龍丹，劉曉輝*，吳函殷，劉盼盼，羅龍新

1(深圳市深寶實(shí)業(yè)股份有限公司，廣東 深圳,518040) 2(深圳市深寶華城科技有限公司，廣東 深圳,518115)

茶葉中鍵合態(tài)香氣前驅(qū)物的利用

龍丹1，劉曉輝1*，吳函殷2，劉盼盼2，羅龍新1

1(深圳市深寶實(shí)業(yè)股份有限公司，廣東 深圳,518040) 2(深圳市深寶華城科技有限公司，廣東 深圳,518115)

基礎(chǔ)研究表明，茶葉中的香氣物質(zhì)絕大部分是以鍵合態(tài)的糖苷類香氣前體存在，難以被開發(fā)利用。為了有效將對(duì)香氣貢獻(xiàn)極微的前體物質(zhì)有效轉(zhuǎn)化為可揮發(fā)性香氣物質(zhì)，該文采用正交試驗(yàn)優(yōu)化酸解時(shí)間、酸解溫度、酸解pH值、提香酶添加量和酶解時(shí)間等因素。研究結(jié)果表明，對(duì)揮發(fā)性香氣物質(zhì)總量影響因素從強(qiáng)到弱依次為：酸解時(shí)間、酶解時(shí)間、酶用量、酸解溫度、酸解pH值。獲得最多量的茶葉揮發(fā)性香氣總量的最優(yōu)參數(shù)為：在溫度為60 ℃、pH=3.0條件下酸解0.5 h，隨后添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的提香酶在45 ℃中處理0.5 h。對(duì)比空白組，處理組的揮發(fā)性香氣總量提升89%，其中萜烯醇類糖苷物質(zhì)提升11.1倍。

茶葉；鍵合態(tài)香氣前驅(qū)物；酸解；酶解；正交設(shè)計(jì)

香氣是決定茶葉品質(zhì)的重要因子之一，在茶樹生長(zhǎng)過程中，所形成的香氣物質(zhì)一部分呈游離態(tài)的芳香性揮發(fā)物，但絕大部分是以鍵合態(tài)的香氣前體形式存在[1]。鍵合態(tài)香氣前體多以糖苷類為主，其糖基部分主要是β-D-葡萄糖、β-櫻草糖、β-巢菜糖，配基部分(即苷元)主要是萜烯醇類、芳香醇類和脂肪醇類。其中，芳樟醇、苯乙醇、苯甲醇等萜烯醇類化合物是具有典型花香和果香的物質(zhì)[2](如圖1)。糖苷類鍵合態(tài)物質(zhì)本身無味，但在采摘、水分虧缺、葉片損傷等脅迫環(huán)境下，或者是萎凋、揉捻、做青等加工過程中，易水解釋放出苷元(即香氣物質(zhì))，從而構(gòu)成了茶葉香氣品質(zhì)的物質(zhì)基礎(chǔ)[3]。多篇文獻(xiàn)陸續(xù)確定了茶葉中多種揮發(fā)性香氣組分中的呈香成分及其與糖苷類香氣前體的密切關(guān)系[4]。

圖1 烏龍茶中分離得到的芳樟醇、苯甲醇、苯乙醇結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of (S)-Linalyl, 2-Phenylethyl, and Benzyl DisaccharideGlycosides Isolated fromOolong Tea Leaves

