雞眼草總黃酮含量測定及其植株含量動態(tài)積累

吳瑞云，李 杰，祝 沖，黃俊華，吳柳柳，周 琦，陳龍清

(1華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝林學(xué)學(xué)院，園藝植物生物學(xué)教育部重點實驗室，武漢 430070；2中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，南方少數(shù)民族地區(qū)生物資源保護(hù)與綜合利用工程中心，武漢 430074)

雞眼草總黃酮含量測定及其植株含量動態(tài)積累

吳瑞云1,2，李 杰2，祝 沖2，黃俊華2，吳柳柳2，周 琦2，陳龍清1 *

(1華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝林學(xué)學(xué)院，園藝植物生物學(xué)教育部重點實驗室，武漢 430070；2中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，南方少數(shù)民族地區(qū)生物資源保護(hù)與綜合利用工程中心，武漢 430074)

目的：建立操作簡單、穩(wěn)定性好的雞眼草總黃酮含量測定方法，比較雞眼草不同采收期的植株生物量及總黃酮積累量. 方法：以紫外分光光度法考察雞眼草提取液在三乙胺介質(zhì)中的紫外可見光譜；測定雞眼草植株生物量與不同器官的總黃酮含量,考察總黃酮積累的動態(tài)變化. 結(jié)果：在三乙胺介質(zhì)中，雞眼草總黃酮和蘆丁的最大吸收均紅移至400 nm處；蘆丁在1.0～25.0 mg/L濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系. 不同采收期間雞眼草根、莖、葉的總黃酮含量差異顯著；6～8月總黃酮含量均高于9～11月. 8月下旬～9月上旬植株生物量較大，植株總黃酮積累量達(dá)到峰值. 結(jié)論：三乙胺方法用于雞眼草總黃酮含量測定，方法簡便、重現(xiàn)性較好，可操作性強. 8月下旬～9月上旬適于大量采集雞眼草用于生產(chǎn).

雞眼草；三乙胺；采收期；植株生物量；總黃酮積累

雞眼草，藥性甘、淡，微寒；具有清熱解毒，活血，利尿，止瀉的功效. 臨床主要用于胃腸炎、痢疾、肝炎、夜盲癥，泌尿系統(tǒng)感染、跌打損傷、療瘡癤腫[1,2]. 上海市中藥材標(biāo)準(zhǔn)中藥“雞眼草”收載品種為蝶形花科雞眼草屬雞眼草Kummerowiastriata(Thunb.) Schindl. 和長萼雞眼草Kummerowiastipulacea(Maxim.) Makino.的干燥全草[3]. 據(jù)報道，黃酮類成分是雞眼草藥材中含量較高的活性成分，主要有山柰酚，槲皮素，芹菜素、木犀草素、異牡荊素、染料木素、異葒草素等及其葡萄糖苷包括蘆丁、山奈酚-葡萄糖苷、芹菜素-新橙皮糖苷、芹菜素-葡萄糖苷、木犀草素-葡萄糖苷等[2,4～5]. 本實驗前期工作發(fā)現(xiàn)春夏季雞眼草全草總黃酮含量均較高[6]，但不同采收期不同部位總黃酮含量、植株生物量、植株總黃酮積累等，尚未見報道. 本研究以蘆丁為對照品，以三乙胺為介質(zhì)建立操作簡單、穩(wěn)定性好的雞眼草總黃酮含量測定方法，進(jìn)一步分析不同采收期不同器官的總黃酮含量，考察總黃酮在植株中積累的規(guī)律，為雞眼草藥材的采收和質(zhì)量評價提供依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

2013年6月～11月于中南民族大學(xué)南湖校區(qū)采集雞眼草，陰干并密封保存. 經(jīng)中南民族大學(xué)藥學(xué)院萬定榮教授鑒定為蝶形花科雞眼草屬雞眼草Kummerowiastriata(Thunb.) Schindl.的干燥全草.

對照品：蘆丁(槲皮素-3-O-蕓香糖苷)標(biāo)準(zhǔn)品購于中國生物制品檢定所，批號：100080-200707，供UV法測定，含量為92.5%.

UV-2401分光光度計(日本島津公司)，UV-752 分光光度計(上海分析化學(xué)儀器公司)，AG285電子分析天平(瑞士Metler公司)，KQ—100E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，精密型水平運風(fēng)烤箱(深圳耐美特工業(yè)制備有限公司)，高速粉碎機(上海冠聯(lián)制藥裝備有限公司).

