董 俊，王少偉，宋 鴿，丁明星

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北武漢 430070)

小梁切除術(shù)聯(lián)合絲裂霉素C與羊膜植入對(duì)犬青光眼的治療試驗(yàn)

董 俊△，王少偉△，宋 鴿，丁明星*

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北武漢 430070)

探討絲裂霉素C和羊膜植入在犬青光眼小梁切除術(shù)中的臨床效果。成功建立12只(24只眼)犬的青光眼模型，隨機(jī)分為4組(每組6只眼，每只犬雙眼行不同手術(shù))，即單純小梁切除組(CT組)，行普通小梁切除術(shù)；絲裂霉素C組(MMC組)，行小梁切除術(shù)聯(lián)用絲裂霉素C；羊膜組(AM組)，行小梁切除術(shù)聯(lián)用羊膜植入；羊膜聯(lián)合絲裂霉素C組(AM+MMC組)，行小梁切除術(shù)聯(lián)用絲裂霉素C和羊膜植入。以術(shù)后眼壓、濾過(guò)泡、并發(fā)癥及纖維組織增生為指標(biāo)，評(píng)價(jià)青光眼的治療效果。結(jié)果顯示，小梁切除術(shù)聯(lián)用絲裂霉素C和羊膜植入在降低眼壓、提高濾過(guò)功能、減少并發(fā)癥和瘢痕形成等方面的效果優(yōu)于其他組。

犬青光眼；小梁切除；絲裂霉素C；羊膜

青光眼是犬重要眼病之一，不及時(shí)治療最終會(huì)導(dǎo)致失明。目前犬用于青光眼的手術(shù)方法有限，且治療效果不明確。小梁切除術(shù)是治療犬青光眼的常用手術(shù)方法之一，但該手術(shù)常因?yàn)V過(guò)區(qū)組織纖維增生、瘢痕形成而失去降壓功效。因此,如何術(shù)后抑制濾過(guò)區(qū)結(jié)締組織增生對(duì)提高小梁切除術(shù)成功率有著重要意義。

研究表明，抗代謝藥絲裂霉素C能強(qiáng)烈抑制成纖維細(xì)胞的增殖，與小梁切除術(shù)聯(lián)用，可大大提高其成功率。但絲裂霉素C毒副作用較強(qiáng)，術(shù)后可導(dǎo)致早期濾過(guò)過(guò)強(qiáng)、淺前房及低眼壓等并發(fā)癥[1]。羊膜是一種良好的體內(nèi)植入材料，具有抑制新生血管和瘢痕形成的功能，近年來(lái)已被廣泛用于青光眼的治療[2-3]。目前二者聯(lián)合用于犬青光眼的治療缺乏報(bào)道。本試驗(yàn)通過(guò)建立犬的青光眼模型，在小梁切除術(shù)基礎(chǔ)上聯(lián)合應(yīng)用絲列霉素C和羊膜植入，并對(duì)其在維持眼內(nèi)壓、防止濾過(guò)區(qū)域組織纖維增生等方面進(jìn)行了觀察，以評(píng)價(jià)二者聯(lián)合運(yùn)用在治療犬青光眼的臨床療效。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動(dòng)物 選擇12只健康雜交犬，無(wú)眼部疾病及外傷，無(wú)其他病癥。試驗(yàn)犬飼養(yǎng)和管理全部嚴(yán)格按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)和使用原則》的相關(guān)規(guī)章制度執(zhí)行。

1.1.2 主要試劑和儀器 卡波姆940，美國(guó)諾譽(yù)化工有限公司產(chǎn)品；絲裂霉素C，浙江海正藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品；LYL-II型裂隙燈顯微鏡，江西鳳凰光學(xué)有限公司產(chǎn)品；TONOVET眼壓計(jì)TV01型，芬蘭iCare公司產(chǎn)品。

1.1.3 復(fù)方卡波姆配制和保存 將卡波姆940 配制成含3 g/L卡波姆和0.25 g/L地塞米松的復(fù)方卡波姆溶液，高壓蒸汽滅菌。4℃冰箱中保存。

