于曉萌，張京良，孫永超，姜言暉，沈照鵬，王鵬，江曉路*

1(中國海洋大學 食品科學與工程學院，山東 青島，266003) 2(中國海洋大學 醫(yī)藥學院，山東 青島，266003) 3(青島海洋生物醫(yī)藥研究院，山東 青島，266071) 4(同濟大學 數(shù)學科學學院，上海，200092)

基于發(fā)酵優(yōu)化和動力學建立Levan果聚糖生產(chǎn)的數(shù)字化模型

于曉萌1，張京良2,3，孫永超4，姜言暉1，沈照鵬2,3，王鵬1，江曉路1*

1(中國海洋大學 食品科學與工程學院，山東 青島，266003) 2(中國海洋大學 醫(yī)藥學院，山東 青島，266003) 3(青島海洋生物醫(yī)藥研究院，山東 青島，266071) 4(同濟大學 數(shù)學科學學院，上海，200092)

利用自動發(fā)酵罐對巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium) GJT321生產(chǎn)Levan果聚糖的發(fā)酵培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，并對發(fā)酵動力學進行研究，采用Logistic方程、Luedeking-Piret方程和底物消耗的物料平衡方程分別建立菌體生長、產(chǎn)物合成和底物消耗動力學的數(shù)字化模型，應用MATLAB軟件進行模型擬合，獲得模型的參數(shù)、方程和曲線。模型的擬合值與發(fā)酵測定的實驗值擬合良好，該模型能較好地反映BacillusmegateriumGJT321生產(chǎn)Levan果聚糖發(fā)酵過程中菌體生長、Levan果聚糖合成和蔗糖消耗的變化規(guī)律，為發(fā)酵過程的在線控制和預測提供理論基礎(chǔ)。

動力學模型；發(fā)酵優(yōu)化；Levan果聚糖；巨大芽孢桿菌

微生物多糖是一種高分子聚合物，在利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)多糖的過程中，發(fā)酵液粘度高、產(chǎn)物分子量高卻易降解、底物濃度難以控制等因素，給發(fā)酵生產(chǎn)帶來一定困難，完善發(fā)酵工藝需要達到培養(yǎng)基成分合理、參數(shù)準確，以實現(xiàn)快速生產(chǎn)的要求。Levan果聚糖是D-呋喃果糖由β-(2,6)糖苷鍵連接而成的一種同多糖，它主要由微生物產(chǎn)生，其生物合成通常由果聚糖蔗糖酶完成[1]，果聚糖蔗糖酶具有水解和轉(zhuǎn)果糖基雙重活性，蔗糖作為唯一底物同時作果糖基供體和果糖基受體。與存在植物體內(nèi)的果聚糖相比，Levan果聚糖不能被酵母菌產(chǎn)生的淀粉酶或轉(zhuǎn)化酶降解[2]，具有抗氧化[3]、抗腫瘤[4]、免疫刺激[5]等藥理活性，在心血管疾病和動脈粥樣硬化方面[3]也能起到一定作用。近年來的研究表明，Levan果聚糖還有作為益生元和可溶性纖維的潛力，因此研究者們對其生產(chǎn)和應用的關(guān)注度逐漸提高[6]。

