林 燕 李文靜 常孟然 趙程博文

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京，100029)

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實驗研究

益氣解毒方對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠線粒體結(jié)構(gòu)與炎性反應(yīng)因子的相關(guān)性影響

林 燕 李文靜 常孟然 趙程博文

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京，100029)

目的：觀察潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative Colitis，UC)大鼠結(jié)腸線粒體結(jié)構(gòu)損傷與炎性反應(yīng)因子表達之間的相關(guān)性，分析益氣解毒方在UC急、慢性期2個時期的臨床療效，探討益氣解毒方對不同時期的結(jié)腸炎性反應(yīng)因子與線粒體結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)作用。方法：采用家兔結(jié)腸黏膜組織致敏加TNBS-乙醇灌腸的免疫復(fù)合法造模，將100只Wistar大鼠隨機分成正常組、模型組、益氣解毒組和美沙拉嗪組，分別于造模后第1天、給藥后第2周末、給藥后第6周末3個時間點取材，觀察電鏡下大鼠結(jié)腸黏膜上皮細胞的超微結(jié)構(gòu)，進行結(jié)腸線粒體Flameng評分，采用免疫組織化學(xué)法測定結(jié)腸黏膜TNF-α、ICAM-1的表達水平。結(jié)果：大鼠結(jié)腸黏膜細胞超微結(jié)構(gòu)的損傷持續(xù)存在于UC急性期與慢性期的整個病程中，線粒體的損傷更為嚴重持久。結(jié)腸黏膜的TNF-α、ICAM-1表達顯著升高，隨著病情的進展這2個指標均有所下降，但至慢性期仍然顯著高于正常對照組。UC整個病變過程中，線粒體的損傷與結(jié)腸黏膜TNF-α的表達基本同步。美沙拉嗪對急性期線粒體有一定的修復(fù)作用，但遠期療效不佳，慢性期其線粒體結(jié)構(gòu)恢復(fù)不明顯。益氣解毒方可持續(xù)修復(fù)受損的線粒體，效果明顯優(yōu)于美沙拉嗪，至慢性期線粒體結(jié)構(gòu)基本接近正常水平。在調(diào)節(jié)TNF-α、ICAM-1方面，急性期美沙拉嗪下調(diào)的幅度要大于益氣解毒方。至慢性期益氣解毒方后來居上，其下調(diào)幅度明顯大于美沙拉嗪，更接近正常值。結(jié)論：慢性期線粒體結(jié)構(gòu)損傷與炎性反應(yīng)因子TNF-α的持續(xù)高表達具有相關(guān)性，可能是引起UC復(fù)發(fā)與結(jié)腸黏膜損傷的潛在因素。美沙拉嗪可快速地控制炎性反應(yīng)的急性發(fā)作，益氣解毒方則對持續(xù)的慢性炎性反應(yīng)有更好的抑制作用，特別是能夠持續(xù)修復(fù)受損的線粒體，對慢性期抗復(fù)發(fā)更具療效與優(yōu)勢。

益氣解毒方；潰瘍性結(jié)腸炎；線粒體結(jié)構(gòu)；炎性反應(yīng)因子；相關(guān)性

潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative Colitis，UC)是以結(jié)腸黏膜潰瘍和慢性炎性反應(yīng)為主要病理特點的自身免疫性疾病，在我國的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。因其病因復(fù)雜，易反復(fù)發(fā)作，治愈難度大，與結(jié)腸癌關(guān)系密切，被世界衛(wèi)生組織稱為難治性疾病。因此，探索UC的發(fā)病機制，提高治愈率，降低復(fù)發(fā)率成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究的重要課題。中醫(yī)學(xué)在整體觀與辨證論治指導(dǎo)下，辨病與辨證相結(jié)合治療本病，近年來取得較好的療效，尤其在提高治愈率、降低復(fù)發(fā)率方面顯示出獨特的優(yōu)勢。本研究從炎性反應(yīng)因子與線粒體損傷的關(guān)系出發(fā)，觀察UC大鼠結(jié)腸線粒體結(jié)構(gòu)損傷與炎性反應(yīng)因子表達之間的相關(guān)性，比較益氣解毒方在UC急性期與慢性期2個時期的臨床療效和療效特點，探討益氣解毒方對不同時期的結(jié)腸炎性反應(yīng)因子與線粒體結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)作用，以尋求抗復(fù)發(fā)的突破口。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級健康Wistar大鼠100只，雄性，體重180～200 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號：SCXK(京)2012-0001。清潔級健康大耳白家兔10只，體重約2 kg，由北京海淀區(qū)興隆實驗動物養(yǎng)殖廠提供，動物許可證號：SCXK(京)2011-0006。