1.2 實驗方法

1.2.1 生物量測定

采收期內(nèi)每隔15 d采樣，量取完整植株地上部分的高度，取平均值作為植株株高. 40℃恒溫24 h烘干并稱重，取平均值作為植株干重.

1.2.2 樣品預(yù)處理

樣品烘干后磨成粉末，過二號篩，充分混勻備用. 稱取樣品粉末0.1 g，加入70%的乙醇10 mL，溫度30℃，超聲波功率100 W，提取30 min，放冷，稱重，用70%乙醇補足減失重量，搖勻，離心過濾.

1.2.3 樣品溶液的三乙胺法掃描

量取供試品溶液0.5 mL，置于10 mL試管中，加70%乙醇至5 mL，加1%三乙胺溶液至10 mL，搖勻，靜置12 min后， 以試劑空白作參比[7]，在200～600 nm進(jìn)行掃描分析.

1.2.4 對照品溶液的制備及掃描

120℃下干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，加入30 mL 70%的乙醇至50 mL容量瓶中，置水浴上微熱使溶解，加乙醇至刻度，配成0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液. 取一定梯度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0～0.2 mg/mL，按“1.2.3”方法，在200～600 nm進(jìn)行掃描分析.

吸取70%乙醇2.5 mL，置10 mL試管中，加入1%三乙胺溶液2.5 mL，搖勻，作為含三乙胺的參比溶液.

吸取70%乙醇2.5 mL，置10 mL試管中，加入蒸餾水2.5 mL，搖勻，作為不含三乙胺的參比溶液.

0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL，分置于25 mL容量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻. 不同梯度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液各5 mL，加1%三乙胺溶液至10 mL，搖勻，靜置12 min后，以試劑空白作參比，在400 nm波長下測定吸光度考察線性關(guān)系.

1.2.5 雞眼草總黃酮提取

雞眼草粉末0.1 g，加入70%的乙醇10 mL，溫度75℃，超聲波功率500 W，提取45 min，放冷，稱重，用70%乙醇補足減失重量，搖勻，離心，取上清液.

1.2.6 三乙胺法測定總黃酮含量及方法可靠性檢驗

取供試品溶液0.5 mL，按“1.2.3”方法在400 nm波長下測定吸光度，計算總黃酮含量.

按照上述黃酮測量方法連續(xù)測量6次，計算總黃酮含量及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，考察儀器的精密度. 此外，取一樣品每隔15 min測定吸光度，連續(xù)測定6次，計算隨測量時間變化總黃酮含量的變化及RSD，考察樣品的穩(wěn)定性.為了考察方法的重現(xiàn)性，進(jìn)一步取同一批樣品6份，分別計算總黃酮含量及RSD.

取已知含量的雞眼草粉末6份(總黃酮含量為2.636% )，每份約0.1 g，均加入已知含量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品2 mg，按“1.2.5”的方法制備溶液；每份取0.5 mL，三乙胺法顯色，測定各份樣品中吸光度，計算總黃酮及RSD含量，以期得知加樣回收率.

2 結(jié)果與分析

2.1 三乙胺法的建立

取雞眼草樣品溶液(加三乙胺)、蘆丁溶液(加三乙胺)在200～600 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行紫外可見光譜掃描，結(jié)果顯示，雞眼草樣品和蘆丁對照品在pH>10的溶液中，最大吸收均紅移(圖1，圖2). 雞眼草樣品溶液(加三乙胺)的最大吸收峰位移至400 nm處；結(jié)果與對照品一致，位移大約60 nm，并顯示吸收強度增加. 而不含三乙胺的雞眼草樣品溶液、蘆丁溶液均未顯示此現(xiàn)象.

最大波長的確定：蘆丁和樣品加三乙胺溶液后在400 nm處均有最大吸收，而不含三乙胺的蘆丁和樣品溶液在此波長下基本無吸收，故選擇測定波長為400 nm.

樣品紫外可見光譜(10 g/L)圖1 三乙胺法顯色體系中雞眼草紫外可見光譜 Fig.1 UV/Vis spectra of K. striata in TEA systems

對照品溶液的紫外可見光譜(16 mg/L)圖2 三乙胺法顯色體系中對照品蘆丁溶液的紫外可見光譜Fig.2 UV/Vis spectra of Rutin in TEA systems

2.2 三乙胺法的方法學(xué)考察

按2005版《中國藥典》一部附錄VA紫外-可見分光光度法/中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證指導(dǎo)原則[8]，進(jìn)行方法驗證.