發(fā)酵罐發(fā)酵是實驗室搖瓶發(fā)酵的放大，為工業(yè)化放大提供依據(jù)，有利于實現(xiàn)成果從實驗室水平向工業(yè)化水平的轉(zhuǎn)變。搖瓶發(fā)酵與發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)間的差異，通常不僅是簡單的放大，會伴隨產(chǎn)物合成量的變化[7]，且在發(fā)酵罐培養(yǎng)中，相對于搖瓶培養(yǎng)，通氣量的控制是其特有的，用于調(diào)控發(fā)酵罐中空氣成分，以期提高產(chǎn)量[8]。通過監(jiān)測溶氧水平，還可了解更多發(fā)酵過程的變化情況。因此，利用發(fā)酵罐對發(fā)酵轉(zhuǎn)速與通氣量進行優(yōu)化，不僅能在發(fā)酵罐水平得到優(yōu)化的發(fā)酵條件，還能結(jié)合溶氧分析發(fā)酵過程。發(fā)酵動力學研究主要集中于對發(fā)酵過程中的菌體濃度、產(chǎn)物濃度及底物濃度隨時間的變化規(guī)律進行研究，結(jié)合數(shù)學模型的應用，對發(fā)酵過程進行模型的擬合預測，目前對生產(chǎn)Levan果聚糖的研究主要集中在發(fā)酵條件的優(yōu)化，未見細菌生產(chǎn)Levan果聚糖發(fā)酵動力學的相關(guān)報道。本文在優(yōu)化發(fā)酵罐培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)上，通過建立由BacillusmegateriumGJT321生產(chǎn)Levan果聚糖的發(fā)酵動力學模型，探尋發(fā)酵過程中參數(shù)的變化規(guī)律，為實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)Levan果聚糖提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

巨大芽孢桿菌BacillusmegateriumGJT321菌株，由中國海洋大學食品科學與工程學院應用微生物學實驗室篩選得到，已送至中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號CCTCC M 2016073。該菌株經(jīng)前期實驗已證實，從發(fā)酵液中分離出的胞外多糖為Levan果聚糖。

斜面培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，NaCl 5 g，蛋白胨10 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 L，pH為7.2；

種子培養(yǎng)基：蔗糖300 g，蛋白胨18 g，(NH4)2SO43 g，NaCl 1.5 g，MgSO40.1 g，CaCl20.05 g，K2HPO41 g，蒸餾水1 L，pH為 7.0；

發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖300 g，蛋白胨18 g，(NH4)2SO43 g，NaCl 1.5 g，MgSO40.1 g，CaCl20.05 g，K2HPO41 g，蒸餾水1 L，pH為 7.0。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-75KB立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1D型單人凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；ZWY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；BLBIO-5GJ-4-H自動發(fā)酵罐，上海百倫生物科技有限公司；GL-20G-II高速冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠；721型可見分光光度計，上海舜宇恒平科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

將BacillusmegateriumGJT321菌株從斜面培養(yǎng)基接種至種子培養(yǎng)基中，在搖床轉(zhuǎn)速32 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)24 h，將種子液以體積分數(shù)為7.5%的接種量接種至裝有4 L發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中，控制適宜的轉(zhuǎn)速和通氣量，于32 ℃條件下發(fā)酵培養(yǎng)。

1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化

在其他條件相同的條件下，分別考察發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速(200、400、600 r/min)和通氣量(2、4、8 L/min)對發(fā)酵體系的溶氧量(dissolved oxygen，DO)、Levan果聚糖產(chǎn)量和生物量的影響，篩選最適轉(zhuǎn)速和通氣量。

1.3.3 發(fā)酵動力學數(shù)字化模型的建立

1.3.3.1 發(fā)酵過程曲線的制作

選擇優(yōu)化后的轉(zhuǎn)速和通氣量，根據(jù)1.3.1的方法進行發(fā)酵培養(yǎng)。從接種后發(fā)酵開始，每小時取樣，對pH、生物量、Levan果聚糖濃度、葡萄糖濃度和蔗糖濃度進行測定，并制作BacillusmegateriumGJT321生產(chǎn)Levan果聚糖的發(fā)酵過程曲線。

1.3.3.2 菌體生長動力學模型的建立

采用Logistic方程建立BacillusmegateriumGJT321的菌體生長動力學模型，描述其菌體生長速率的Logistic微分方程為:

(1)

從方程(1)中可以看出，發(fā)酵初期X接近于0，且X/Xmax的值很小，dX/dt接近于0；之后X開始增大，X小于Xmax，dX/dt即菌體生長速率先升高后降低，菌體生長進入對數(shù)期；由于細菌在發(fā)酵體系中的生長環(huán)境是有限的，X越大，菌體間的競爭越激烈，當X達到最大值時，X=Xmax，會使dX/dt降至0。