1.2 主要試劑 三硝基苯磺酸(TNBS)(Sigma公司)，完全弗氏佐劑(Sigma公司)，BCA蛋白定量試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，3.5%水合氯醛溶液，4%多聚甲醛溶液，4%戊二醛磷酸緩沖液，1%鋨酸固定液，丙酮，無水乙醇，二甲苯，生理鹽水等。

1.3 試藥 益氣解毒方：生黃芪30 g、茯苓15 g、黃連10 g、連翹15 g、蒲公英20 g、當(dāng)歸10 g、木香10 g、焦三仙各10 g、炙甘草6 g，購于北京同仁堂藥店。美沙拉嗪腸溶片：0.25×24片/盒，由葵花藥業(yè)集團佳木斯鹿靈制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批準文號為國藥準字H19980148。

1.4 實驗儀器 Shandon全自動石蠟包埋機，Shandon全自動石蠟切片機，Olympus Vanox顯微鏡，Nikon顯微照相系統(tǒng)，透射電子顯微鏡(日立H7650)，離心機(北京醫(yī)用離心機廠生產(chǎn))。

1.5 方法

1.5.1 造模方法 采用家兔結(jié)腸黏膜組織致敏加TNBS-乙醇灌腸的免疫復(fù)合法制備大鼠UC模型[1-2]。1.5.2 造模原理 免疫復(fù)合法，先利用家兔結(jié)腸黏膜蛋白異體抗原刺激，使實驗大鼠腸道菌群失調(diào)，腸腔內(nèi)致病菌和條件致病菌增多，增加腸黏膜通透性，導(dǎo)致腸腔內(nèi)細菌及細菌產(chǎn)物向黏膜固有層移位，引起免疫細胞的激活及炎性反應(yīng)。再用化學(xué)誘導(dǎo)，TNBS是一種半抗原物質(zhì)，乙醇作為有機溶劑溶解腸黏膜表面的粘液，破壞腸黏膜屏障，使TNBS與腸組織大分子組織蛋白結(jié)合后成為完全抗原，導(dǎo)致針對腸黏膜的免疫反應(yīng)，從而誘導(dǎo)UC的發(fā)生。這種造模方法的原理與UC的發(fā)病機制是基本相符的，且模型病變持續(xù)時間長，能夠完整地體現(xiàn)出UC急慢性不同時期的病理變化，符合本研究要求。

1.5.3 操作方法 空氣栓塞法處死家兔后，將家兔備皮，剖開，取出結(jié)腸，將結(jié)腸剪成5 cm左右的一段，擠出腸中糞便后將結(jié)腸縱剖開，用自來水沖洗干凈，再分別用蒸餾水和生理鹽水沖洗。將培養(yǎng)皿放置在鋪滿冰的搪瓷盤上，把結(jié)腸平鋪在培養(yǎng)皿上，用刀片刮取結(jié)腸黏膜。將刮取的結(jié)腸黏膜低溫勻漿，離心(4 ℃，3 500 r/min，30 min)，取上清液BCA法測定上清液中蛋白含量。將上清液與等體積完全弗氏佐劑混合制成抗原乳化液(每次注射前現(xiàn)用現(xiàn)配，用2只玻璃注射器相互抽打1 h混勻)。分別于大鼠飼養(yǎng)的第1 d、14 d、21 d在其足趾、腹股溝等部位皮下注射抗原乳化液(每次每只大鼠注射含有8 mg蛋白的抗原乳化液)。第28 d將禁食36 h的大鼠用3.5%水合氯醛(每100 g體重注射1 mL)腹腔麻醉，將一直徑2 mm、長約12 cm的橡膠管輕緩插入大鼠肛門，深約8～10 cm，以三硝基苯磺酸灌腸(將TNBS配成120 mg/mL的溶液后與等體積50%乙醇溶液混合，每千克體重大鼠注射含120 mgTNBS的溶液)，灌腸后將大鼠倒置2 min后放回籠內(nèi)。