經(jīng)回歸處理，求得回歸方程A=0.04258C-0.0138(r=0.9991). 對照品蘆丁在1.0～25.0 mg/L濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系.

精密度實驗檢測為連續(xù)6次測定吸光度，計算總黃酮提取率. 結(jié)果為2.639%，2.636%，2.635%，2.628%，2.641%，2.637%；平均值為2.636%，RSD =0.1697% (n=6)，表明儀器精密度良好.穩(wěn)定性實驗表明，在120 min內(nèi)樣品的穩(wěn)定性非常好(表1). 同一批制6份雞眼草粉末總黃酮含量結(jié)果平均值為2.636%，RSD為1.63% (n=6)，表明本方法重復(fù)性良好.

表1 雞眼草樣品穩(wěn)定性

加樣回收率分析表明(表2)，平均加樣回收率為99.51%，RSD為1.88%(n=6). 以上檢測結(jié)果表明，該法用于雞眼草總黃酮含量測定方法簡單，結(jié)果可靠.

表2 雞眼草樣品加樣回收率試驗結(jié)果

2.3 不同采收期雞眼草的植株生物量變化

隨著供試樣品生育期延長，株高基本呈S型變化，干重與株高變化基本一致(圖3，4). 6月10日～7月11日期間株高與干重的增長處于指數(shù)期，增長速率基本保持不變；7月11日～8月25日期間為直線增長期，植株生長迅速，株高與干重增長最明顯；9月是開花期，9月11日結(jié)果表明此時期株高與干重均達(dá)到最高值；10月結(jié)果，11月種子成熟，10～11月植株生長幾乎處于停止?fàn)顟B(tài)，干重有所下降.

日期圖3 不同采收期雞眼草的株高Fig.3 Plant height of K. striata in different harvest times

日期圖4 不同采收期雞眼草的植株干物質(zhì)積累動態(tài)Fig. 4 Accumulation trends of plant dry substance of K. striata in different harvest times

2.4 不同采收期雞眼草根、莖、葉器官的總黃酮含量變化

6～8月，根、莖、葉中的總黃酮含量均高于其他采收期；9～10月開始緩慢下降；11月葉中含量大幅度降低(圖5). 方差分析表明，不同采收期間根、莖、葉間總黃酮含量的差異具有極顯著性(p<0.01).

日期圖5 不同采收期雞眼草不同部位總黃酮得率Fig. 5 The yield of flavonoids among 3 parts of K. striata in different harvest times

2.5 不同采收期雞眼草的植株總黃酮積累

隨著供試樣品生育期延長，雞眼草的植株總黃酮積累量呈單峰形變化(圖6). 6月中旬～7月中旬期間，雖然器官總黃酮得率高(圖5)，但是由于植株生物量小(圖4)，植株總黃酮積累量偏??；8月下旬～9月上旬期間，器官總黃酮含量較高，且植株生物量大，植株總黃酮積累量達(dá)到峰值(圖6)；10～11月，器官總黃酮含量下降，植株生物量減少，植株總黃酮積累量也同時降低. 以上結(jié)果表明雞眼草藥材適于8～9月大規(guī)模采收.

日期圖6 不同采收期雞眼草植株總黃酮積累動態(tài)Fig.6 Accumulation trends of total flavonoids of K. striata in different harvest times

3 討論

總黃酮含量作為質(zhì)量控制指標(biāo)，大多以蘆丁為對照品、NaNO2-Al(NO3)3-NaOH為顯色試劑，采用可見分光光度法于510 nm處測定吸光度[8,9]，但該法對黃酮類成分山奈酚、槲皮素、橙皮苷、黃芩苷、黃芩素等在510 nm左右處幾乎無吸收或吸收較弱[7,9]，測定總黃酮含量專屬性不強. 筆者用超聲波輔助提取雞眼草總黃酮后，用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法顯色時，由于受眾多因素的影響，產(chǎn)生沉淀. 雞眼草中黃酮類的主要成分中，蘆丁、木犀草素、芹菜素、異槲皮苷等(黃酮及其苷和3-黃酮醇苷)在NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系中只有蘆丁、異槲皮苷等在510 nm處有最大吸收[7]，結(jié)果只能反映蘆丁、異槲皮苷等的成分含量而不能反映木犀草素、芹菜素及其苷等的含量. 另一種常見方法“AlCl3-KAc比色法”的問題是對雞眼草中的芹菜素及苷無位移；對蘆丁、異槲皮苷、槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山萘素等的最大吸收均可位移至400 nm以上，但位移峰值有所不同[7]，因此“AlCl3-KAc比色法”專屬性也有局限性. 本實驗采用TEA為顯色劑，雞眼草的主要黃酮類活性成分中，蘆丁、木犀草素、芹菜素、異槲皮苷等(黃酮及苷和3-黃酮醇苷)在400 nm處均有最大吸收，且芹菜素以TEA體系最為方便和穩(wěn)定[7]. 與前兩種方法相比，以蘆丁為對照品，TEA比色法具有專屬性較強，操作簡單、穩(wěn)定性好的特點，是測定雞眼草總黃酮含量較有效的方法，且簡便、易行.

