魏 超，郭靈安，代曉航，楊文婷

(1.四川省農(nóng)科院分析測試中心，四川 成都 610066；2.樂山市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，四川 樂山 614000)

草莓表面典型微生物鑒定、16SrDNA同源性分析及附著能力研究(I)

魏 超1，郭靈安1，代曉航1，楊文婷2

(1.四川省農(nóng)科院分析測試中心，四川 成都 610066；2.樂山市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，四川 樂山 614000)

按照草莓生長的3個階段對四川草莓主產(chǎn)區(qū)某生產(chǎn)基地進行2年度連續(xù)抽樣，對分離的草莓表面微生物進行生化鑒定和16SrDNA測序鑒定；假單胞菌、陰溝腸桿菌2種出現(xiàn)率較高的微生物采用最大簡約法(MP)進行同源性分析；并對致軟腐微生物進行附著和清洗試驗。結(jié)果表明，沙雷菌，泛菌屬泛菌，少動鞘氨醇單胞菌在草莓青果期出現(xiàn)率較高，假單胞菌，陰溝腸桿菌在各個時期不同地域的草莓均有檢出；采摘時間及成熟程度不同草莓表面分離的假單胞及陰溝腸桿菌具有同源性但分子水平仍有差異；清洗試驗表明10 %的鹽水和含氯清洗劑可以改變微生物的滲透壓，有效清除表面附著的假單胞菌和陰溝腸桿菌。本試驗對草莓表面致腐微生物的研究將為草莓的安全食用提供參考。

草莓；致軟腐微生物；系統(tǒng)發(fā)育樹；食用安全控制

草莓果肉多汁，營養(yǎng)豐富且含有特殊的濃郁水果芳香,但其營養(yǎng)價值高，糖量高、含水量高并且質(zhì)地柔軟的特點，也成為微生物的繁殖生長的溫床，草莓表面微生物的大量快速生長一方面加快了草莓腐爛速度，使草莓很難長久保鮮，另一方面草莓表面滋生的致病微生物也為草莓的食用安全帶來隱患。在草莓表面微生物的研究中，發(fā)現(xiàn)草莓表面分布多種腸桿菌，其中假單胞菌可加速草莓的腐爛，是其致腐微生物之一[1-2]。假單胞菌 (Pseudomonadaceae)微生物化能有機營養(yǎng)，嚴格好氧，并且假單胞菌附著能力較強，不易清洗去除，有研究表明其為常見的果蔬致腐微生物[3]。陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)，屬于腸桿菌科腸桿菌屬，為革蘭氏陰性粗短桿菌，有周身鞭毛、無芽孢，兼性厭氧，營養(yǎng)要求不高，其廣泛存在于自然界中，在人和動物的糞便、泥土、中均可檢出，是腸道正常菌種之一，但一定條件下可為條件致病菌。

在對草莓表面微生物連續(xù)3年收集整理后，采用16SrDNA 分子檢測方法對不同時期草莓上細菌的分布情況進行調(diào)查，部分出現(xiàn)率較高的微生物進行同源性分析，研究草莓表面總體微生物種群的的分布關(guān)系，并用常見多種清洗方法對草莓表面微生物的去除比較，旨在對食用草莓的風險進行分析，并為找到草莓上細菌污染的干預(yù)方法提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

草莓(FragariaananassaDuch.)樣品來源2013，2014年，四川省成都市某草莓無公害種植基，根據(jù)生長階段在12月份青果，2月份采摘期及4月份較成熟期各選取5個批次進行微生物篩查，共30份樣品。

儀器與試劑：微生物培養(yǎng)及生化鑒定：營養(yǎng)肉湯、腦心浸液、血平板、營養(yǎng)瓊脂平板，購于廣東環(huán)凱，假單胞菌顯色培養(yǎng)基購于廣州博賽，腸桿菌計數(shù)紙片為美國3M公司；微生物鑒定儀器為法國生物梅里埃公ATB細菌鑒定儀；鑒定試劑條為法國生物梅里埃公司ID 32 E。高壓滅菌鍋，上海三申FM75;DHP-9082 培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司。