初始條件t=0時，得X=X0，積分式為:

(2)

1.3.3.3 產(chǎn)物合成動力學模型的建立

采用Luedeking-Piret方程建立BacillusmegateriumGJT321的產(chǎn)物合成動力學模型，描述Levan果聚糖合成速率的Luedeking-Piret微分方程為:

(3)

由方程(3)可以看出，產(chǎn)物合成速率可能與菌體生長速率和菌體濃度有關(guān)。α≠0、β=0時，產(chǎn)物合成與菌體生長相偶聯(lián)，即產(chǎn)物合成速率與菌體生長速率有關(guān)，菌體生長伴隨產(chǎn)物合成，與菌體濃度無關(guān)；α≠0、β≠0時，產(chǎn)物合成為菌體生長部分偶聯(lián)，即產(chǎn)物合成速率與菌體生長速率和菌體濃度都有關(guān)；α=0、β≠0時，產(chǎn)物合成與菌體生長非偶聯(lián)，即產(chǎn)物合成速率與菌體生長速率無關(guān)，只與菌體濃度有關(guān)。

初始條件t=0時，得P=P0，積分式為:

(4)

1.3.3.4 底物消耗動力學模型的建立

在發(fā)酵過程中，底物消耗主要用于菌體的生長、細胞維持基本生命活動和產(chǎn)物合成[9]，根據(jù)基質(zhì)平衡原理，建立BacillusmegateriumGJT321的底物消耗動力學模型，描述底物消耗的物料平衡微分方程為:

(5)

初始條件t=0時，得S=S0，積分式為:

(6)

1.3.3.5 參數(shù)說明

X、X0、Xmax分別為菌體濃度、起始菌體濃度和最大菌體濃度，g/L；P、P0分別為Levan果聚糖濃度和起始Levan果聚糖濃度，g/L；S、S0分別為蔗糖濃度和起始蔗糖濃度，g/L；t為時間，h；μmax為最大比生長速率，h-1；α為與菌體生長速率相關(guān)聯(lián)的Levan果聚糖合成系數(shù)；β為與菌體濃度相關(guān)聯(lián)的非生長耦聯(lián)系數(shù)；YX/S為菌體對蔗糖的得率，g/g；YP/S為Levan果聚糖對蔗糖的得率，g/g；m為菌體的維持系數(shù)，h-1。

1.3.3.6 模型擬合

采用MATLAB軟件進行數(shù)據(jù)與模型的擬合，將實驗值與模型擬合值進行比較分析。

1.3.4 測定方法

1.3.4.1 生物量測定

發(fā)酵條件優(yōu)化實驗中，以600 nm的吸光值(OD600nm)表示生物量。

建立動力學模型實驗中，取20 mL發(fā)酵液，10 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入10 mL蒸餾水將沉淀均勻分散，再次離心后收集沉淀，于100 ℃烘干至恒重，以菌體干重表示生物量。

1.3.4.2 Levan果聚糖濃度測定

將發(fā)酵液于10 000 r /min離心10 min，在上清液加入1.5倍體積的乙醇，同樣條件下離心棄上清液，向沉淀中加入蒸餾水復溶，采用苯酚-硫酸法[10]測定糖濃度，以葡萄糖為標準品繪制標準曲線。

1.3.4.3 葡萄糖濃度測定

生物傳感器測定葡萄糖濃度[11]。

1.3.4.4 蔗糖濃度測定

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 轉(zhuǎn)速對Levan果聚糖發(fā)酵過程的影響

