郝景鋒，李靜姬，張宇航，尹柏雙，付連軍，黃 巖，李心慰，李小兵，趙晨旭，劉國文*

(1．吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動物科技學(xué)院，吉林吉林 132101；2.吉林大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林長春 130062)

吉林省奶牛乳房炎病原菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

郝景鋒1，李靜姬1，張宇航1，尹柏雙1，付連軍1，黃 巖1，李心慰2，李小兵2，趙晨旭2，劉國文2*

(1．吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動物科技學(xué)院，吉林吉林 132101；2.吉林大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林長春 130062)

為了解吉林省各地區(qū)奶牛乳房炎發(fā)病情況，以便于科學(xué)合理防治該病，對長春市、吉林市、白城市以及延吉等多個大型奶牛場200份乳樣進(jìn)行了細(xì)菌分離與鑒定，并對其主要致病菌進(jìn)行敏感藥物篩選試驗(yàn)。結(jié)果顯示，導(dǎo)致吉林省奶牛乳房炎發(fā)生的主要病原菌為大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌以及停乳鏈球菌等，在檢出的267株病原菌中，金黃色葡萄球菌98株，占36.70%；無乳鏈球菌65株，占24.34%；停乳鏈球菌57株，占21.35%；大腸埃希菌43株，占16.10%；其他菌4株，占1.5%。4種病原茵對丁胺卡那霉素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、頭孢噻肟以及萬古霉素均高度敏感，但對青霉素、鏈霉素、紅霉素、慶大霉素等具有較強(qiáng)的耐藥性，因此丁胺卡那霉素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、頭孢噻肟以及萬古霉素可以作為吉林省奶牛乳房炎治療的首選藥物。

奶牛乳房炎；病原菌鑒定；藥敏試驗(yàn)

奶牛乳房炎是由微生物或物理、化學(xué)因素等刺激奶牛乳腺組織所發(fā)生的一種炎癥疾病，其特點(diǎn)是乳汁理化性質(zhì)以及乳腺組織病理學(xué)均發(fā)生變化，對機(jī)體影響較大[1]。該病是機(jī)體常見病，也是多發(fā)病，可以導(dǎo)致患病奶牛產(chǎn)奶數(shù)量下降、奶品質(zhì)下降、繁殖能力降低、死淘率增加、治療費(fèi)用增加、劣質(zhì)奶牛危害人體健康等一系列不良后果，嚴(yán)重制約奶牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展[2]。我國奶牛存欄量1 440萬頭，奶牛隱性乳房炎的陽性率也在46%～80%之間[3]。吉林省是我國奶牛養(yǎng)殖大省，也是全國重要的奶源基地，目前吉林省奶牛養(yǎng)殖業(yè)以大型奶牛場與私營個體奶牛養(yǎng)殖形式為主，養(yǎng)殖規(guī)模發(fā)展迅猛，但由于飼養(yǎng)管理水平相對較低，奶牛乳房炎陽性率較高，在一定程度上已經(jīng)成為制約我省奶牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的瓶頸[4]。本文對吉林省多個大型奶牛場200份乳樣進(jìn)行行細(xì)菌分離與鑒定，并對其主要致病菌進(jìn)行敏感藥物篩選試驗(yàn)，以期為科學(xué)、合理治療吉林省奶牛乳房炎提供一定技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)對象 吉林省多個奶牛養(yǎng)殖場的200份未經(jīng)任何藥物治療的乳樣，乳樣來自200頭患病奶牛。

1.1.2 器材與試劑 ①常規(guī)培養(yǎng)基。普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、綿羊血液(50 mL/L綿羊鮮血)瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、疊氮鈉血培養(yǎng)基、甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯，按常規(guī)方法配制。②細(xì)菌鑒定生化管。生化鑒定用微量發(fā)酵管購買于北京九州天瑞科技有限公司。③藥敏紙片。紅霉素、青霉素、鏈霉素、丁胺卡那霉素、環(huán)丙沙星、氟哌酸、恩諾沙星、慶大霉素、氨芐西林、克林霉素、四環(huán)素、頭孢噻肟、復(fù)方新諾明、阿莫西林以及萬古霉素等藥敏紙片購自于上海易佰聚經(jīng)貿(mào)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基制備 培養(yǎng)基的制備參照《獸醫(yī)微生物學(xué)》第五版[5]教材進(jìn)行。