在茶葉深加工領(lǐng)域，香氣寡淡是速溶茶產(chǎn)品普遍存在的瓶頸問題。如何將茶葉中鍵合態(tài)香氣前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化為游離態(tài)揮發(fā)性香氣物質(zhì)加以利用一直備受關(guān)注。目前，主要技術(shù)手段有超高壓法、酶解法、酸解法。超高壓法依賴于高壓設(shè)備，一次性投入較大，一直以來僅停留于實(shí)驗(yàn)室階段。相比之下，酶解法和酸解法的原輔料成本較低，對(duì)加工設(shè)備無特殊要求，增香效果明顯且操作簡(jiǎn)便，是茶葉深加工中優(yōu)先考慮的方法?，F(xiàn)有文獻(xiàn)多集中在使用酶解法增加茶葉香氣，添加酶制劑種類較多且酶解耗時(shí)較長(zhǎng)，而利用“先酸解”快速釋放香氣，結(jié)合“后酶解”塑造香型，實(shí)現(xiàn)高效短時(shí)的增香方法基本未曾涉及。本文運(yùn)用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，試從酸解結(jié)合酶解共同釋香的角度，重點(diǎn)闡述其對(duì)茶葉香氣的改善。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

炒青綠茶由浙江泰龍制茶有限公司提供；提香酶由天野阿瑪諾公司提供。試劑：檸檬酸、癸酸乙酯。

1.2 儀器與設(shè)備

SHZ-B水浴恒溫振蕩器，上海博訊實(shí)驗(yàn)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；R201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；Abbemat 300折光儀，Anton Paar；GC-MS(GC:7890A,MS:5977A)，安捷倫科技有限公司。手動(dòng)SPME進(jìn)樣器、50/30 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷(divinylbenzene/carboxen/polydime thylsiloxane, DVB/ CAR / PDMS)萃取頭，美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 酸解處理

在酸解單因素試驗(yàn)中，首先以80～90 ℃熱水按1∶15茶水比沖泡茶葉，隨后分別按照不同pH值(pH=2.5、3.0、3.5、4.0、4.5；80 ℃下酸解1 h)、不同溫度(50、60、70、80 ℃；pH=4.0酸解1 h)、不同時(shí)間(1、3 h；80 ℃下pH=4.0)，在水浴恒溫環(huán)境中進(jìn)行酸解處理。處理結(jié)束后，進(jìn)行湯渣分離，收集茶湯待香氣檢測(cè)。

1.3. 2 酶解處理

在酶解試驗(yàn)中，首先以80～90 ℃熱水按1∶15茶水比沖泡茶葉，隨后冷卻至40～50 ℃，用檸檬酸調(diào)節(jié)茶湯pH=4.5(酶解最適pH值)，按占茶葉重量0.3%添加提香酶制劑，在45 ℃水浴恒溫環(huán)境中酶解處理1 h。處理結(jié)束后，進(jìn)行湯渣分離，收集茶湯待香氣檢測(cè)。

1.3.3 酸解酶解正交設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L16(45)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平隨機(jī)編號(hào)如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

1.3.4 香氣成分檢測(cè)方法

采用頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(HS-SPME/GC-MS)，添加癸酸乙酯為內(nèi)標(biāo)輔助定量分析。將茶湯稀釋至統(tǒng)一濃度(brix=0.5%)，取30 mL茶湯于60 mL頂空瓶中，加入6 g NaCl及已知量的癸酸乙酯后，立即放入50 ℃水浴鍋中平衡10 min，隨后推出SPME萃取頭吸附40 min，隨即插入GC儀進(jìn)樣口解吸附3 min，同時(shí)收集數(shù)據(jù)。

GC條件：HB-5MS彈性石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度240 ℃；載氣為高純氦氣；流速1.0 mL/min。升溫程序：50 ℃保持5 min，以3 ℃/min升至180 ℃保持2 min，然后以10 ℃/min升至250 ℃保持3 min。

MS條件：電子電離源：電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍50～450 u；離子源溫度230 ℃；四級(jí)桿溫度150 ℃；質(zhì)譜傳輸線溫度280 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 酸解

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[5-7]，稀酸處理能有效催化水解植物細(xì)胞內(nèi)糖苷類物質(zhì)的糖苷鍵(縮醛結(jié)構(gòu))，使之生成相應(yīng)的糖和配基(呈香物質(zhì))。前期預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：酸解反應(yīng)釋放茶香的效果是與酸解時(shí)間、酸解pH值、酸解溫度3個(gè)因素密切相關(guān)。