1.1.4 羊膜制備和保存 無(wú)菌操作下，取健康母犬(犬瘟熱病毒、犬細(xì)小病毒、犬腺病毒Ⅰ型/Ⅱ型檢測(cè)為陰性)剖腹產(chǎn)的新鮮胎盤(pán)，用含4 000 U/ mL 慶大霉素液沖洗后剝離羊膜，將其置于手術(shù)用纖維濾紙上，上皮面朝上剪成小塊，放入無(wú)菌純甘油中脫水，24 h后轉(zhuǎn)移到另一無(wú)菌純甘油中，4℃冰箱中保存。保存時(shí)間不超過(guò)4周。手術(shù)使用前需先用生理鹽水沖洗掉甘油，再置于含4 000 U/mL 慶大霉素的生理鹽水中復(fù)水30 min。

1.2 方法

1.2.1 麻醉與保定 所有犬只雙側(cè)眼睛進(jìn)行試驗(yàn)，術(shù)前均禁食8 h和禁水2 h。麻醉前30 min按0.05 mg/kg皮下注射阿托品，全身麻醉用0.1 mL/kg犬眠寶肌肉注射。試驗(yàn)犬只采用側(cè)臥保定，術(shù)眼朝上。眼瞼局部消毒，10 g/L的利多卡因液滴眼行表面麻醉。

1.2.2 青光眼模型建立 健康犬飼喂適應(yīng)1周后，采用復(fù)方卡波姆液建立高眼壓模型。將1 mL注射器穿刺針由角膜緣斜刺入前房，吸出約0.1 mL～0.2 mL的房水，不出針并更換已抽取的等量的復(fù)方卡波姆液針管，緩慢注入并保持針尖位于眼睛正中心位置。完成后生理鹽水沖洗術(shù)眼。造模后1周內(nèi)，若犬眼壓持續(xù)升高，并穩(wěn)定保持高于25 mmHg，則建模成功。

1.2.2 試驗(yàn)分組與手術(shù)方法 根據(jù)不同手術(shù)方法，將試驗(yàn)犬分為4組：?jiǎn)渭冃×呵谐M(CT組)，行普通小梁切除術(shù)；絲裂霉素C組(MMC組)，行小梁切除術(shù)聯(lián)用絲裂霉素C；羊膜組(AM組)，行小梁切除術(shù)聯(lián)用羊膜植入；羊膜聯(lián)合絲裂霉素C組(AM+MMC組)，行小梁切除術(shù)聯(lián)用絲裂霉素C和羊膜植入。

1.2.2.1 單純小梁切除組(CT組) 顯微鏡下，選取眼球12點(diǎn)鐘方向?yàn)槭中g(shù)部位，作以角膜緣為基底的結(jié)膜瓣，作邊長(zhǎng)約3 mm厚約1/3～1/2鞏膜的三角形淺層鞏膜瓣，切除1 mm×2 mm小梁組織，并做相應(yīng)的虹膜周邊切除。縫合時(shí)用11/0的縫線在鞏膜瓣的頂端縫合1針，再連續(xù)縫合球結(jié)膜及結(jié)膜下組織。

1.2.2.2 絲裂霉素C組(MMC組) 在CT組基礎(chǔ)上，完成鞏膜瓣制作后在其下放置浸有絲裂霉素C的棉片5 min。移除棉片并用大量生理鹽水沖洗。

1.2.2.3 羊膜組(AM組) 在CT組基礎(chǔ)上，切除小梁組織后，將復(fù)水羊膜以上皮面朝上平鋪于淺層鞏膜瓣下，于四個(gè)角用11/0縫線固定。

1.2.2.4 羊膜聯(lián)合絲裂霉素C組(AM+MMC組) 在CT組基礎(chǔ)上，聯(lián)合運(yùn)用絲裂霉素組和羊膜組試驗(yàn)方法。

術(shù)后，于結(jié)膜下注射地塞米松1 mg以及慶大霉素1萬(wàn)單位，術(shù)眼滴加復(fù)方硫酸新霉素滴眼液，每天3次，連用3 d。

1.2.3 試驗(yàn)觀察 注射復(fù)方卡波姆液一周，建模成功的試驗(yàn)犬進(jìn)行小梁切除手術(shù)。分別于注射復(fù)方卡波姆溶液前(0 d)、小梁手術(shù)前(7 d)以及術(shù)后的每周同一時(shí)間(14 d、21 d ……)進(jìn)行眼內(nèi)壓測(cè)量和裂隙燈顯微鏡觀察，記錄各組術(shù)后恢復(fù)及并發(fā)癥情況。63 d，對(duì)試驗(yàn)犬實(shí)施安樂(lè)死，常規(guī)手術(shù)摘除眼球。取結(jié)膜和角膜組織進(jìn)行固定制作石蠟切片并進(jìn)行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察濾過(guò)區(qū)域組織修復(fù)情況，判斷濾過(guò)通道是否開(kāi)放。