微生物分子鑒定：MasterMix 購于成都博瑞克生物技術(shù)有限公司; 微生物裂解液的Lysis Buffer為 Takara 公司； 作引物正向引物(F27):5-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3; 反向引物(R1492):5-TACGYTACCTTGTTACGACT-3，上海英駿生物技術(shù)公司合成，測序為上海立菲生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 微生物分離培養(yǎng) 稱取25 g樣品，用蛋白質(zhì)緩沖水(BPW)1∶10 稀釋制成增菌液，將增菌液分別有氧、厭氧36 ℃培養(yǎng)18～24 h，后將增菌液劃線于血平板、營養(yǎng)瓊脂平板、伊紅美藍平板，在36 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h，挑取各平板上不同類型菌落形態(tài)于營養(yǎng)瓊脂平板上純化。

1.2.2 微生物的理化鑒定 在營養(yǎng)瓊脂上培養(yǎng)并挑取可分離的單菌落，進行革蘭氏染色和鏡檢，標記初檢結(jié)果，使用ATB細菌鑒定儀鑒定，G-菌使用ID 32 E試劑條。鑒定時挑取營養(yǎng)瓊脂或血平板上菌落至比濁管，振蕩分散，上樣前將菌液調(diào)至0.5麥氏濁度，用移液器將樣品注入試劑條樣杯中，由ATB系統(tǒng)自動檢測、數(shù)據(jù)分析并給出最終結(jié)果。

1.2.3 微生物分子試驗 ①DNA 模板制備。用滅菌牙簽或槍頭挑至50 μl Lysis Buffer裂解液中，混合，沸水浴15 min，10 000 r/min離心冰浴，取裂解后上清液作為PCR 反應(yīng)模板。②PCR 反應(yīng)體系和參數(shù)。PCR 反應(yīng)體系體積為25 μl，Taqmix(2×) 12.5 μl，上下游引物各1μl，模板DNA 1μl，ddH2O 9.5 μl，PCR 反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30 個循環(huán)，72 ℃保溫10 min。③測序及比對。對目標16 srDNA序列進行雙向測序并拼接，將測序結(jié)果提交NCBI比對。④系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。在Genebank下載覆蓋率100 %，擬合度99 %及以上的序列進行比較，用MAGA6軟件進行序列分析，相似程度較高的采用最大簡約法(Maximum parsimony)進行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。

1.2.4 草莓表面微生物附著及清洗試驗 血平板分離純化草莓分離微生物銅綠假單胞菌(11Y1)、陰溝腸桿菌(19WYU34)，挑取血平板上菌落至比濁管，振蕩分散，將菌液調(diào)至0.5麥氏濁度(菌體約為1.5×108個/mL),取1 mL 0.5 麥氏濁度菌液與150 mL無菌水中，將草莓浸泡10 min，無菌表面烘干，模擬日常草莓清洗手段，進行4項平行清洗試驗，處理分別為：a)自來水連續(xù)沖洗10 min，b) 10 %NaCl溶液浸泡10 min，c)含氯消毒劑(C3O3N3Cl2Na)0.2 % 浸泡10 min，d)日常有機清洗劑洗潔精濃度為1 % 浸泡10 min，處理后的草莓進行銅綠假單胞菌、陰溝腸桿菌計數(shù)檢測。

銅綠假單胞菌計數(shù)試驗方法為：取待試草莓樣品于無菌均質(zhì)袋均質(zhì)，按照1︰10比例用無菌生理鹽水將樣品稀釋到合理區(qū)間，取1 mL稀釋液涂布在假單胞菌顯色培養(yǎng)基，36 ℃培養(yǎng)24 h后，對藍綠色菌落進行計數(shù)。陰溝腸桿菌計數(shù)試驗方法為：取待試草莓樣品于無菌均質(zhì)袋均質(zhì)，按照1︰10比例用無菌生理鹽水將樣品稀釋到合理區(qū)間取1 mL稀釋液懸滴于腸桿菌測試紙片，36 ℃培養(yǎng)24 h 后對紅色并且周圍產(chǎn)生氣泡的菌落進行計數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 草莓表面微生物的分離鑒定