2.1.1 酸解不同時(shí)間后茶葉釋放香氣情況

如圖2、表2所示，在pH=4，水浴80 ℃的環(huán)境下，酸處理茶葉1 h后的香氣物質(zhì)總量由對(duì)照組的21.8 μg/L增至91.1 μg/L，酸處理3 h后增至93.1 μg/L，提高近3倍。從香氣組分上分析，醇類物質(zhì)經(jīng)由酸處理后增長(zhǎng)近8倍，是拉動(dòng)香氣總量上升的主要物質(zhì)，其中，以芳樟醇、香葉醇為代表性萜烯醇類苷元，在酸解1 h后含量分別增加11倍和3.8倍；以苯甲醇為代表的芳香族醇類苷元在酸處理1 h后被釋放。從香氣的感官審評(píng)上看，對(duì)照組以清香為主，酸處理20 min后熟栗香明顯，40 min后熟栗香伴隨水果香，60 min后水果香濃郁。隨著酸處理時(shí)間的延長(zhǎng)，香氣的馥郁程度隨之升高，香型由“清香型”向“花果香型”轉(zhuǎn)變，是酸水解糖苷釋放呈香苷元的又一證明。

從酸解時(shí)間對(duì)揮發(fā)性香氣的影響看，由1 h延長(zhǎng)至3 h在香氣總量和組分上沒有顯著差別，說明酸解法能在1 h內(nèi)極大程度地水解釋放出大部分的香氣物質(zhì)。

圖2 酸解不同時(shí)間對(duì)香氣組分的影響Fig.2 The effect of acidhydrolysisduration on aroma constituents

表2 酸解不同時(shí)間對(duì)香氣組分的影響

2.1.2 不同溫度下酸解茶葉釋放香氣情況

如圖3所示，在50～70 ℃范圍內(nèi)，揮發(fā)性香氣物質(zhì)總量隨酸處理溫度上升而上升，80 ℃條件下香氣總量較70 ℃略有下降，可能與高溫加速香氣物質(zhì)揮發(fā)逸散和熱劣變有關(guān)。從香氣組分上看，無論在何種溫度下酸處理，所得茶湯揮發(fā)性成分含量由高到低依次為：醇類、醛類、酮類、酯類。隨著酸處理溫度的上升，醇類物質(zhì)進(jìn)一步升高，主要包括(含量由高到低)：芳樟醇、萜品醇、香葉醇、α-雪松醇。當(dāng)酸解溫度升高至?xí)r70 ℃，出現(xiàn)反-氧化芳樟醇、脫氫芳樟醇、萜烯醇等新增香氣物質(zhì)，其中前兩者是芳樟醇的氧化或還原產(chǎn)物，也呈類似花果香型，增量較為迅速。

圖3 不同溫度下對(duì)香氣組分的影響Fig.3 The effect of different temperatures on aroma constituents

2.1.3 不同pH下酸解茶葉釋放香氣情況

圖4表明，茶葉在pH=3.0的酸解條件下，揮發(fā)性香氣物質(zhì)總量最高，其中醇類物質(zhì)提高較為顯著，當(dāng)pH上升至3.5時(shí)基本沒有起到酸解釋香的作用。與此類似的是，水果中的鍵合態(tài)香氣物質(zhì)在不同pH值調(diào)節(jié)條件下酸解釋香程度也存在顯著差異[8-9]。在溫和的酸性環(huán)境中，葡萄、樹莓、煙草等植物材料中的部分鍵合態(tài)香氣物質(zhì)會(huì)自發(fā)地進(jìn)行緩慢水解進(jìn)而逐步釋放香氣物質(zhì)，隨著人為降低酸解環(huán)境的pH值，鍵合態(tài)香氣物質(zhì)的種類急劇增多，在pH值極低的劇烈酸性環(huán)境中甚至能夠發(fā)生化學(xué)變化而生成新物質(zhì)，如萜烯類物質(zhì)的分子重排等[10]。