濾過(guò)泡評(píng)分參考Perkins T W等[4]的評(píng)分方法：0分，沒(méi)有形成可見(jiàn)的濾過(guò)泡；1分，結(jié)膜增厚，沒(méi)有小囊；2分，出現(xiàn)小囊；3分，濾過(guò)泡大小為2 h～3 h；4分，濾過(guò)泡大小超過(guò)3 h。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 試驗(yàn)數(shù)據(jù)眼壓、濾過(guò)泡評(píng)分、成纖維細(xì)胞數(shù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，其中眼壓以及成纖維細(xì)胞數(shù)采用單因素方差分析。組間眼壓比較采用LSD法進(jìn)行檢驗(yàn)，濾過(guò)泡評(píng)分采用非參數(shù)檢驗(yàn)Kruskal-Wallis方法進(jìn)行組間差異檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)眼眼壓

本試驗(yàn)測(cè)定了0 d～63 d的術(shù)眼眼壓(圖1)。在0 d，各組眼壓均在正常范圍(11.39 mmHg～23.64 mmHg)，無(wú)顯著性差異(P>0.05)。7 d試驗(yàn)犬眼壓顯著升高，提示造模成功。14 d，CT、AM、MMC和AM+MMC組眼壓顯著降低，分別下降57%、64%、75%和66%。與0 d比，CT組在49 d～63 d和AM組在42 d～63 d均顯著升高(P<0.05)；但MMC組在35 d～63 d和AM+MMC組在28 d～63 d無(wú)顯著差異(P>0.05)。

AM組眼壓14 d～35 d及MMC組在14 d～63 d時(shí)均顯著低于CT組(P<0.05)。AM+MMC組在28 d時(shí)眼壓與AM組差異不顯著(P=0.065)，但在35 d～63 d時(shí)顯著低于AM組(P<0.05)。AM+MMC組在d 14眼壓顯著高于MMC組(P<0.05)，而在21 d～56 d二組間無(wú)顯著差異(P<0.05)。

“a～c”不同字母表示相同時(shí)間不同組間均值間差異顯著(P<0.05);“*”同組與d 0時(shí)均值相比差異顯著(P<0.05)

"a-c"Values with different letters within the same time point differ significantly(P<0.05); "*"Values compared with d 0 differ significantly(P<0.05)

圖1 術(shù)眼眼壓(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，N=6)

Fig.1 IOP of the operated eyes(Mean± SD，N=6)

2.2 術(shù)眼濾過(guò)泡評(píng)分

術(shù)眼在14 d均形成可見(jiàn)濾過(guò)泡，隨后其評(píng)分逐漸降低(圖2)。與14 d比，CT、AM、MMC和AM+MMC組濾過(guò)泡評(píng)分分別在35 d～63 d、49 d～63 d、42 d～63 d和49 d～63 d顯著降低(P<0.05)。AM組濾過(guò)泡評(píng)分在35 d～42 d以及MMC組和AM+MMC組濾過(guò)泡評(píng)分在14 d～49 d顯著高于CT組(P<0.05)。AM+MMC組濾過(guò)泡評(píng)分在14 d～56 d顯著高于AM組(P<0.05)但與MMC組濾過(guò)泡評(píng)分差異不顯著(P>0.05)。

2.3 術(shù)眼并發(fā)癥

術(shù)后，CT組2眼出現(xiàn)角膜新生血管，AM組1眼出現(xiàn)前房渾濁，MMC組發(fā)生結(jié)膜傷口不愈合以及持續(xù)低眼壓各1眼，分別占該組術(shù)眼的33.3%、16.6%和33.3%。AM+MMC組未出現(xiàn)任何術(shù)后并發(fā)癥(表1)