1.5.4 分組設(shè)計與給藥 100只wistar大鼠隨機分成正常組、模型組、益氣解毒組和美沙拉嗪組，其中正常組和模型組每組各30只，益氣解毒組和美沙拉嗪組每組各20只。造模成功后自第2天開始，正常組、模型組每日用潔凈水灌胃1次(1 mL/100 g)；益氣解毒組每日以益氣解毒方(生藥量1.55 g/mL)灌胃1次(1 mL/100 g)；美沙拉嗪組每日以美沙拉嗪腸溶片混懸液(0.0234 g/mL)灌胃1次(1 mL/100 g)。持續(xù)給藥6周。

1.5.5 取材及指標觀察

1.5.5.1 大鼠結(jié)腸線粒體Flameng評分 冰上操作，快速切取3～5塊1 mm3病變結(jié)腸組織，浸于4%戊二醛磷酸緩沖液，4 ℃保存。制作電鏡標本，透射電鏡觀察大鼠結(jié)腸黏膜上皮細胞的超微結(jié)構(gòu)。采用Flameng評分法評價線粒體超微結(jié)構(gòu)的改變[3]，每組隨機選取一個標本，每個標本隨機選擇5個視野，每個視野隨機選擇20個線粒體(共100個)，每個線粒體按照其超微結(jié)構(gòu)改變程度評分。見表1。

表1 Flameng評分

1.5.5.2 結(jié)腸黏膜TNF-α、ICAM-1表達 斷頭處死大鼠，從肛門向上取8～10 cm的結(jié)腸組織，沿腸系膜縱行剖開，4 ℃生理鹽水清洗去除腸內(nèi)容物，肉眼觀察結(jié)腸黏膜大體形態(tài)。取病變部位1～2 cm放入4%多聚甲醛溶液中固定48 h，標本脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后6 μm厚切片。用HE染色方法觀察結(jié)腸病理形態(tài)學(xué)改變；用免疫組織化學(xué)法測定結(jié)腸黏膜TNF-α、ICAM-1的表達水平。

2 結(jié)果

2.1 大鼠結(jié)腸線粒體Flameng評分 見表2。

2.2 大鼠結(jié)腸組織TNF-α、ICAM-1表達的比較 光鏡下可見TNF-α、ICAM-1表達的陽性細胞，其包漿為棕黃色著色，背景為淡黃色，每組選擇6個切片，每個切片隨機檢測5個染色較好的高倍視野，運用IPP圖像分析軟件計算每個視野的陽性表達量，5個視野的均數(shù)即代表該樣本的陽性表達量，值越高，提示表達越強。見表3、表4。

表2 大鼠線粒體Flameng評分結(jié)果

注：與同時期正常組比較：*P<0.05，**P<0.01；與同時期模型組比較：△△P<0.01；與同時期美沙拉嗪組比較：▲P<0.05；與同組不同時期比較：□□P<0.01。

表3 大鼠結(jié)腸組織TNF-α表達的比較

注：與同時期正常組比較：*P<0.05，**P<0.01；與同時期模型組比較：△P<0.05，△△P<0.01；與同時期美沙拉嗪組比較：□P<0.05；與同組不同時期比較■P<0.05，■■P<0.01。

表4 大鼠結(jié)腸組織ICAM-1表達的比較

注：與同時期正常組比較：*P<0.05，**P<0.01；與同時期模型組比較：△P<0.05，△△P<0.01；與同組不同時期比較▲P<0.05，▲▲P<0.01。

3 討論

UC以直腸與結(jié)腸黏膜的慢性炎性反應(yīng)和潰瘍形成為主要病理特點，結(jié)腸黏膜損傷是其病理基礎(chǔ)。在UC的復(fù)雜病理機制中，不論是腸道的原發(fā)性病變還是繼發(fā)性損害，均會造成結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)和功能的損傷。也就是說，無論何種復(fù)雜的病理反應(yīng)，最終所導(dǎo)致的都是結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)的破壞和功能的障礙。線粒體是一種將物質(zhì)代謝、能量代謝和遺傳變異三大基本生命活動形式融于一體的半自主性細胞器，也是細胞內(nèi)進行呼吸和能量轉(zhuǎn)換的場所，即進行生物氧化、維持細胞生命的“能源供應(yīng)站”，它的變化可以作為細胞超微結(jié)構(gòu)變化的指征[4]。由此推測，UC結(jié)腸黏膜的這種損害與線粒體的異常有著必然聯(lián)系，UC存在線粒體結(jié)構(gòu)、功能的異常，而線粒體能量代謝的異常與脾虛的關(guān)系更為密切[5]。

