，測定幼苗各項(xiàng)生長指標(biāo)，包括苗高、地徑、總生物量、地上生物量和地下生物量。

1.2.4 菌根形態(tài)觀察及菌根侵染率的測定

幼苗生長5個(gè)月后，每個(gè)處理隨機(jī)抽取10株幼苗。將苗木的根系流水沖洗干凈，剪取細(xì)根根段，在實(shí)體顯微鏡下觀察各處理根系外部特征，判斷是否有菌根形成并拍照。采用與Agerer相同的方法，體視顯微鏡在深色反光紙充當(dāng)背景條件下，采用白光照射，觀察記錄菌根的形態(tài)，拍照并記錄其形態(tài)特征。體視顯微鏡下，取保存于水中的新鮮菌根樣品，用鑷子和解剖針分層剝下菌套；取1片干凈載玻片，在中央滴半滴乳酸，將剝下的菌套碎片，置于玻片乳酸滴上，使有些菌套外層朝上，有些菌套朝下，小心蓋上蓋玻片，用指甲油封存；顯微鏡下觀察并用電腦照相系統(tǒng)進(jìn)行拍照并記錄特征。取固定于FAA中菌根樣品做常規(guī)石蠟切片，采用番紅固綠雙重染色法進(jìn)行染色，中性樹膠封片，干燥后置切片盒保存。制作石蠟切片進(jìn)行菌根內(nèi)部形態(tài)觀察并拍照。

利用網(wǎng)格法[9]統(tǒng)計(jì)菌根侵染率，每個(gè)處理隨機(jī)抽取10個(gè)營養(yǎng)杯。把營養(yǎng)杯中的幼苗連根拔出，注意不要弄斷幼苗的主根和側(cè)根，用蒸餾水沖洗幼苗根系，把附著在根毛上的沙土沖洗干凈，用緩沖溶液浸泡幼苗根系5～10min；然后用鑷子、剪刀將幼苗根系分成平均長度2cm的小段，放置于畫好了1cm×1cm網(wǎng)格的培養(yǎng)皿中，加緩沖溶液并使根段分散的平均分布于網(wǎng)格之內(nèi)，在高倍數(shù)電子顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)網(wǎng)格中感染的菌根和未被感染的植物根段，計(jì)算菌根侵染率。

菌根侵染率=菌根數(shù)/總根數(shù)×100%,菌根化率=(形成菌根株數(shù)/接種株數(shù))×100%。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理采用Excel、SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種兩種不同的牛肝菌對樟子松組培苗生長的影響

對接種外生菌根真菌5個(gè)月的樟子松組培苗進(jìn)行菌根侵染率及各項(xiàng)生理指標(biāo)測定得表1。兩種外生菌根真菌均與樟子松組培苗形成菌根，菌根化率>95%，菌根侵染率>70%，各項(xiàng)生長指標(biāo)與CK存在顯著性差異，苗高、地徑、干重較CK有顯著性提高。由此可知，接種外生菌根真菌，可以顯著促進(jìn)宿主植物的生長，尤其是地下生物量的增加。

表1 接種不同菌種的菌根劑對樟子松組培苗生長的影響

注：*表示與CK差異顯著(p<0.05)。

2.2 樟子松組培苗形成的菌根形態(tài)

對樟子松組培苗形成的菌根進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察得圖1、圖2。由圖1可知，點(diǎn)柄乳牛肝菌形成菌根的外部形態(tài)及解剖結(jié)構(gòu)特征如下：菌根為黃褐色，末端圓鈍，明顯膨大，多數(shù)單軸羽狀分支，分支1～2級，緊湊，簇生，呈珊瑚狀，少數(shù)不分枝；菌根因子長4～10.1mm，直徑1～2mm(圖1，A)；外層菌套為密絲組織，較薄，透明；菌套內(nèi)表面與外表面區(qū)別不明顯(圖1，B)；哈蒂氏網(wǎng)深入達(dá)到內(nèi)皮層細(xì)胞，由圓形細(xì)胞排列于皮層細(xì)胞間(圖1，C)。

圖1 點(diǎn)柄乳牛肝菌與樟子松組培苗形成的菌根外部形態(tài)和解剖結(jié)構(gòu)

圖2 厚環(huán)乳牛肝菌與樟子松組培苗形成的菌根外部形態(tài)和解剖結(jié)構(gòu)

