曾春暉 李先梅，2 蔡妮娜，3 譚娥玉，4 覃文慧 韋乃球 秦樹森，5 馬雯芳 楊 柯

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧，530001； 2 廣西欽州市衛(wèi)生學(xué)校，欽州，535000； 3 南寧市中醫(yī)醫(yī)院，南寧，530001； 4 江門市五邑中醫(yī)院，江門，529000； 5 桂林市婦女兒童醫(yī)院，桂林，541001)

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草酸鈣型腎結(jié)石小鼠模型的研究

曾春暉1李先梅1，2蔡妮娜1，3譚娥玉1，4覃文慧1韋乃球1秦樹森1，5馬雯芳1楊 柯1

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧，530001； 2 廣西欽州市衛(wèi)生學(xué)校，欽州，535000； 3 南寧市中醫(yī)醫(yī)院，南寧，530001； 4 江門市五邑中醫(yī)院，江門，529000； 5 桂林市婦女兒童醫(yī)院，桂林，541001)

目的：摸索簡單易行的方法誘導(dǎo)草酸鈣型腎結(jié)石小鼠模型，為后續(xù)藥效學(xué)研究提供可靠的動物模型。方法：將健康小鼠分為正常組(A組)、模型組(B組)、模型組(C組)，B組灌胃給予誘石劑(含0.75%乙二醇和0.75%氯化銨的水溶液)，C組灌胃給予誘石劑(含1%乙二醇和1%氯化銨的水溶液)，1 mL/次，3次/d，連續(xù)28 d進(jìn)行造模，A組平行灌胃給予等量生理鹽水。實驗期間觀察小鼠的進(jìn)食進(jìn)水情況，生命體征，行為活動及體毛變化，于造模后7、14、21、28 d收集24 h尿液進(jìn)行草酸和鈣含量的測定，于末次造模后處死小鼠，剖取腎臟進(jìn)行病理學(xué)觀察。結(jié)果：于造模第3天開始，B、C組小鼠均出現(xiàn)后肢無力爬行，食欲減退，體毛呈進(jìn)行性晦暗無光澤，C組小鼠的表現(xiàn)比B組小鼠嚴(yán)重；造模7 d后，模型組開始出現(xiàn)不同數(shù)量的動物死亡，且C組死亡率高于B組；B組和C組小鼠尿液中草酸、鈣濃度均明顯高于A組(P<0.01)，B組尿草酸濃度明顯高于C組(P<0.05～0.01)，而尿鈣濃度明顯低于C組(P<0.01)；病理學(xué)結(jié)果表明，A組小鼠腎小管未見擴(kuò)張和草酸鈣晶體沉積，B組、C組小鼠腎組織均出現(xiàn)腫脹，腎小管管腔明顯擴(kuò)張、變性、壞死，腎間質(zhì)有明顯慢性炎性細(xì)胞浸潤，表面點狀分布白色結(jié)晶或鈣化，在近曲小管和遠(yuǎn)曲小管有大片結(jié)晶存在，且B組的成石率比模型C組高。結(jié)論：采用0.75%乙二醇及0.75%的氯化銨混合溶液作為誘石液，可成功誘導(dǎo)死亡率低、成石率高的草酸鈣型腎結(jié)石小鼠模型。