由圖1可以看出，發(fā)酵初期生物量即增長迅速，消耗大量氧氣，溶氧在發(fā)酵初期均呈迅速下降趨勢，轉(zhuǎn)速越高，溶氧下降越慢，溶氧最低值越高，低溶氧期越短。當生物量(OD600nm)開始下降，即菌體代謝減弱，進入衰亡期后，耗氧能力下降，溶氧上升恢復至發(fā)酵初期水平。在轉(zhuǎn)速為200 r/min的發(fā)酵罐中，溶氧始終保持極低的水平，溶氧不足導致菌體生長緩慢，Levan果聚糖合成延滯，導致Levan果聚糖在發(fā)酵前16 h中上升趨勢較平緩，16 h時才達到最高點。而在轉(zhuǎn)速為400 r/min和600 r/min的2個發(fā)酵罐中，生物量和Levan果聚糖濃度的變化情況幾乎相同，其發(fā)酵合成產(chǎn)物的速度和最大值也幾乎相同，都能夠在6 h時達到Levan果聚糖濃度最大值。雖然在轉(zhuǎn)速為400 r/min的發(fā)酵罐中，溶氧在產(chǎn)物合成期保持較低水平，但是沒有影響菌體的生長和Levan果聚糖的合成。由于轉(zhuǎn)速為400 r/min的條件轉(zhuǎn)速較低，節(jié)省能源，選擇400 r/min作為BacillusmegathriumGJT321菌株發(fā)酵合成Levan果聚糖的最適轉(zhuǎn)速。

圖1 轉(zhuǎn)速對Bacillus megaterium GJT321生產(chǎn)Levan果聚糖發(fā)酵過程的影響Fig.1 Effect of mixing speed on fermentation process of Bacillus megaterium GJT321 producing levan

2.1.2 通氣量對Levan果聚糖發(fā)酵過程的影響

實驗結(jié)果如圖2，通氣量越大，溶氧低水平期越短，但對生物量和Levan果聚糖濃度影響不大。通氣量為2 L/min的條件下，生物量總體偏低，Levan果聚糖達到最大值的時間也略延遲；通氣量為8 L/min條件下，生物量最早達到最大值，說明氧氣供應充足的條件下，菌體生長快；通氣量為4 L/min時，生物量總體偏高，說明菌體長勢好，雖然在4～12 h間溶氧偏低，但是沒有影響菌體的長勢，且Levan果聚糖產(chǎn)量相對較高，在第6 h達到最大值。從產(chǎn)量和節(jié)省能源兩方面考慮，選擇4 L /min作為BacillusmegathriumGJT321發(fā)酵生產(chǎn)Levan果聚糖的最適通氣量。

圖2 通氣量轉(zhuǎn)速對Bacillus megaterium GJT321生產(chǎn)Levan果聚糖發(fā)酵過程的影響Fig.2 Effect of mixing speed on fermentation process of Bacillus megaterium GJT321 producing levan

2.2BacillusmegateriumGJT321生產(chǎn)Levan果聚糖發(fā)酵過程曲線及分析

BacillusmegateriumGJT321生產(chǎn)Levan果聚糖發(fā)酵生產(chǎn)Levan果聚糖過程曲線如圖3所示。蔗糖濃度曲線表現(xiàn)為先快速下降后平穩(wěn)，在4 h后降低的速率減緩，6 h后穩(wěn)定在20 g/L以下。Levan果聚糖濃度曲線和葡萄糖濃度曲線在發(fā)酵過程中變化趨勢一致，在發(fā)酵初期的1 h內(nèi)，Levan果聚糖和葡萄糖濃度略有上升，在1～6 h內(nèi)迅速升高，6 h時分別達到最大值為123.1、130.0 g/L，其后保持平穩(wěn)。上述數(shù)據(jù)表明發(fā)酵前期蔗糖被迅速分解為葡萄糖和果糖，葡萄糖游離在培養(yǎng)基中，果糖則被迅速連接合成Levan果聚糖，蔗糖濃度降低過程與Levan果聚糖濃度升高過程相吻合，說明底物消耗與產(chǎn)物合成幾乎同步進行。pH在Levan果聚糖合成期呈明顯下降趨勢，說明菌株在合成Levan果聚糖的同時產(chǎn)酸；當Levan果聚糖濃度達到最高點時，pH下降至最低點，此后pH和Levan果聚糖濃度均達到穩(wěn)定。菌體生長曲線在發(fā)酵初期的1 h內(nèi)上升緩慢，其后迅速上升，上升趨勢與Levan果聚糖濃度基本一致，10 h時達到生物量最高點，最大生物量為1.62 g/L。