由圖2可知，厚環(huán)乳牛肝菌形成菌根的外部形態(tài)及解剖結(jié)構(gòu)特征為，菌根為灰褐色，菌根稍扭曲，末端細(xì)尖，不膨大，多級二叉分支，呈珊瑚狀；菌根因子長2～6mm，直徑1～1.5mm(圖2，A，B)，外層菌套為擬薄壁組織(圖2，C)，菌絲形成鎖狀聯(lián)合(圖2，D)，哈蒂氏網(wǎng)深入達(dá)到內(nèi)皮層細(xì)胞(圖2，E，F(xiàn))。

3 結(jié)論與討論

接種外生菌根真菌可與樟子松組培苗形成菌根，菌根化率>95%，菌根侵染率>70%，各項(xiàng)生長指標(biāo)與CK存在顯著性差異，說明外生菌根真菌能促進(jìn)樟子松組培苗的生長，尤其是對地下生物量的影響更為顯著。究其原因：首先，菌根形成后，根系的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，根系的吸收面積擴(kuò)大，從而促進(jìn)了宿主植物的生長[11]；其次，菌根真菌在土壤中具有龐大的菌絲網(wǎng)，可降低土壤與植物之間的液流阻力，促進(jìn)根系對水分的吸收，最大限度地吸收土壤環(huán)境中的水分[12]，從而促進(jìn)組培苗的生長。

點(diǎn)柄乳牛肝菌形成的菌根為黃褐色，末端圓鈍明顯膨大，多數(shù)單軸羽狀分支1～2級呈珊瑚狀，菌根因子長4～10.1mm，直徑1～2mm，菌套內(nèi)外層區(qū)別不明顯，哈蒂氏網(wǎng)深入達(dá)到內(nèi)皮層細(xì)胞。厚環(huán)乳牛肝菌形成的菌根為灰褐色，菌根末端細(xì)尖，多級二叉分支呈珊瑚狀，菌根因子長2～6mm，直徑1～1.5mm，外層菌套為擬薄壁組織，菌絲形成鎖狀聯(lián)合，哈蒂氏網(wǎng)深入達(dá)到內(nèi)皮層細(xì)胞。

接種外生菌根真菌促進(jìn)樟子松組培苗的生長是通過分泌植物激素等物質(zhì)促生長還是改善苗木的根際環(huán)境或是直接供給苗木水分、營養(yǎng)物質(zhì)等而促進(jìn)苗木生長，有關(guān)作用機(jī)理還有待于今后進(jìn)一步更深入地研究。

針葉樹種再生植株體系建立最關(guān)鍵的一步即生根，生根率低是針葉樹種組培途徑的瓶頸所在，嚴(yán)重地制約著針葉樹的離體快繁[13～15]。由本試驗(yàn)可知接種外生菌根真菌可顯著促進(jìn)宿主植物地下部分生物量，而如果在組培生根過程中接入菌種，能否促進(jìn)不定根的生長，有待更進(jìn)一步的研究。

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Mycorrhizal Technology ofPinussylvestrisvar.mongolicaLitv. with Tissue Culture seedling

ZHANG Wen-quan，LUO Guo-tao,DENG Jie

(Kaili University,Kaili Guizhou 556011，P.R.China)

Pinussylvestrisvar.mongolicaLitv.is one of the main planting tree species in the arid area of northwest China.In order to get a number of plantlets,mycorrhizal synthesis test ofPinussylvestrisvar.mongolicaLitv .with tissue culture seedling were made.An efficiency regeneration system of the plant was established,and inoculateSuillusgrevilleiSing andSuillusgranulatusO.Kurttee,rooting and mycorrhizal research ofPinussylvestrisvar.mongolicaLitv.were studied in the experiment.The results showed that multiple growth indices ofPinussylvestrisvar.mongolicaLitv.plantlets were improved after inoculatedSuillusgrevilleiSing.The results provided the theoretical basis for the rapid propagation and mycorrhizal technology ofPinussylvestrisvar.mongolicaLitv.

Pinussylvestrisvar.mongolicaLitv.;SuillusgrevilleiSing ;SuillusgranulatusO.Kurttee;tissue culture seedling;mycorrhizal formation

10.16473/j.cnki.xblykx1972.2016.06.027

2015-12-18

凱里學(xué)院博士專項(xiàng)課題(凱院合BS201339號)，貴州省科技廳聯(lián)合基金項(xiàng)目(黔科合LH字[2014]7241號)，貴州省

張文泉(1984-)，男，副教授，主要從事林木生物技術(shù)方面的研究。E-mail:zwq840209@yeah.net

S 791.253

A

1672-8246(2016)06-0152-04

教育廳優(yōu)秀科技創(chuàng)新人才項(xiàng)目(黔教合KY字[2014]251號)。