UC的病因和發(fā)病機制迄今仍不十分清楚。有證據(jù)顯示其涉及免疫、遺傳、環(huán)境、感染、精神及過敏等多方面因素，其中免疫損傷機制在UC發(fā)病中的重要作用已得到公認[6-7]。TNF-α是介導(dǎo)腸上皮增殖和凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，也是參與腸道炎性反應(yīng)起始與持續(xù)的重要炎性反應(yīng)遞質(zhì)，被公認為介導(dǎo)UC的細胞因子[8-9]。黏附分子ICAM-1在炎性反應(yīng)細胞的浸潤、腸組織炎性反應(yīng)形成中起著重要作用，其表達和分布的明顯增加，與炎性反應(yīng)嚴重程度密切相關(guān)[10-12]。因此，探討結(jié)腸黏膜TNF-α、ICAM-1表達與線粒體損傷的關(guān)系，對UC的藥物療效、作用機制及預(yù)后判定有著重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠結(jié)腸黏膜細胞超微結(jié)構(gòu)的損傷持續(xù)存在于UC急、慢性期的整個病程中，線粒體的損傷更為嚴重持久。結(jié)腸黏膜的TNF-α、ICAM-1表達顯著升高，隨著病情的進展這2個指標均有所下降，但至慢性期仍然顯著高于正常對照組。TNF-α、ICAM-1兩者之間，至慢性期ICAM-1的降幅更顯著。尤為重要的是，在UC整個病變過程中，線粒體的損傷與結(jié)腸黏膜TNF-α的表達基本同步。以上提示慢性期線粒體結(jié)構(gòu)異常與炎性反應(yīng)因子TNF-α的持續(xù)高表達具有相關(guān)性，可能是引起UC復(fù)發(fā)與結(jié)腸黏膜損傷的潛在因素。

根據(jù)UC慢性復(fù)發(fā)型的發(fā)病規(guī)律和活動期與緩解期交替出現(xiàn)的病程變化以及其證候?qū)W特征，我們將其歸為中醫(yī)痢疾之“休息痢”，認為UC因素體脾虛，受到外邪、飲食、情志等因素的影響而發(fā)病?；顒悠诘闹饕R床表現(xiàn)是黏液膿血便，腸黏膜充血水腫、糜爛潰瘍是主要病理改變，由于正氣不足，不能徹底清除毒邪，導(dǎo)致UC病變呈慢性經(jīng)過、持續(xù)發(fā)展，盡管潰瘍可在一定程度上自愈，黏液膿血便減輕，由急性炎性反應(yīng)轉(zhuǎn)為慢性炎性反應(yīng)，但脾虛難復(fù)，毒邪潛伏，久病及腎，致脾腎兩虛。若此時又受到感染、環(huán)境、情志、飲食等因素的刺激，則會再次觸發(fā)免疫反應(yīng)，形成急性炎性反應(yīng)，導(dǎo)致UC復(fù)發(fā)?？梢娖⑻撆c毒邪貫穿UC的始終，是主要矛盾，也是導(dǎo)致UC發(fā)生、發(fā)展和復(fù)發(fā)的關(guān)鍵[13-15]。因此，治療的重點是益氣健脾，恢復(fù)脾運，祛除毒邪，兼以行氣活血、生肌消癰。益氣解毒方在此基礎(chǔ)上經(jīng)過長期臨床實踐總結(jié)而來。