供試樣品的總黃酮含量測定結(jié)果表明，6～8月份總黃酮含量較高，均可以采集入藥. 但進(jìn)一步測定植株生物量及總黃酮積累，結(jié)果表明，6月到7月上旬期間植株生物量小，植株總黃酮積累量小，不適宜大量采集；7～8月植株總黃酮積累量隨生物量迅速增高；至8月下旬～9月上旬，植株總黃酮積累量達(dá)到峰值，此時最適于大量采集用于生產(chǎn).

[1] 《全國中草藥匯編》編寫組.全國中草藥匯編(上冊)[M].2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2000：443.

[2] 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大詞典(上冊)[M].上海：上海人民出版社，1977：1215.

[3] 黎躍成.藥材標(biāo)準(zhǔn)品種大全[M].成都：四川科學(xué)出版社，2001，6：55.

[4] 唐人九.人字草黃酮類化學(xué)成分研究[J].華西藥學(xué)雜志，1996，11(1)：5-10.

[5] 李勝華.雞眼草中黃酮類化學(xué)成分研究[J].中國藥學(xué)雜志.2014，49(10)：817-820.

[6] 吳瑞云，黃麗丹，蔣 婷，等.不同產(chǎn)地雞眼草總黃酮含量及動態(tài)變化研究[J].中南民族大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2016，35(3)：51-61.

[7] 池玉梅，居 羚，鄧海山，等.分光光度測定總黃酮法的適用性[J].分析化學(xué)，2010，38(6)：893-896.

[8] 國家藥典委員會.中國藥典.附錄VA[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：246.

[9] 郭亞健.對《中國藥典》2005年版槐花總黃酮含量測定的修訂建議[J].中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2008，9(5)：327-328.

Determination of Total Flavonoids in K. striata and Its Dynamic Accumulation in Plants

Wu Ruiyun1,2，Li Jie2，Zhu Chong2，Huang Junhua2，Wu Liuliu2，Zhou Qi2，Chen Longqing1

(1 Key Laboratory of Horticultural Plant Biology (Ministry of Education)，College of Horticulture & Forestry Sciences，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China；2 Engineering Research Centre for the Protection and Utilization of Bioresource in Ethnic Area of Southern China，College of Life Science， South-Central University for Nationalities，Wuhan 430074，China)

Objective: To develop a simple and stable method for determining the total flavonoids ofK.striata，and to investigate the plant biomass and total flavone accumulation of plants that were picked regularly in different harvest times. Methods: The suitability of TEA UV/Vis spectrophotometric method was studied by comparing the spectra of the total flavonoids inK.striata. The plant biomass of plants and total flavonoids of different organs were tested.Results: Both of the total flavonoids inK.striataand Rutin could produce a red shift of the maximum absorption in the medium of triethylamine. There was a good linear relationship between the concentrations and the absorbance of Rutin in the range of 1.0～25.0 mg /L. The yield of flavonoids among 3 parts of plant were significantly different. The yield during June to August was higher than that during September to November. However, in late August and early September，the plant biomass got bigger and the accumulation of total flavonoids of plants reached the maximum value.Conclusions: The TEA method was simple，convenient and reproducible. It could be applied for determining the total flavonoids inKummerowiaschindl. During late August and early September，it is appropriate to collect the herb in large-scale，which can be used in production.

K.striata.；triethylamine；harvest times；plant biomass；accumulation of total flavonoids

2016-06-28 *通訊作者 陳龍清， 研究方向：園林植物種質(zhì)資源及其利用，E-mail:chenlq@mail.hzau.edu.cn.

吳瑞云(1968-)，女，博士研究生，講師，研究方向：藥用植物資源學(xué)，E-mail:wurain2008@126.com

國家科學(xué)技術(shù)部科技基礎(chǔ)性工作專項重點項目資助(2014FY110100)；中南民族大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費專項資金項目(ZZY10008)

Q945.79

A

1672-4321(2016)04-0029-05