1.2.2 乳樣采集 奶牛乳房炎患牛奶樣200份，采自吉林省多個大型奶牛場(乳樣來自200頭患病奶牛)。先用溫水清洗待采樣乳頭，750 mL/L酒精消毒，棄掉頭3把奶，采集奶汁10 mL裝入滅菌離心管[6]，并做好標(biāo)記，置-20℃冷凍保存待檢。

1.2.3 奶牛乳房炎判斷標(biāo)準(zhǔn) 牛乳體細(xì)胞數(shù)(SCC)推薦分級標(biāo)準(zhǔn)參照國際乳業(yè)聯(lián)合會(IDF)的規(guī)定，其中SCC<50萬個/mL為健康奶牛；100萬個/mL>SCC>50萬個/mL為隱性乳房炎；SCC>100萬個/mL為臨床型乳房炎[7]。

1.2.4 細(xì)菌分離培養(yǎng) 待測奶樣離心后棄中、上層液體，取底部沉淀物，無菌條件下分別接種于綿羊鮮血瓊脂平板培養(yǎng)基和普通瓊脂培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)24 h觀察菌落形態(tài)及大小，挑取不同形態(tài)菌落涂片，經(jīng)革蘭染色后鏡檢。革蘭陽性菌(G+)、球菌、葡萄串狀樣或短鏈樣排列的菌落接種于血液瓊脂平板和營養(yǎng)肉湯；G+、球菌、長鏈狀排列的菌落接種于改良愛德華瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行純培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)接5 mL/L綿羊血瓊脂平板；革蘭陰性菌(G-)、短桿菌者接種于營養(yǎng)肉湯進(jìn)行純培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)接伊紅美蘭瓊脂平板。置37℃恒溫箱培養(yǎng)24 h后，挑單個菌落分別接種于血清營養(yǎng)肉湯和營養(yǎng)肉湯供生化鑒定用。

1.2.5 細(xì)菌生化鑒定 取分離培養(yǎng)的細(xì)菌按照種類分別進(jìn)行生化鑒定，對疑似葡萄球菌的采用甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)、麥芽糖、葡萄糖、兔血漿蛋白凝固酶試驗(yàn)、七葉苷水解試驗(yàn)及觸酶試驗(yàn)等葡萄球菌屬細(xì)菌生化鑒定管鑒定；對于疑似鏈球菌的采用400 mL/L膽汁培養(yǎng)試驗(yàn)、馬尿酸鈉水解試驗(yàn)、七葉苷水解試驗(yàn)及觸酶試驗(yàn)等鏈球菌屬的細(xì)菌生化鑒定管鑒定；對于疑似腸桿菌科的采用葡萄糖、三糖鐵、乳糖、蔗糖、吲哚、明膠水解試驗(yàn)、甘露醇、甲基紅、硫化氫、VP及構(gòu)櫞酸鹽發(fā)酵試驗(yàn)等腸桿菌科生化鑒定管鑒定。

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法[8]，用微量移液器吸取稀釋好的各種菌液各200 μL滴于血清瓊脂平板上，用經(jīng)過滅菌處理的L型玻璃棒均勻涂布菌液，加蓋靜置15 min待干燥，用鑷子將藥敏紙片平放于血清瓊脂平板上輕輕壓緊后勿動，置37℃溫箱培養(yǎng)24 h～48 h后觀察試驗(yàn)結(jié)果，測定抑菌圈平均直徑，根據(jù)藥敏判定標(biāo)準(zhǔn)判斷病原菌對藥物的敏感性[9]。

2 結(jié)果

2.1 乳樣中細(xì)菌分離及鑒定結(jié)果

從200份乳樣中分離出267株細(xì)菌，采用病原菌的分離、純化以及生化鑒定方法判定感染病原菌的類型。細(xì)菌鑒定結(jié)果依據(jù)文獻(xiàn)[5]見表1，金黃色葡萄球菌98株，占36.70%；無乳鏈球菌65株，占24.34%；停乳鏈球菌57株，占21.35%；大腸埃希菌43株．占16.10%；其他菌4株，占1.50%。可見金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌以及大腸埃希菌為吉林省奶牛乳房炎致病優(yōu)勢菌。