本研究發(fā)現(xiàn)，益氣解毒方和美沙拉嗪均可在一定程度上修復(fù)受損的線粒體。美沙拉嗪對急性期線粒體有一定的修復(fù)作用，但遠期療效不佳，慢性期其線粒體結(jié)構(gòu)恢復(fù)不明顯。益氣解毒方可持續(xù)修復(fù)受損的線粒體，療效優(yōu)于美沙拉嗪，至慢性期尤為明顯，線粒體結(jié)構(gòu)基本接近正常水平。在調(diào)節(jié)TNF-α、ICAM-1方面，急性期美沙拉嗪可迅速下調(diào)兩指標，益氣解毒方也能達到下調(diào)指標的作用，但美沙拉嗪下調(diào)的幅度要大于益氣解毒方。慢性期，美沙拉嗪和益氣解毒方均可使兩指標水平持續(xù)下調(diào)，但美沙拉嗪的下調(diào)幅度趨緩，益氣解毒方后來居上，其下調(diào)幅度增大超過美沙拉嗪，兩指標數(shù)值更接近正常值。

由此可見，美沙拉嗪可快速地控制炎性反應(yīng)的急性發(fā)作，益氣解毒方則對持續(xù)的慢性炎性反應(yīng)有更好的抑制作用，特別能夠持續(xù)修復(fù)受損的線粒體，對慢性期抗復(fù)發(fā)更具療效與優(yōu)勢。這可能是由于益氣解毒方對線粒體起到了更好的修復(fù)和保護作用，使細胞的動力站得到保護，則趨使腸上皮細胞修復(fù)，發(fā)揮腸道屏障防御作用，阻斷各種毒素的入侵，下調(diào)炎性反應(yīng)因子表達，恢復(fù)正常的免疫功能。

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(2015-09-21收稿 責(zé)任編輯：張文婷)

Relevant Effects of Yiqi Jiedu Formula on Mitochondrial Structure and Inflammatory Factor of Ulcerative Colitis Rat

Lin Yan，Li Wenjing，Chang Mengran，Zhao Chengbowen

(SchoolofBasicMedicalScience，BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100029，China)

Objective:To observe the relativity of mitochondrial structure damage and the express of inflammatory factor in UC rats，to analysis the curative effect of Yiqi Jiedu formula(Qi-tonifying and toxicity-relieving formula)in acute and chronic phase，and to discuss the regulatory mechanism of Yiqi Jiedu formula in inflammatory factors and mitochondrial structure in different phases.Methods:The experimental rat models with ulcerative colitis were set up by immune complex method(sensitization with rabbit mucous membrane of colon and coloclystering with TNBS and 50% alcohol).One hundred rats were randomly divided into the normal group，model group，Yiqi Jiedu group and mesalasize group.Colon samples were taken from the four groups at the 1 st day，14th day and 56th day respectively of and the ultra-microstructure of rat colonic mucosal epithelial cells were observed under electron microscope.The colon mitochondria with Flameng score system were graded and the expressing level of TNF-α and ICAM-1 in mucous membrane of colon were tested by immunohistochemical method.Results:The damage of ultra-microstructure in mucous membrane of colon cells existed in the whole UC process，especially the mitochondria was more lasting and serious.The expresses of TNF-α and ICAM-1 in colonic mucosa increased obviously and descended with the progression，but both of which are higher than those of the normal group in chronic phase.The damage of the mitochondria mainly synchronizes with the express of TNF-α in colonic mucosa in the whole progression of UC.To some extent，mesalazine had some repairing effects in acute phase，but poor efficacy in chronic phase，no apparent recovery of mitochondria in chronic phase.In the respects of regulating TNF-α and ICAM-1，the decline rate by mesalazine in acute phase was significantly over Yiqi Jiedu formula.While in chronic phase，Yiqi Jiedu formula overtook mesalazine，with the decline rate over mesalazine，which was closer to normal level.Conclusion:The damage of mitochondrial structure in chronic phase may correlate with the lasting high express of inflammatory factor，and which maybe the potential cause to palindromia and the damage of colonic mucosa.Mesalazine may rapidly control the acute exacerbation of inflammation，while the Yiqi Jiedu formula is better in controlling the lasting chronic inflammation，especially in lastingly repairing the damaged mitochondria.It shows great superiorities in anti-palindromia in chronic phase.

Yiqi Jiedu formula； Ulcerative colitis； Mitochondrial structure； Inflammatory factor； Relativity

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目(編號：81202682)

林燕(1977.02—)，女，醫(yī)學(xué)博士，副教授，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：消化疾病的中醫(yī)藥治療，E-mail：yanlin77211@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.11.041