圖3 Bacillus megaterium GJT321生產(chǎn)Levan果聚糖的發(fā)酵曲線Fig.3 Fermentation curve of Bacillus megaterium GJT321 producing levan

2.3BacillusmegateriumGJT321生產(chǎn)Levan果聚糖發(fā)酵動力學數(shù)字化模型參數(shù)值及方程

采用MATLAB軟件建立BacillusmegateriumGJT321生產(chǎn)Levan果聚糖發(fā)酵動力學方程，其參數(shù)見表1。

表1 發(fā)酵動力學模型參數(shù)值

將模型參數(shù)值代入(2)、(4)、(6)式，得到菌體生長、產(chǎn)物合成和底物消耗動力學方程分別為：

(7)

P(t)= 8.643 9+66.634 6X(t)+0.640 1ln

(8)

S(t)= 226.440 9-122.792 1X(t)-1.497 2ln

(9)

2.4BacillusmegateriumGJT321生產(chǎn)Levan果聚糖的發(fā)酵動力學數(shù)字化模型曲線

BacillusmegateriumGJT321生產(chǎn)Levan果聚糖的發(fā)酵動力學模型曲線如圖4～圖6。

圖4 菌體生長動力學模型擬合值與實驗值比較Fig.4 Fitted values and experimental values of cell growth kinetic model comparison

圖5 產(chǎn)物合成動力學模型擬合值與實驗值比較Fig.5 Fitted values and experimental values of product synthesis kinetic model comparison

圖6 底物消耗動力學模型擬合值與實驗值比較Fig.6 Fitted values and experimental values of substrate consumption kinetic model comparison

擬合曲線兩側(cè)虛線間的范圍為95%置信區(qū)間，從圖中可以看出，擬合值與實驗值較為接近，實驗值大部分在95%置信區(qū)間內(nèi)，且曲線擬合度R2分別為0.995 3、0.977 8和0.997 5，平均誤差分別為9.19%、8.11%和9.39%，說明擬合的模型能夠較好地反映BacillusmegateriumGJT321菌株實際的液體深層發(fā)酵過程。延滯期菌體濃度和產(chǎn)物濃度的擬合值與實驗值之間的相對誤差大于對數(shù)增長期和穩(wěn)定期，可能是由于種子液的狀態(tài)對發(fā)酵前期菌體濃度和Levan果聚糖濃度的影響較大。