2.4 術(shù)眼纖維組織增生

CT組以及AM組均形成較厚的纖維組織，濾過(guò)通道被纖維組織代替，失去了濾過(guò)作用(圖3A、圖3B)。MMC組的濾過(guò)通道保持開(kāi)放，但鞏膜瓣纖維退化(圖3C)。AM+MMC組纖維組織增生，但其濾過(guò)通道仍保持一定程度開(kāi)放(圖3D)。AM組與CT組的結(jié)膜下成纖維細(xì)胞數(shù)差異不顯著(P>0.05)，

MMC組和AM+MMC組結(jié)膜下成纖維細(xì)胞數(shù)顯著低于CT組和AM組(P<0.05)，但AM+MMC組與MMC組差異不顯著(P>0.05)(圖4)。

“a～c”不同字母表示相同時(shí)間不同組間均值間差異顯著(P<0.05);“*”同組與d 0時(shí)均值相比差異顯著(P<0.05)

"a-c"Values with different letters within the same time point differ significantly(P<0.05); "*"Values compared with d 0 differ significantly(P<0.05)

圖2 術(shù)眼濾過(guò)泡評(píng)分(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=6)

Fig.2 Filtering bleb scores of the operated eyes(Mean± SD，n=6)

表1 術(shù)眼并發(fā)癥情況(n=6)

Table 1 Complications of the eyes after surgery(n=6)

組別Groups新生血管Neovascularization結(jié)膜不愈合Non-healingconjunctiva持續(xù)低眼壓Persistentocularhypotony前房炎癥Anteriorchamberinflammation總計(jì)/%TotalCT組CTgroup20002(33.3)AM組AMgroup00011(16.6)MCC組MMCgroup01102(33.3)AM+MMC組AM+MMCgroup00000(0)

注：CT組：通小梁切除組； AM組：羊膜組；MMC組：絲裂霉素C組；AM+MMC組：羊膜聯(lián)合絲裂霉素C組。

Note:CT group:common trabeculectomy； AM group:trabeculectomy combined with amniotic membrane；MMC group:trabeculectomy combined with mitomycin C ；AM + MMC group:trabeculectomy combined with mitomycin C and amniotic membrane.

3 討論

臨床上犬的原發(fā)性青光眼來(lái)源有限，需通過(guò)建立青光眼模型來(lái)進(jìn)行研究。本試驗(yàn)參考復(fù)方卡波姆誘導(dǎo)兔的青光眼模型來(lái)誘導(dǎo)建立犬的青光眼模型[5-6]。復(fù)方卡波姆液中卡波姆可阻塞前房角房水的流出通道，地塞米松則減少了前房炎癥的發(fā)生。在本研究的預(yù)試驗(yàn)中，應(yīng)用復(fù)方卡波姆于犬眼的前房注射，1周內(nèi)眼壓持續(xù)升高并形成持續(xù)性高眼壓，維持時(shí)間超過(guò)兩個(gè)月。這與唐由之等[7]建立兔高眼壓模型試驗(yàn)結(jié)果相似。復(fù)方卡波姆誘導(dǎo)建立犬青光眼模型操作簡(jiǎn)便，可維持較長(zhǎng)時(shí)間的高眼壓，并發(fā)癥少。

絲裂霉素C是一種抗代謝藥物，可抑制DNA復(fù)制，對(duì)成纖維細(xì)胞有明顯抑制作用[8]。但其毒副作用較強(qiáng)，用于小梁切除術(shù)，易引發(fā)并發(fā)癥[9]。本試驗(yàn)通過(guò)比較術(shù)后眼壓、濾過(guò)泡、并發(fā)癥以及組織修復(fù)情況發(fā)現(xiàn)絲裂霉素C組及羊膜聯(lián)合絲裂霉素C組術(shù)后眼壓回升較慢，濾過(guò)區(qū)域組織纖維增生相對(duì)較少，手術(shù)后濾過(guò)泡維持時(shí)間也相對(duì)較長(zhǎng)。這可能與絲裂霉素C能抑制纖維細(xì)胞增殖有關(guān)。本結(jié)果與劉是等[10]在人青光眼臨床治療的研究結(jié)果相似。試驗(yàn)中，絲裂霉素C組術(shù)后出現(xiàn)低眼壓和結(jié)膜傷口處不愈合各1例，也驗(yàn)證了其可能與絲裂霉素C的細(xì)胞毒性有關(guān)，絲裂霉素C在抑制纖維組織增生的同時(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷引起了周圍組織的缺血壞死。