圖4 不同pH環(huán)境對(duì)香氣組分的影響Fig.4 The effect of different pH on aroma constituents

2.2 酶解

如圖5所示，提香酶處理后揮發(fā)性香氣總量在原有基礎(chǔ)上提升60.29%，特別有助于醇類、醛類和酯類香氣物質(zhì)的釋放。

圖5 提香酶對(duì)香氣組分的影響Fig.5 The effect of flavoring enzyme on aroma constituents

2.3 酸解結(jié)合酶解正交試驗(yàn)

由表3得知，對(duì)茶葉揮發(fā)性香氣物質(zhì)總量影響因素強(qiáng)弱依次為：B(酸解時(shí)間)>E(酶解時(shí)間)>D(酶用量)>A(酸解溫度)>C(酸解pH值)。在所選因素水平范圍內(nèi)，理論上最佳提香工藝為A1B1C2D4E1，即在溫度為60 ℃、pH=3.0下酸解0.5 h，隨后在45 ℃下添加0.5%提香酶1酶解0.5 h，得到茶葉揮發(fā)性香氣物質(zhì)總量最大。

表3 正交試驗(yàn)處理結(jié)果

經(jīng)由最佳提香工藝(A1B1C2D4E1)處理后，茶湯呈顯濃郁的水果香。如表4所示，處理組香氣總量較對(duì)照提升89%，其中醇類芳香物質(zhì)，特別是萜烯醇類香氣物質(zhì)在酸解酶解復(fù)合工藝下得以有效釋放，提升11.1倍。在這一過程中，不僅具有花果香氣的芳樟醇(增長(zhǎng)32倍)、α-萜品醇(增長(zhǎng)21倍)、香葉醇(增長(zhǎng)6.9倍)增量顯著，而且新增了具有典型綠茶清香的“反-3-己烯醇”以及具有花果香的橙花叔醇、橙花醇、苯甲醇等芳香物質(zhì)。

表4 醇類香氣物質(zhì)釋放

3 討論

自1969 年FRANCIS[11]從玫瑰花瓣中分離得到糖苷形式的單萜醇以來，糖苷類鍵合態(tài)香氣物質(zhì)的相關(guān)研究開始進(jìn)入人們的視野。目前，已從茶葉中鑒定出二十多種糖苷類香氣前體[12-13]，主要是以芳樟醇及其氧化物、香葉醇、橙花醇、苯甲醛、苯甲醇、苯乙醇和水楊酸甲酯等為配基的糖苷, 上述糖苷水解釋放后, 配基成為游離態(tài)茶葉香氣成分, 是高檔茶葉呈現(xiàn)花、果香的重要物質(zhì)基礎(chǔ), 能顯著提速溶茶制品的香氣品質(zhì)[14-15]。

在傳統(tǒng)茶類的加工過程中，不同的工藝流程會(huì)不同程度地釋放糖苷類物質(zhì)[16]，但絕大部分糖苷類物質(zhì)依然保留在葉底中，難以得到有效釋放和利用?，F(xiàn)階段，促使茶葉糖苷類鍵合態(tài)香氣物質(zhì)釋放游離態(tài)香氣物質(zhì)的常用方法主要有酸解法[6]或酶解法[17]。從原理上看，糖苷鍵屬于縮醛鍵，能被酸催化水解，生成相應(yīng)的糖和配基物質(zhì)(香氣物質(zhì))，向茶葉中添加外源酸會(huì)加速這一轉(zhuǎn)化過程，是一種簡(jiǎn)單可行的水解方式。而酶解法水解糖苷時(shí)，糖基部分變?yōu)榛钚暂^高的半椅式構(gòu)象，糖苷鍵上的氧原子從酶分子上獲得質(zhì)子(H)，并以ROH的形式脫落，游離成為香氣物質(zhì)[18]。從反應(yīng)的特點(diǎn)看，酸解法反應(yīng)條件較為劇烈，且對(duì)底物不具有選擇性，能短時(shí)間內(nèi)徹底打開糖苷鍵，釋放大量香氣物質(zhì)，增加速溶茶制品的香氣的濃度。酶解法反應(yīng)條件較為溫和，產(chǎn)物種類較為豐富，香型較為愉悅。2種方法結(jié)合的優(yōu)勢(shì)在于，一方面，酸解法能在短時(shí)間內(nèi)大大增加香氣的濃度和馥郁程度，在此基礎(chǔ)之上，繼續(xù)酶解茶葉，能豐富茶葉香氣物質(zhì)的種類，有利于香型的塑造；另一方面，酸解處理后茶葉組織軟化破碎，有利于下一步酶解的進(jìn)行。