采用1.2.1的方法對草莓表面上的細菌進行分離，對出現(xiàn)率最高的5種微生物進行鑒定，鑒定結(jié)果見表1，生化圖譜見表2。其中深沙雷菌，少動鞘氨醇單胞菌，泛菌屬泛菌，在草莓青果期出現(xiàn)率較高，假單胞菌，陰溝腸桿菌在各個時期不同地域的草莓均有檢出，編號2WYU35 在理化檢測結(jié)果為阪崎腸桿菌，但對其16srDNA測序結(jié)果進行比對后為陰溝腸桿菌,實驗結(jié)果表明阪崎腸桿和陰溝腸桿菌在16srDNA親緣性很接近，但其生化反應(yīng)所差異。分離阪崎腸桿菌(2WYU35)可發(fā)酵a-葡萄糖苷酶，不能發(fā)酵a-麥芽糖，L-阿拉伯糖，d-甘露醇，但陰溝腸桿菌可發(fā)酵后者。此外假單胞菌科微生物生化檢測為2個種，分別為銅綠假單胞菌和惡臭假單胞菌，在16srDNA鑒定中可分為為銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌等。

表1 5種屬微生物的鑒定

2.2 微生物分類及16SrDNA同源性分分析

對分離頻率較高的微生物陰溝腸桿菌和假單胞菌進行，16srDNA同源性分析比對結(jié)果表明分子型總體差異性較小，用分離微生物序列與NCBI比對，覆蓋率100 %，相似度99 %歸屬于陰溝腸桿菌和假單胞菌，鑒于2種微生物間內(nèi)序列相似成度高根據(jù)離散型性狀包括形態(tài)學性狀和分子序列DNA的變異程度，采用最大簡約法(Maximum parsimony)，構(gòu)建生物的系統(tǒng)發(fā)育樹，并分析生物物種之間的演化關(guān)系。陰溝腸桿菌和假單胞菌系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1～2。由系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出假單胞菌序列間相似程度較高，大體可以分為2種與生化鑒定結(jié)果相符；腐敗草莓中分離的假單胞菌基本與編號2lian序列比對100 %一致表明草莓表面致腐微生物的種群結(jié)構(gòu)相對保持穩(wěn)定。分離的陰溝腸桿菌見差異性較小，與陰溝腸桿菌標準菌株比對有一定差異，但差異不明顯，但分離鑒定為陰溝腸桿菌微生物總體與2WYU35即生化鑒定為阪崎腸桿菌微生物差異較明顯，雖然在NCBI上微生物2WYU35 16srDNA的鑒定結(jié)果為陰溝腸桿菌，但從微生物的分子系統(tǒng)發(fā)育和生化反應(yīng)結(jié)果上看，兩種微生物還存在明顯差異。

圖1 假單胞菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of Pseudomonas spp.

2.3 微生物附著與清洗試驗

附著與清洗試驗結(jié)果見表2，處理a～e分別為a)自來水連續(xù)沖洗，b) 10 %NaCl溶液浸泡，c)含氯消毒劑浸泡，d)日常有機清洗劑洗潔精濃度浸泡，e)無清洗對照；樣品1～3分別為青果，紅果，微腐爛果。草莓較易附著微生物，無論何種清洗方法都無法將草莓表面的微生物徹底祛除，這與草莓漿果的表皮構(gòu)成有關(guān)；相比較下陰溝腸桿菌對青果與果紅附著能力相近，但較易附著微腐爛果，假單胞菌對3

圖2 陰溝腸桿菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of Enterobacte spp.

微生物計數(shù)(CFU/g)Microorganismcounting樣品1Sample1樣品2Sample2樣品3Sample3假單胞菌Pseudomonas陰溝腸桿菌Enterobacte假單胞菌Pseudomonas陰溝腸桿菌Enterobacte假單胞菌Pseudomonas陰溝腸桿菌Enterobacte處理a3.5×102.2×1029.5×101.0×1021.2×1023.6×102處理d<102.5×10<103.5×104.0×101.0×10處理c<101.5×101.0×10<10<102.5×10處理d2.0×1021.9×1022.4×1026.2×1025.6×1025.8×103處理e2.5×1023.4×1033.8×1021.2×1039.2×1021.1×104