3 討論

發(fā)酵工程的相關(guān)理論已廣泛應用于工業(yè)化微生物產(chǎn)品的生產(chǎn)和控制，使得現(xiàn)代微生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，產(chǎn)品品質(zhì)也得到提升[12]。能夠生產(chǎn)Levan果聚糖的微生物種類不同，其產(chǎn)量也相差較大。地衣芽孢桿菌8-37-0-1[13]發(fā)酵24 h生產(chǎn)Levan果聚糖，優(yōu)化后產(chǎn)量為41.7 g/L?？莶菅挎邨U菌54A-42通過紫外線-LiCl復合誘變獲得的突變株Z-49[14]，發(fā)酵52 h生產(chǎn)Levan果聚糖產(chǎn)量為16.1 g/L。多粘類芽孢桿菌BD3526[15]生產(chǎn)的分子質(zhì)量為2.6×106Da的果聚糖，產(chǎn)量為36.25 g/L。本文利用BacillusmegateriumGJT321在自動發(fā)酵罐中發(fā)酵生產(chǎn)Levan果聚糖，優(yōu)化培養(yǎng)條件后，確定最適轉(zhuǎn)速400 r/min和通氣量4 L/min，在優(yōu)化條件下發(fā)酵6 h產(chǎn)量達123.1 g/L，遠高于目前已報道的細菌生產(chǎn)Levan果聚糖的產(chǎn)量，該菌株易于培養(yǎng)，發(fā)酵周期短、產(chǎn)量高，具有大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的潛力。經(jīng)過發(fā)酵動力學模型的擬合，建立了基于發(fā)酵動力學的BacillusmegateriumGJT321生產(chǎn)Levan果聚糖的數(shù)字化模型，探尋了其發(fā)酵過程中菌體生長、產(chǎn)物合成和底物消耗的規(guī)律，且模型的擬合值與發(fā)酵測定的實驗值十分接近，模型擬合良好，實現(xiàn)了對BacillusmegateriumGJT321生產(chǎn)Levan果聚糖發(fā)酵過程參數(shù)變化的預測。從模型中可以看出，發(fā)酵6 h時達到Levan果聚糖產(chǎn)量最高點，即6 h時結(jié)束發(fā)酵能夠獲得產(chǎn)物濃度最大化，且節(jié)約了生產(chǎn)時間和成本；還可根據(jù)所需產(chǎn)量輸入模型，得到對應的發(fā)酵時間，便于提前終止發(fā)酵，針對性地獲得既定產(chǎn)量，對Levan果聚糖發(fā)酵生產(chǎn)過程的動態(tài)在線控制和預測具有指導性意義。還可根據(jù)此發(fā)酵動力學數(shù)字化模型開發(fā)相應的在線控制設(shè)備，實現(xiàn)發(fā)酵過程自動化，并對早期污染作出指示，及時終止發(fā)酵過程，減少損失。

由于BacillusmegateriumGJT321在發(fā)酵生產(chǎn)Levan果聚糖的過程中，Levan果聚糖濃度在6 h處便達到了最高點，底物能夠被快速轉(zhuǎn)化利用，產(chǎn)物合成十分迅速，而發(fā)酵體系中的葡萄糖濃度在達到最高值后穩(wěn)定，消耗極少。因此在今后的研究中，可以考慮進行補料分批發(fā)酵實驗，作為一種進行高密度發(fā)酵的重要技術(shù)手段，補料發(fā)酵既可以補充充足的營養(yǎng)，短時間內(nèi)促進更多Levan果聚糖合成，又能夠?qū)l(fā)酵液中的葡萄糖放出體系，處理后可作其他用途，同時減少培養(yǎng)過程中高濃度抑制性副產(chǎn)物的積累[16]。

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Establishment of digital model for levan production based on fermentation optimization and kinetics

YU Xiao-meng1, ZHANG Jing-liang2,3, SUN Yong-chao4, JIANG Yan-hui1, SHEN Zhao-peng2,3, WANG Peng1, JIANG Xiaolu1*

1(College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China) 2(School of Medicine and Pharmacy, Ocean University, Qingdao 266003, China) 3(Marine Biomedical Research Institute of Qingdao, Qingdao 266071, China) 4(School of Mathematical Sciences, Tongji University, Shanghai 200092, China)

The culture optimization and kinetics ofBacillusmegateriumGJT321 fermentation producing levan in automatic fermentor was studied in this paper. Logistic equation, Luedeking-Piret equation and material balance equation of substrate consumption were employed to establish cell growth, product synthesis and substrate consumption kinetics digital models. The parameters, equations and curves were determined by using MATLAB software. The model indicated a good correlation between fitted values and experimental values, and reflected the change rules of cell growth, levan synthesis and sucrose consumption during the production of levan byBacillusmegateriumGJT321. The establishment of fermentation kinetics digital models could provide fundamental basis for following production process control and prediction.

kinetics model; fermentation optimization; levan;Bacillusmegaterium

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201612004

碩士研究生(江曉路教授為通訊作者,E-mail：jiangxl@ouc.edu.cn)。

國家自然科學基金(U1406402-5)

2016-07-25，改回日期：2016-08-15