本文以炒青綠茶作為原料，以揮發(fā)性香氣物質(zhì)總量為指標(biāo)，在單因素實(shí)驗(yàn)中，酸解的最適 pH=3，溫度為70 ℃、時(shí)間為1 h。在酸解結(jié)合酶解的正交實(shí)驗(yàn)中，得到最佳提香工藝參數(shù)為：茶葉在60 ℃水浴、pH=3.0下酸解0.5 h，隨后在45 ℃下添加0.5%提香酶酶解0.5 h，得到揮發(fā)性香氣物質(zhì)總量在空白的基礎(chǔ)上提升89%，萜烯醇類糖苷物質(zhì)在酸解酶解復(fù)合工藝下得以有效釋放，提升11.1倍。上述因素對(duì)指標(biāo)影響強(qiáng)弱依次為：B(酸解時(shí)間)>E(酶解時(shí)間)>D(酶用量)>A(酸解溫度)>C(酸解pH值)。實(shí)驗(yàn)證明，利用”酸解酶解”串聯(lián)反應(yīng)，能有效水解糖苷態(tài)前體物質(zhì)，從而提高速溶茶制品香氣物質(zhì)總量，顯著豐富香氣組分及改善綠茶香型，且所用輔料(檸檬酸、單一酶制劑)成本較低，處理溫度較低(60 ℃以下)，處理時(shí)間較短(約1 h)，整個(gè)工藝流程操作較簡(jiǎn)單，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

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The utilization of bound aroma precursors in tea

LONG Dan1, LIU Xiao-hui1*, WU Han-yin2, LIU Pan-pan2, LUO Long-xin1

1(Shenzhen Shenbao Industrial Co. Ltd., Shenzhen 518040, China) 2(Shenzhen Shenbao Huacheng Tech. Co. Ltd., Shenzhen 518115，China)

Most of the tea aroma substances are bound glycosidic precursors that are difficult to be utilized. To transform unscented aroma precursors into volatile aroma substances, we optimized parameters such as the time, pH, temperature of acid hydrolysis and the time, addition of enzyme hydrolysis by orthogonal array design. Our study found that the factors influencing on total volatile aroma substances were as follows in order of strong to weak: acid hydrolysis time, enzyme hydrolysis time, enzyme addition amount, acid hydrolysis temperature and acid hydrolysis pH. For obtaining most of total tea aroma substances, the optimal treatments were 30 min infusion at 60 ℃ and pH=3.0, and then 30 min enzymolysis with 0.5% (w/w) flavor-enhancing enzyme at 45 ℃. Compared to that of the control sample, the volatile aroma content increased 89% after treatment, terpene glycosides increasing 11.1 fold.

tea; bound aroma precursors; acid hydrolysis; enzyme hydrolysis; orthogonal array design

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201612022

碩士，研發(fā)工程師(劉曉輝為通訊作者,E-mail：liuxiaohui@sbsy.com.cn)。

深圳市戰(zhàn)略新興產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(xiàng)(CXZZ20120612142335998)

2016-01-12，改回日期：2016-04-27