草酸鈣型腎結(jié)石；小鼠；動物模型

尿路結(jié)石是在泌尿系統(tǒng)中形成足夠大的固體結(jié)晶，以至造成阻塞、感染等癥狀的病理礦化過程，是泌尿外科最常見的疾病之一，在泌尿外科住院患者中居首位[1]。其中以草酸鈣型結(jié)石為主的上尿路結(jié)石(即腎和輸尿管結(jié)石)約占95%，已取代膀胱結(jié)石成為了尿石癥的主要類型[2]。尿石癥實驗動物模型不但可以深入了解尿結(jié)石的形成過程和機(jī)制及尿石成因的代謝問題，而且還可以幫助篩選抗結(jié)石的中西藥物。因此，設(shè)計和建立與人類尿石癥相類似的動物模型，對于探討尿結(jié)石的發(fā)病機(jī)制，預(yù)防和延緩結(jié)石形成，尋找防治尿結(jié)石癥的藥物等方面均有重要的意義。目前，大多以大鼠為研究對象進(jìn)行模型研究[3-6]，而小鼠模型相對研究資料報道較少。因此，我們以小鼠為載體，以不同濃度的乙二醇和氯化銨為誘石劑進(jìn)行研究，現(xiàn)報道如下。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 雄性KM小鼠，由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：scxk桂2009-0002。

1.2 實驗試劑 溴百里草酚藍(lán)(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，F(xiàn)20100525)；甲基紅(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，F(xiàn)20071107)；鉻酸鉀(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，F(xiàn)20071107)；氧氯化鋯(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，F(xiàn)20080604)；鉻黑T(天津市登科化學(xué)試劑有限公司，20101015)；鈣羧酸(天津市登科化學(xué)試劑有限公司，20101125)。

1.3 實驗儀器 TU-1901/1900型紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)；EL204型電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；HM355S切片機(jī)(德國)；BX60OLYMPUS顯微鏡(日本)。

2 方法

2.1 草酸鈣型腎結(jié)石模型的建立 取18～22 g健康KM小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分成3組，即正常對照組(簡稱A組)10只，模型組15只(簡稱B組)、模型組15只(簡稱C組)。B組灌胃給予誘石劑(含0.75%乙二醇和0.75%氯化銨的水溶液)，C組灌胃給予誘石劑(含1%乙二醇和1%氯化銨的水溶液)，1 mL/次，3次/d，連續(xù)28 d進(jìn)行造模，A組平行灌胃給予等量生理鹽水。實驗期間各組小鼠自由攝食飲水。重復(fù)實驗1次。

2.2 小鼠情況觀察 每日觀察并記錄大鼠的進(jìn)食進(jìn)水情況，生命體征，行為活動及體毛變化。

2.3 取材 于造模后第7、14、21、28天將小鼠置代謝籠中接24 h尿液，對尿液中的草酸、鈣進(jìn)行測定。末次收集尿液后處死小鼠，剖取腎臟。

2.4 指標(biāo)測定

2.4.1 尿草酸測定 采用鉻酸鉀催化甲基紅光度法[17]測定。按計算公式計算尿中草酸濃度，C草酸(μmol/mL)=(空白管-樣品管)/(空白管-標(biāo)準(zhǔn)管)×0.05。

2.4.2 尿鈣測定 采用EDTA絡(luò)合滴定法[18]進(jìn)行測定。按計算公式計算尿中鈣濃度，C鈣(μmol/mL)=V樣×0.001/1000/0.5×106。

2.4.3 HE染色常規(guī)病理 制片，HE染色，鏡下觀察腎小管中草酸鈣結(jié)晶分布和腎小管擴(kuò)張的情況。

3 結(jié)果

重復(fù)實驗1次，兩次結(jié)果基本一致。

3.1 小鼠一般情況 于造模第3天開始，造模組均出現(xiàn)小鼠后肢無力爬行，食欲減退，體毛呈進(jìn)行性晦暗無光澤，C組小鼠的表現(xiàn)比B組小鼠嚴(yán)重，可能與體內(nèi)鈣的流失，導(dǎo)致骨鈣含量降低有關(guān)。造模7 d后，模型組開始出現(xiàn)不同數(shù)量的動物死亡。結(jié)果見圖1。

圖1 不同誘石劑對小鼠存活情況的影響

3.2 對尿草酸和尿鈣含量的影響 結(jié)果表明，與同期A組比較，B組和C組小鼠尿液中草酸、鈣濃度均顯著升高(P<0.01)。同時間B、C 2組相比較，B組生成的尿草酸濃度明顯比C組高(P<0.05～0.01)，而尿鈣濃度明顯比C組低(P<0.01)。結(jié)果見表1、表2。

