■ 左然濤 呂德亮 吳反修 張叢堯 李 廣 李 敏 郝振林 常亞青*

(1.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連，116023；2.全國(guó)水產(chǎn)技術(shù)推廣總站中國(guó)水產(chǎn)學(xué)會(huì)，北京100122)

刺參(Apostichopus japonicus)是我國(guó)遼寧、山東、福建、河北等沿海地區(qū)重要的海水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖品種，總產(chǎn)量已突破18萬噸，產(chǎn)值超過300億元人民幣。目前，刺參營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究主要集中于稚參和幼參階段[1-6]，成參階段營(yíng)養(yǎng)飼料的研究較少，而有關(guān)飼料脂肪酸調(diào)控刺參營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的研究更是未見報(bào)道。

二十碳四烯酸（ARA，C20∶4n-6）在人體生長(zhǎng)、發(fā)育、免疫、生殖過程中發(fā)揮著重要作用[7]，具有富集二十碳四烯酸（ARA，C20∶4n-6）和二十碳五烯酸（EPA，C20∶5n-3）能力的被認(rèn)為是海洋棘皮動(dòng)物的一個(gè)重要特征。已有研究表明，我國(guó)北方地區(qū)自然攝食條件下的刺參成參體壁ARA含量會(huì)隨季節(jié)發(fā)生規(guī)律性變化，其中在1月份最高可達(dá)到總脂肪酸的8.16%，之后隨著性腺發(fā)育含量逐漸降低，并在6月份產(chǎn)卵后降至最低，約為總脂肪酸的4.88%[8]。當(dāng)水溫升高至20～25℃，刺參成參進(jìn)入“夏眠”，在此期間刺參腸道退化，直到9月份水溫降至20℃才開始重新攝食[9]。由于我國(guó)北方地區(qū)11月份開始秋季刺參的采捕，從9月到11月這段時(shí)期的餌料供應(yīng)量及其營(yíng)養(yǎng)組成顯得尤為重要，因?yàn)檫@將直接影響秋參體壁的厚度及營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。因此，本研究以刺參成參為研究對(duì)象，探討飼料中添加ARA對(duì)刺參成參生長(zhǎng)和體壁營(yíng)養(yǎng)成分的影響，以期為“夏眠”結(jié)束后刺參體壁營(yíng)養(yǎng)成分的快速恢復(fù)提供營(yíng)養(yǎng)調(diào)控策略。

1 材料方法

1.1 試驗(yàn)飼料

以鼠尾藻粉和豆粕為主要蛋白源，以小麥粉為主要糖源，通過梯度添加ARA粉劑配制等氮（22%）、等脂（2.5%）的四種試驗(yàn)飼料，使飼料中ARA實(shí)測(cè)的含量依次為0.0%、0.4%、0.8%、1.6%（見表1及表2）。所有粉狀原料粉碎過100目篩，并按照配比將飼料干粉進(jìn)行充分混合。隨后，向混合均勻的原料中添加30%自來水并利用混勻機(jī)充分混合均勻。利用單螺桿擠條機(jī)首先將飼料制作成條狀（500 mm×1.2 mm），并放置于40℃烘箱烘干，冷卻后用破碎機(jī)破碎并篩分，取粒徑為40～60目的飼料用雙層塑料袋包裝，儲(chǔ)存于陰涼干燥處備用。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

本試驗(yàn)所需的刺參成參購(gòu)自大連市普蘭店某養(yǎng)殖場(chǎng)，為同一批孵化的海參苗生長(zhǎng)而成。試驗(yàn)開始前將刺參放置于1 000 L的水槽中暫養(yǎng)，每天換水和投喂配合飼料1次（17:00），換水比例為總體積的50%。經(jīng)過2周馴化，將大小均勻、健康無病的刺參成參[初始體重：(73.49±1.26)g]分養(yǎng)至12個(gè)水槽（100 L）中，每個(gè)水槽投放20頭刺參。

1.3 養(yǎng)殖管理

試驗(yàn)在大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，試驗(yàn)周期為121 d。試驗(yàn)期間，每天換水一次，換水比例為玻璃鋼水槽容積的50%。換水時(shí)吸底，以清除水槽底部的殘餌和糞便，每次換水后投喂配合飼料（17:00）。試驗(yàn)期間，溶氧＞5 mg/l，水溫保持在(12±2)℃，鹽度為28～30。攝食生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，將每個(gè)水槽5頭刺參的體壁收集于自封袋中，儲(chǔ)存于-20℃冰箱中備用。

表1 飼料配方(g/100 g干物質(zhì))