2.2 敏感藥物篩選試驗(yàn)結(jié)果

選用紅霉素、青霉素以及鏈霉素等15種藥物對檢測出的5種病原菌進(jìn)行敏感藥物篩選試驗(yàn)(表2)，結(jié)果顯示，各種病原菌對青霉素、鏈霉素、紅霉素、慶大霉素以及氨芐西林均產(chǎn)生較強(qiáng)的耐藥性，而丁胺卡那霉素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、頭孢噻肟以及萬古霉素對各種病原菌均有較強(qiáng)的抑制作用和殺滅作用，因此治療吉林省奶牛乳房炎的優(yōu)選藥物為環(huán)丙沙星、恩諾沙星、頭孢噻肟以及萬古霉素等。

表1 乳樣中細(xì)菌檢測結(jié)果

Table 1 Bacterial detection results in milk samples

病原菌Pathogen菌株數(shù) Strainnumber所占比率/%Proportion金黃色葡萄球菌S.aureus9836.70無乳鏈球菌S.agalactiae6524.34停乳鏈球菌S.dysgalactiae5721.35大腸埃希菌E.coli4316.10表皮葡萄球菌S.epidermidis41.50合計Total267100

3 討論

檢測的乳樣大部分來源于吉林省各大奶牛養(yǎng)殖場以及一少部分來自于散養(yǎng)戶，采樣具有廣泛的代表性。眾所周知，乳房炎是奶牛養(yǎng)殖業(yè)的常見病和多發(fā)病，會造成較大經(jīng)濟(jì)損失，產(chǎn)奶牛下降、奶品質(zhì)量下降影響人體健康，嚴(yán)重制約著奶牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。奶牛乳房炎主要病原體為細(xì)菌、真菌、支原體以及病毒，對采集的乳樣進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，共分離出5種病原菌，分別為金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌以及停乳鏈球菌，占致病菌總數(shù)的82.40%。大腸埃希菌對奶牛乳房炎的發(fā)生也有較強(qiáng)的致病作用，與尹柏雙等[10]報道一致。研究表明，吉林省奶牛乳房炎的主要病原體為金黃色葡萄球菌、鏈球菌以及大腸埃希菌，這幾種細(xì)菌均為環(huán)境和機(jī)體常見菌，說明養(yǎng)殖環(huán)境和飼養(yǎng)管理水平對于奶牛乳房炎意義重大，因此加強(qiáng)環(huán)境消毒、合理免疫、注意奶牛衛(wèi)生操作、加強(qiáng)乳房保健以及科學(xué)合理飼養(yǎng)對于防控奶牛乳房炎具有重要意義。

表2 不同藥物對各種病原菌的平均抑菌直徑(mm)

Table 2 Average inhibition diameters of different drugs to various pathogens (mm)

藥物Drugs金黃色葡萄球菌S.aureus無乳鏈球菌S.agalactiae停乳鏈球菌S.dysgalactiae大腸埃希菌E.coli表皮葡萄球菌S.epidermidis紅霉素Erythromycin10.51±1.423.64±1.493.57±1.278.04±2.3412.07±2.04青霉素Penicillin8.47±1.367.39±1.047.98±1.578.24±1.088.06±1.19鏈霉素Streptomycin9.47±0.437.65±1.377.86±1.2815.67±1.349.27±1.38丁胺卡那霉素AmikacinCiprofloxacin21.04±0.9621.49±0.9423.07±1.0723.59±2.0620.67±1.29環(huán)丙沙星ciprofloxacin24.42±1.0627.08±0.9727.94±1.3417.94±1.3924.75±2.64氟哌酸Norfloxacin15.47±1.3116.48±1.2715.67±1.0576.47±1.3218.97±1.28恩諾沙星Enrofloxacin26.34±1.5925.37±1.2425.98±2.3019.24±2.0627.04±1.35慶大霉素gentamicin10.37±1.4710.58±1.3910.49±1.2112.94±1.3713.67±096氨芐西林ampicillin10.53±1.5110.57±1.678.34±1.2916.89±1.4212.46±1.81克林霉素Clindamycin14.47±0.8615.89±1.1817.05±0.9114.24±1.2616.36±1.29四環(huán)素Tetracycline16.47±1.724.58±1.074.37±1.796.94±1.2116.14±2.04頭孢噻肟Cefotaxime28.97±1.5823.57±1.6124.08±2.0420.36±1.6427.64±1.69復(fù)方新諾明Cotrimoxazole16.47±0.9115.59±1.7614.87±1.2613.29±2.0717.61±0.79阿莫西林Amoxicillin14.31±1.0912.54±1.2413.95±1.0718.28±1.9414.96±1.62萬古霉素vancomycin20.59±1.2717.89±1.2518.35±1.7819.16±1.6720.78±1.82

注：數(shù)據(jù)采用5次試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

Note：The data represent mean ± SD of five tests.