表1 不同誘石劑對小鼠尿液中草酸含量的影響

注:與A組比較，**P<0.01，*P<0.05；與B組比較，##P<0.01，#P<0.05，下同。

表2 不同誘石劑對小鼠尿液中鈣含量的影響

3.3 對腎臟結(jié)石及組織損傷的觀察 草酸鈣結(jié)晶在常規(guī)HE病理切片為無色透明晶體，結(jié)果表明，A組小鼠腎小管未見擴(kuò)張和草酸鈣晶體沉積，B組、C組小鼠腎組織腫脹，表面點狀分布白色結(jié)晶或鈣化，鏡下觀察見腎小管管腔明顯擴(kuò)張，上皮細(xì)胞明顯腫脹、變性、壞死、管腔擴(kuò)張，腎間質(zhì)有明顯慢性炎性細(xì)胞浸潤。有大片結(jié)晶存在，結(jié)晶主要位于近曲小管和遠(yuǎn)曲小管，且B組的成石率比模型C組高。結(jié)果見圖2。

圖2 不同誘石劑對腎臟結(jié)石及組織的損傷的影響

4 討論

目前動物模型的建立模式是在誘石劑[6]如乙二醇加氯化銨或乙二醇加1α(OH)維生素D3的作用下，誘導(dǎo)生成含草酸鈣結(jié)石。乙二醇在體內(nèi)代謝為草酸，從腎臟分泌排泄。1α(OH)維生素D3可促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞對鈣的吸收，長期應(yīng)用1α(OH)維生素D3可使尿鈣濃度升高，尿鈣與草酸結(jié)合成為草酸鈣，在腎組織內(nèi)形成晶體，晶體逐漸生長、聚集形成結(jié)石。氯化銨可以酸化尿液，長期服用可造成腎小管功能障礙，許多研究表明腎小管損害利于晶體滯留和生長[7]。因此本研究采用乙二醇及氯化銨的混合溶液作為誘石劑。2個濃度下的混合溶液均能促進(jìn)尿草酸、尿鈣的升高，病切結(jié)果顯示腎臟有晶體沉積。但1.0%乙二醇及1.0%的氯化銨混合溶液作為誘石液時，小鼠出現(xiàn)無力爬行，死亡率較高，且晶體量少，這有可能是與氯化銨濃度高，對腎小管損傷大，導(dǎo)致鈣離子流失過多有關(guān)，且該誘石劑在造模過程中動物死亡率較高，成石率較低，故認(rèn)為0.75%乙二醇及0.75%的氯化銨混合溶液更合適作為誘石液誘導(dǎo)草酸鈣型腎結(jié)石小鼠模型。

[1]吳階平.泌尿外科學(xué)[M].濟(jì)南:山東科學(xué)技術(shù)出版社,2005.

[2]Breslau N，Brinkely L，Hill K，et al.Relationship of animal protein-rich diet to kidney stone formation and calcium metabolism[J].J Clin Endocrinol Metab，1988，66(1)：140-146.

[3]巴元明,曹秋實.兩種草酸鈣結(jié)石大鼠模型的比較研究[J].上海交通大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版,2014,34(11):1595-1598.

[4]黃幼霞.乙二醇和氯化銨灌胃建立大鼠腎草酸鈣結(jié)石模型的探討[J].海峽藥學(xué),2014,26(1):48-49.

[5]甘澍,王樹聲,向松濤,等.改良大鼠腎草酸鈣結(jié)石模型與傳統(tǒng)模型的比較[J].中國中醫(yī)急癥,2010,19(6):1004-1006.