羊膜具有較好的韌性，是一種良好的體內(nèi)植入材料，且能分泌堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF) 、角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF) 、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、色素上皮細(xì)胞衍生因子(PEDF)等多種細(xì)胞因子，可促進(jìn)上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，減少纖維增生以及抑制新生血管形成[11]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小梁切除術(shù)聯(lián)用羊膜和絲裂霉素C的手術(shù)方法抑制了角膜新生血管的產(chǎn)生，減少了小梁切除術(shù)后術(shù)區(qū)組織的纖維增生，降低了手術(shù)濾過(guò)區(qū)域的愈合能力，防止鞏膜瓣與其他組織之間的愈合，保持濾過(guò)通道長(zhǎng)期暢通。這與Demir等[12]的臨床應(yīng)用結(jié)果類似。Chunkui Shao研究發(fā)現(xiàn)羊膜對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有特異性的抑制作用，羊膜釋放的PEDF可能會(huì)影響角膜新生血管的產(chǎn)生[13]。本試驗(yàn)中普通小梁切除組2眼出現(xiàn)角膜新生血管，可能與手術(shù)過(guò)程中對(duì)角膜緣區(qū)域的損傷相關(guān)，而羊膜組角膜未出現(xiàn)這樣的癥狀，可能與羊膜基底膜中PEDF的抑制作用有關(guān)。小梁切除術(shù)聯(lián)合羊膜與絲裂霉素C組，可因羊膜的阻隔作用防止絲裂霉素C引起的眼壓下降過(guò)快，抑制纖維組織增生，減輕絲裂霉素C的毒副作用，減少了并發(fā)癥的產(chǎn)生。 可見(jiàn)，小梁切除術(shù)聯(lián)用羊膜和絲裂霉素C對(duì)治療犬的青光眼效果優(yōu)于普通小梁切除術(shù)以及小梁切除術(shù)聯(lián)合羊膜或絲裂霉素C。

A.CT組，B.AM組，C.MMC組，D.AM+MMC組A.CT group，B.AM group，C.MMC group，D.AM+MMC group

“a～b”不同字母表示相同時(shí)間不同組間均值間差異顯著(P<0.05)

"a-b"Values with different letters within the same time point differ significantly(P<0.05)

圖4 眼術(shù)部結(jié)膜下成纖維細(xì)胞數(shù)

Fig.4 The number of fibroblasts in the operated field of the eyes

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Efficacy of Trabeculectomy with Mitomycin C and Amniotic Membrane Implantation for Canine Glaucoma

DONG Jun,WANG Shao-wei,SONG Ge,DING Ming-xing

(CollegeofVeterinaryMedicine,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan,Hubei,430070,China)

To probe into the efficacy of trabeculectomy with mitomycin C and amniotic membrane implantation for canine glaucoma,the models of glaucoma in 24 eyes of 12 dogs were successfully established.Dogs with artificially induced glaucoma were randomly divided into 4 treatment groups:common trabeculectomy (CT group),trabeculectomy combined with mitomycin C (MMC group),trabeculectomy combined with amniotic membrane (AM group),and trabeculectomy combined with mitomycin C and amniotic membrane (AM + MMC group),6 eyes per each treatment,and each dog in two eyes was asked to use different surgical methods.The postoperative intraocular pressure,filtering bleb,complication and fibrous tissue proliferation were taken as indexes to evaluate the treatment efficacy of glaucoma.The results showed that trabeculectomy with mitomycin C and amniotic membrane implantation was better than other groups in reducing the intraocular pressure,maintaining the function bleb long time,decreasing scarring and complication.

canine glaucoma; trabeculectomy; MMC; amniotic membrane

2016-05-10

武漢亞洲心臟病醫(yī)院合作基金項(xiàng)目(720107-3147142)

董 俊(1992-)，女，湖北武漢人，碩士研究生，主要從事臨床獸醫(yī)學(xué)研究。王少偉(1987-)，男，河北保定人，碩士研究生，主要從事臨床獸醫(yī)學(xué)研究?！魍蓉暙I(xiàn)作者，*通訊作者

S853.56

A

1007-5038(2016)12-0055-05