表2 不同飼料脂肪酸組成（g/kg）

1.4 生化分析

蛋白質(zhì)測(cè)定采用凱式定氮法，脂肪測(cè)定采用索式抽提法。

脂肪酸測(cè)定采用ThermoFisher Trace 1310 IS氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，色譜柱為TG-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。取80～100 mg樣品加入到15 ml離心管中，繼續(xù)加入2 ml 5%鹽酸甲醇溶液，3 ml氯仿甲醇溶液（體積比1∶1），100 μl十九烷酸甲酯內(nèi)標(biāo)。于85℃水浴鍋中水浴1 h。水浴完成后，等溫度降至室溫后，在離心管中加入1 ml正己烷，振蕩萃取2 min后，靜置1 h。取上層清液100 μl，用正己烷定容到1 ml，用0.45 μm濾膜過濾后上機(jī)測(cè)試。進(jìn)樣口溫度為290℃，色譜柱升溫程序?yàn)?0℃保持1 min，以10℃/min的速率升溫至200℃，繼續(xù)以5℃/min的速率升溫至250℃，最后以2℃/min的速率升到270℃，保持3 min。脂肪酸含量表示為g/kg的形式。

氨基酸測(cè)定利用ThermoFisher U3000液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。取一定量的樣品于20 ml的水接管中，加入16 ml 6 mol/l的鹽酸溶液，真空脫氣30 min，充氮封管，在110℃下水解22～24 h，取出，冷卻后打開水解管，用去離子水無損轉(zhuǎn)移到50 ml容量瓶中定容。準(zhǔn)確取1 ml水解液于小瓶中，真空脫酸抽干，加1 ml水再抽干，再加1 ml水抽干備用。準(zhǔn)確加入1 ml 0.02 mol/l的鹽酸溶液，充分溶解。精密量取上述溶液500 μl，置于5 ml塑料離心管中，精密加入1 mol/l三乙胺乙腈溶液 250 μl，混勻，精密加入 0.1 mol/l異硫氰酸苯酯乙腈溶液25 μl，混勻后室溫放置1 h，加2 ml正己烷，劇烈振搖，放置10 min，取下層溶液用0.22 μm的水相膜過濾后上機(jī)分析。氨基酸含量表示為g/kg的形式。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，在單因素方差分析達(dá)到顯著水平時(shí)（P＜0.05），采用Tur?key's檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較，數(shù)據(jù)表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”的形式。

2 結(jié)果

2.1 飼料中ARA含量對(duì)刺參生長(zhǎng)速率、出皮率和常規(guī)營(yíng)養(yǎng)組成的影響（見表3）

表3 不同飼料ARA含量對(duì)刺參成參生長(zhǎng)速率、出皮率和常規(guī)營(yíng)養(yǎng)組成的影響

隨著飼料中ARA含量的增加，刺參增重率呈先升高后下降的趨勢(shì)，并在ARA含量為0.8%時(shí)具有最大值（67.21%），顯著高于對(duì)照組（27.45%）。隨著飼料中ARA含量的增加，刺參出皮率具有先升高后下降的趨勢(shì)，當(dāng)ARA添加量為0.8%時(shí)，刺參出皮率最高（65.57%），之后隨著ARA含量的進(jìn)一步升高降低至60.09%。隨著飼料中ARA含量的增加，刺參體壁脂肪含量顯著升高（P＜0.05），且ARA添加量為0.4%～1.6%時(shí)刺參體壁脂肪沉積量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。隨著飼料中ARA含量的增加，刺參體壁中粗蛋白質(zhì)含量在4.03%～4.27%，但各處理組之間差異均不顯著（P＞0.05）。

2.2 飼料中ARA含量對(duì)刺參體壁脂肪酸組成的影響（見表4）

隨著飼料中ARA含量的升高，刺參體壁中ARA沉積量顯著升高，且在ARA-1.6處理組具有最高值（0.51 g/kg濕重），顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。體壁中ARA/EPA隨著飼料中ARA含量的升高由1.04顯著升高至2.55，DHA/EPA由0.17顯著升至0.30，而體n-3/n-6 PUFA由0.93顯著降至0.44（P＜0.05）。

隨著飼料中ARA含量的升高，刺參體壁中EPA和DHA含量在各處理組間均無顯著性差異，其中EPA含量在0.20～0.24 g/kg濕重，DHA含量在0.04～0.07g/kg濕重（P＞0.05）。

2.3 飼料中ARA含量對(duì)刺參體壁氨基酸組成的影響（見表5）

與對(duì)照組相比，飼料中添加ARA均不同程度提高了酪氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸等必需氨基酸在刺參體壁中的沉積量。其中，當(dāng)飼料中ARA含量由0.0%升高至0.8%時(shí)，刺參體壁中苯丙氨酸和賴氨酸的沉積量分別由1.26 g/kg和1.48 g/kg顯著升高至1.49 g/kg和1.83 g/kg（P＜0.05），之后隨著飼料中ARA含量的進(jìn)一步升高降至1.46 g/kg和1.67 g/kg（P＞0.05）。