表3 草莓微生物鑒定圖譜

注：ID 32 E 試劑條：LIP 酯酶，βNAG β氮乙酰葡萄糖胺，MAL d-麥芽糖，GLU d-葡萄糖，SAC 蔗糖，GAT d-半乳糖酸鹽同化，URE 尿素酶，AHD 精氨酸雙水解酶，INO 肌醇，aMALa-麥芽糖，CEL d-纖維二糖，βGAL 半乳糖苷酶，AspA L-天門冬素芳胺酶，TRE d-海藻糖，aGLU a-葡萄糖苷酶，LARA L-阿拉伯糖，ODC 鳥氨酸脫羧酶，IND 吲哚，MAN d-甘露醇，RP 酚紅，5KG 5酮基·葡萄糖酸鈉，LARL L-阿拉伯醇，LDC 賴氨酸脫羧酶，βGLU β-葡萄糖苷酶，MNT 丙二酸鹽，SOR d-山梨醇，βGUR β葡萄糖醛縮酶，ADO 側(cè)金盞花醇，RHA L-鼠李糖，aGAL a-半乳糖苷酶，DARL D-阿拉伯醇, PLE 古老糖。

種情況的草莓附著能力相近，這與微生物的菌毛性結(jié)構(gòu)與草莓表面種子形成的凹凸結(jié)構(gòu)有關(guān)[4]；由清洗試驗可以看出，陰溝腸桿菌比假單胞菌更易消除，自來水沖洗可以將草莓表面部分微生物降低1～2個對數(shù)單位，日常有機清洗劑洗潔精濃度浸泡對微生物消除降低0～1個對數(shù)單位，10 % NaCl溶液浸泡，和含氯消毒劑浸泡可有效的降低草莓中假單胞菌和陰溝腸桿菌的數(shù)量，含氯消毒劑是國內(nèi)外水果加工有效的微生物去除劑，10 % NaCl溶液可以改變微生物及草莓表皮的滲透壓，有效的去除此2種微生物表面附著。

3 討 論

3.1 微生物同源性分析

在對不同時期微生物的16srDNA進行同源性分析時，實驗結(jié)果證明不同時期不同樣品草莓上分離的假單胞菌屬微生物的基因機構(gòu)基本穩(wěn)定，假單胞菌分子分類學通過rRNA寡核苷酸分成rRNAⅠ～Ⅳ組，Ⅰ組包銅綠假單胞菌，致金色假單胞菌，惡臭假單胞菌，丁香假單胞菌等[5]，試驗分離的假單胞菌雖然在生化反應(yīng)有所差異，但假單胞菌特征性反應(yīng)相同，且16srDNA相似度較高，對于草莓上假單胞菌的更多特性還需要進一步研究。本實驗在做陰溝腸桿菌分離時，由于阪崎腸桿菌和陰溝腸桿菌的相似性，在16srDNA鑒定中并沒有分開。陰溝腸桿菌為是腸道正常菌種之一，但可作為條件致病菌，阪崎腸桿菌為致病菌，可引發(fā)的嬰兒、早產(chǎn)兒腦膜炎、敗血癥及壞死性結(jié)腸炎，2種微生物在第二版《伯杰系統(tǒng)細菌學手冊》(2005)歸類于不同種。對阪崎腸桿菌分類起初被認為是腸桿菌科、腸桿菌屬 (Enterobacter)中陰溝腸桿菌的生物變型菌，并被命名為“黃色陰溝腸桿菌(yellow-pigmented Enterobacter cloacae)”， ATCC29544 被作為此變型種的模式菌株。Farmer 等將其收集的 57 株阪崎 腸桿菌進行 DNA 雜交、生化反應(yīng)、黃色菌落產(chǎn)物以 及抗生素敏感性等一系列實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)但是其表型和 DNA 相似性與腸桿菌屬中的陰溝腸桿菌(50 %)更加接近，由此將其歸于腸桿菌屬與黃色陰溝腸桿菌分開。2007 年 Iversen 等[6]對 210 株阪崎腸桿菌進了:包括全長 16S rRNA 基因序列 分析，熒光標記-擴增性片段長度多態(tài)性指紋圖譜 [fluorescentlabelled Amplified Fragment Length Polymorphism(f-AFLP) fingerprints]、核 糖 體 分 型 (ribotyping) 等測定，提出了阪崎腸桿菌重新分類的建議。通常2個菌株的 16S rRNA 基因全長序列相似性在 98.7 %～99 % 以上， 并且 DNA 雜交的相關(guān)性超過 70 % 時，這2個株應(yīng)為同一種，同種的2個菌株的 AFLP 圖譜相似性應(yīng) 大于 50 %[7-8]。分離的阪崎腸桿菌和陰溝腸桿菌雖在生化反應(yīng)上相似，但阪崎腸桿菌D-山梨醇反應(yīng)為陰性，且16S rRNA相近性較其它鑒定為陰溝腸桿菌的微生物較遠，本實驗也間接證明了兩種微生物在分類學上的不同地位。