[6]曹正國,劉繼紅,段永芳,等.幾種實驗性大鼠腎草酸鈣結(jié)石模型的比較研究[J].華中科技大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版,2002,31(5):556-559+563.

[7]Kumar S,SigmonD,Miller T et al.A new model of nephrolithiasis involving tubular dysfunction/injury[J].J Urol,1991,146:1384.

(2016-10-17收稿 責(zé)任編輯：洪志強(qiáng))

Study of Calcium Oxalate Crystallization Model in Mice

Zeng Chunhui1, Li Xianmei1,2, Cai Nina1,3, Tan Eyu1,4, Qin Wenhui1, Wei Naiqiu1, Qin Shusen1,5, Ma Wenfang1, Yang Ke1

(1GuangxiUniversityofChineseMedicine,Nanning530001,China;2QinzhouProvincialHealthSchool,Qinzhou535000,China;3NanningHospitalofTraditionalChineseMedicine,Nanning530001,China;4WuyiHospitalofTraditionalChineseMedicine,Jiangmen529000,China;5GuilinWomen′sandChildren′sHospital,Guilin541001,China)

Objective:To explore a method of establishing mice model with calcium-oxalate kidney stones so as to provide the reliable animal models for follow-up study on pharmacodynamics. Methods: Mice were divided to normal group (A group), model group (B group) and model group (C group) randomly. 0.75% ethylene glycol and 0.75% ammonia chloride mixture were administrated orally1 mL/time and 3 times/day to B group mice for 28 consecutive days. 1% ethylene glycol and 1% ammonia chloride mixture were administrated orally to C group mice as well as B group. The same volume of normal saline was administered in parallel to A group. Food and water intake, vital signs, behavior and change of hair were observed in experiment. 24 h urine of mouse was collected for detecting concentration of oxalic acid and calcium at 7, 14, 21, 28 days after modeling. All of mice were sacrificed at the last time, and took the kidney to carry out pathological observation. Results: The phenomenon of inability to crawl on the hind legs, loss of appetite and the dull hair were observed in B and C group mice after modeling 3 days. The situation of C group was more serious than B group. The model animals began to die after modeling 7 days and the mortality rate of C group was higher than that of group B. The concentration of oxalic acid and calcium in urine of B group or C group were more than A group (P<0.01). The concentration of oxalic acid in B group was significantly higher than that in C group(P<0.05～0.01), but the calcium concentration was significantly lower than that of the C group(P<0.01). No abnormalities and Calcium oxalate crystal were found in the kidney of A group mice. In B and C groups, the renal tissues of mice were swollen. The renal tubular lumen showed obvious expansion, degeneration necrosis and there was obvious chronic inflammatory cell infiltration in renal interstitial. The surface of the kidney is dotted with white crystals or calcification. There are large tracts of crystal in the proximal and distal tubules and Number of crystals in B group was more than that in C group. Conclusion: It was found that 0.75% ethylene glycol and 0.75% ammonia chloride mixture can be successfully induced low mortality, high stone rate of calcium oxalate kidney stones in mice.

Calcium oxalate crystallization kidney stone; Mouse; Animal Model

國家自然科學(xué)基金項目(編號：81260667)；廣西科技廳面上項目(編號：2011GXNSFA018204)；廣西衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科技專項課題(編號：GZKZ10-050)；廣西重點實驗室建設(shè)項目(編號：15-140-31、14-045-12、13-051-06)；廣西農(nóng)作物廢棄物功能成分研究協(xié)同創(chuàng)新中心建設(shè)(編號：CICAR2015-Z1)

曾春暉(1974—)，女，漢族，教授，博士，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事中草藥炮制藥理研究，Tel：(0771)2279423，E-mail：chhzeng@163.com

楊柯(1975—)，男,侗族，教授，理學(xué)碩士，碩士研究生導(dǎo)師，從事中草藥藥理學(xué)研究，Tel：(0771)2279423，E-mail：kyang_11@126.com

R36

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.11.002