表4 飼料中ARA含量對(duì)刺參成參體壁脂肪酸含量的影響（g/kg濕重）

表5 飼料中ARA含量對(duì)刺參成參體壁氨基酸含量的影響（g/kg濕重）

隨著飼料中ARA含量的升高，刺參體壁非必需氨基酸含量具有下降的趨勢(shì)，但各處理組之間差異不顯著（P＞0.05）（見表5）。

3 討論

3.1 飼料中ARA對(duì)刺參生長(zhǎng)速率的影響

本研究中，刺參成參的生長(zhǎng)速率隨著飼料中ARA含量的升高具有先升高后下降的趨勢(shì)。以增重率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，刺參成參飼料中ARA的最適添加量為0.8%飼料干重。這與鱸魚和大黃魚中的研究結(jié)果類似，Xu等[10]發(fā)現(xiàn)鱸魚幼魚對(duì)ARA的需求量為0.22%～0.56%飼料干重，謝奉軍[11]發(fā)現(xiàn)大黃魚仔稚魚對(duì)ARA的需求量為0.93%飼料干重，一般來說，隨著動(dòng)物的生長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)需求會(huì)適當(dāng)降低，即幼年階段動(dòng)物對(duì)某種營(yíng)養(yǎng)素的需求高于成年階段[12]，因此仔稚魚對(duì)ARA的需求量高于幼魚。但本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)飼料中ARA添加量為1.6%時(shí)，刺參生長(zhǎng)速率被抑制。ARA的代謝產(chǎn)物前列腺素在動(dòng)物生長(zhǎng)、免疫、繁殖過程中發(fā)揮著重要作用。Furuita等[13]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)飼料中ARA為0.6%時(shí)，牙鲆的繁育性能得到顯著提高，而飼料中高含量的ARA(1.2%)顯著降低了魚卵及仔魚的質(zhì)量。

3.2 飼料中適宜添加ARA能夠提高刺參體壁中必需脂肪酸和必需氨基酸的沉積量

刺參體壁是主要食用部分，其營(yíng)養(yǎng)組成直接影響產(chǎn)品品質(zhì)。特別是隨著人們生活水平的提高，對(duì)有特殊營(yíng)養(yǎng)功效的“功能食品”需求量日益增加。水產(chǎn)動(dòng)物具有較強(qiáng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)富集能力，被認(rèn)為是生產(chǎn)“功能食品”的理想動(dòng)物模型[14]。已有研究表明，經(jīng)過一段時(shí)間的飼料強(qiáng)化可以大大提高飼料中特定營(yíng)養(yǎng)成分在動(dòng)物機(jī)體中的累積量。飼料中添加富硒蛋氨酸可以有效提高刺參體壁中硒的含量[15]。隨著飼料中ARA含量的升高，刺參體壁中ARA、ARA/EPA、DHA/EPA逐漸升高，這與Xu等[10]在鱸魚中的研究結(jié)果一致。

氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單位，必需氨基酸的含量及其在總氨基酸中所占的比例常常被用以評(píng)價(jià)水產(chǎn)品的品質(zhì)。此外，有些氨基酸也能直接影響產(chǎn)品的風(fēng)味，如谷氨酸能夠提高鮮味，甘氨酸具有甜味的功能。本研究中，包括苯丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、賴氨酸在內(nèi)的必需氨基酸在添加ARA粉劑后在刺參體壁中的沉積量均升高，必需氨基酸在總氨基酸中的比例也提高。氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單位，必需氨基酸的含量及其在總氨基酸中所占的比例常常被用以評(píng)價(jià)水產(chǎn)品的品質(zhì)[16]。其中，有些氨基酸也能直接影響產(chǎn)品的風(fēng)味，如谷氨酸能夠提高鮮味，甘氨酸具有甜味的功能。另外，水產(chǎn)動(dòng)物肌肉中氨基酸的組成易受年齡、低于、種類、季節(jié)以及營(yíng)養(yǎng)狀況等因素的影響[17]。飼料中ARA含量的增加對(duì)刺參成參體壁中氨基酸的積累有促進(jìn)作用，但是相關(guān)機(jī)理還有待于研究。飼料中添加ARA可以有效提高刺參體壁中氨基酸的含量，明顯提高刺參品質(zhì)，減少外界因素對(duì)刺參品質(zhì)的影響。

4 結(jié)論

飼料中ARA含量為0.8%時(shí)刺參成參的具有最大生長(zhǎng)速率和出皮率，較高的必需脂肪酸和必需氨基酸沉積量。因此，刺參成參飼料中ARA的適宜添加量為0.8%飼料干重。