3.2 微生物的附著與清洗

微生物表面存在鞭毛蛋白是附著因子[9]，幫助其附著在果蔬表面，清洗可以清除果蔬表面部分微生物，但草莓為漿果，顆粒籽鑲嵌在果實表面，較易出現(xiàn)在微觀疏水區(qū)[10-11]，微生物附著其中，達不到清洗的目的。本實驗也驗證了自來水等清洗方法對草莓表面微生物的祛除雖有一定作用，但是不能完全祛除草莓表面微生物，致軟腐微生物增殖對草莓的保鮮及食用安全帶來隱患。微生物的附著存在于生產(chǎn)和銷售的各個環(huán)節(jié)，為了最大程度減少有害微生物在植物上的傳播和增殖，建立相關(guān)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)指南是非常有必要的。除了加強草莓表面微生物的附著的研究，對草莓表面微生物的協(xié)同也拮抗，及致病能力研究也應(yīng)該得到重視。對易染且不易清洗果蔬微生物的研究可以為果蔬的食用安全保駕護航。

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(責任編輯 陳 虹)

Research on Identification, 16SrDNA Homology and Adhesion of Typical Microorganisms on Surface of Strawberry(I)

WEI Chao1, GUO Ling-an1, DAI Xiao-hang1, YANG Wen-ting2

(1.Analysis and Testing Center of Sichuan Academy of Agricultural Sciences,Sichuan Chengdu 610066,China; 2.Leshan Municipal Bureau of Agriculture,Sichuan Leshan 614000,China)

In this paper, the biochemical identification and 16SrDNA sequencing identification of the microorganisms on the surface of the sampled strawberry in three stages in the main strawberry producing areas of Sichuan for continuous two years were conducted; Maximum parsimony was adopted to conduct homology analysis for two kinds of microorganisms(PseudomonadaceaeandEnterobactercloacae) with relatively high existing possibility; And besides, the test of adhesion and cleaning of microorganisms led to the rot of strawberry was also carried out. The results showed thatSerratiaspp.，Pantoeaspp.,Sphingomonaspaucimobilisall had a comparatively high detection rate in the unripe strawberry,PseudomonadaceaeandEnterobactercloacaewere detected on the surface of strawberry sampled in all periods, in addition, they have homogy but differ at the molecular level with the difference of the picking time and maturity of strawberry.Cleaning experiment demonstrated that 10 % saline and chlorine-containing detergent could change the osmotic pressure of microorganism and effectively remove thePseudomonadaceaeandEnterobactercloacaeattached to the surface of strawberry. Through the research on microorganisms that cause the rot of strawberry, the experiment would provide protection for the safe consumption of strawberry.

Strawberry；Bacterial soft rot；Phylogenetic tree；Hazard analysis critical control

1001-4829(2016)12-2939-05

10.16213/j.cnki.scjas.2016.12.030

2016-01-10

四川省財政創(chuàng)新能力提升工程項目(2013XXXK-022)；國家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估重大專項(2016)；食生鮮果蔬病源微生物調(diào)查與產(chǎn)品安全性評估(GJFP201601302)

魏 超(1985-)，女，黑龍江人，助理研究員，主要研究微生物檢測與風險評估，Tel:15928404656。

S668.4

A