從敏感藥物篩選試驗(yàn)結(jié)果來看，常用抗菌藥的效果均不好，這與平時的治療習(xí)慣關(guān)系密切。對于奶牛乳房炎的常規(guī)治療大多采用青霉素結(jié)合鏈霉素治療，長期不合理、不規(guī)范、不科學(xué)使用抗菌藥會引起機(jī)體產(chǎn)生耐藥性[11-14]，而紅霉素、慶大霉素以及氨芐西林在一定時間、一定區(qū)域內(nèi)一度作為抗炎的首選藥物，因此奶牛機(jī)體會對以上藥物產(chǎn)生較強(qiáng)的耐藥性；丁胺卡那霉素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、頭孢噻肟在平時治療奶牛疾病時應(yīng)用較少，抗菌譜相對較窄，奶牛對以上抗生素相對敏感，試驗(yàn)結(jié)果同時表明，同類抗生素在應(yīng)用時效果相同一致，不同類型的抗菌藥之間效果差異顯著。在應(yīng)用抗生素治療奶牛乳房炎時要注意抗生素的藥理屬性以及應(yīng)用范圍，除了要考慮機(jī)體耐藥性因素，還要考慮抗生素的其他副作用，如藥物殘留、對機(jī)體內(nèi)環(huán)境的破壞以及對機(jī)體組織器官的損傷等[15-16]，因此，中藥治療奶牛乳房炎應(yīng)該是未來研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。

對吉林省各大奶牛場的乳樣通過細(xì)菌分離鑒定，確定吉林省奶牛乳房炎的主要致病菌為金黃色葡萄球菌、鏈球菌以及大腸埃希菌，這些致病菌對丁胺卡那霉素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、頭孢噻肟以及萬古霉素高度敏感，可以作為吉林省奶牛乳房炎治療的優(yōu)選藥物，但抗生素治療奶牛乳房炎存在一定的安全隱患，選擇一種安全有效的治療方法任重而道遠(yuǎn)。

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Isolation,Identification and Drug Sensitivity Test of Pathogenic Bactcria Causing Dairy Cow Mastitis in Jilin Province

HAO Jing-feng1,LI Jing-ji1,ZHANG Yu-hang1,YIN Bai-shuang1,FU Lian-jun1,HUANG Yan1,LI Xin-wei2,LI Xiao-bing2,ZHAO Chen-xu2,LIU Guo-wen2

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgriculturalScienceandTechnologyUniversity,Jilin,Jilin，131102,China;2.CollegeofVeterinaryMedicine,JilinUniversity,Changchun,Jilin，130062,China)

To know about incidence of dairy cow mastitis in different regions of Jilin province and provide a theorical foundation for comprehensive prevention and control of dairy cow mastitis. 200 milk samples from cow farms in Changchun,Jilin,Baishan and Yanji were collected,and the main pathogens were identified and then used for drug sensitivity test.The results showed that theE.coli,S.aureus,S.agalactiaeandS.dysgalactiaeare the main pathogens causing dairy cow mastitis.And 267 strains of bacteria were isolated from the milk samples,98 strains among them areS.aureus(36.70%), 65 areS.agalactiae(24.34%),57 areS.dysgalactiae(21.35%),43 areE.coli(16.10%)and others are 1.5%.Four kinds of pathogenic bacteria were highly sensitive to amikacin, ciprofloxacin, enrofloxacin, cefotaxime and vancomycin,but were completely resistant to penicillin, streptomycin, erythromycin, gentamicin,therefore,amikacin, ciprofloxacin, enrofloxacin, cefotaxime and vancomycin can be primary drugs for treatment of cow mastitis in Jilin province.

dairy cow mastitis;pathogen identification;drug sensitivity test

2016-05-05

吉林省科技廳重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(20150204024NY)；吉林省教育廳項(xiàng)目(吉教科合字[2016]第205號)；國家級大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目(201611439025)；吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院重點(diǎn)學(xué)科項(xiàng)目(吉農(nóng)院合字[2015]第X50號)

郝景鋒(1977-)，男，黑龍江甘南人，博士研究生，講師，主要從事臨床獸醫(yī)學(xué)研究。 *通訊作者

S857.26

B

1007-5038(2016)12-0126-04