劉 玉，柴俊雯，陳紅剛，陸國弟，杜 弢*,2,3

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中藥質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物遺傳育種研究所，甘肅 蘭州 730000）

不同基源黨參種子冰凍切片技術(shù)探討

劉 玉1，柴俊雯1，陳紅剛1，陸國弟1，杜 弢*1,2,3

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中藥質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物遺傳育種研究所，甘肅 蘭州 730000）

以不同基源的黨參為試材進(jìn)行冰凍切片，種子經(jīng)過前處理、冷臺固定、冷凍切片、展片、染色、觀察并拍照等步驟，結(jié)果表明，當(dāng)冷臺溫度為-20℃、OCT包埋劑冷凍5～8 min、切片厚度為8～12 μm時，可以獲得較清晰的種子橫（縱）切面圖，切片組織完整性和圖片清晰度效果較好。

黨參；川黨參；素花黨參；種子；冰凍切片；技術(shù)

冰凍切片是一種在較低溫條件下使組織快速冷凍到一定的硬度，然后進(jìn)行切片的一種方法，且不經(jīng)過脫水和透明、浸蠟等一系列的繁瑣前期實(shí)驗(yàn)步驟，組織形態(tài)不會收縮，具有簡便、快速、易操作、環(huán)境污染小等特點(diǎn)[1]。常用于組織化學(xué)、免疫定位及原位雜交等研究，在動物和人體的研究、臨床手術(shù)中已被廣泛應(yīng)用[2]，近年來也逐漸應(yīng)用于藥材的根、莖、花、果實(shí)和種子研究[3～5]。

本試驗(yàn)以不同基源的黨參為主要試材，在最短時間內(nèi)制作出高質(zhì)量的切片，試圖建立一種適合于黨參種子快速、簡便、高效的冰凍切片技術(shù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

德國產(chǎn)Leica-CM 1950型恒冷切片機(jī)；日本產(chǎn)Feather一次性刀片；尼康80i顯微成像系統(tǒng)。

1.2 試劑

70%乙醇、1%番紅水溶液、0.1%固綠乙醇溶液（95%乙醇配制）、95%乙醇、OCT包埋劑、普通膠水、載玻片、蓋玻片、酒精燈、水合氯醛及50%甘油。

1.3 材料

黨參（Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.）素花黨參（Codonopsis pilosula Nannf.Var.modesta（Nannf.）L. T.Shen）和川黨參（Codonopsis tangshen Oliv.）種子，均由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物遺傳育種研究所提供，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)杜弢教授鑒定。

2 方法與步驟

操作步驟：①前處理；②固定樣品至冷臺；③冰凍切片；④展片；⑤染色；⑥觀察并拍照。

2.1 前處理

樣品前處理比較了用水浸泡和不同濃度梯度的酒精浸泡對切片效果的影響，結(jié)果表明，兩種處理方法對種子切片基本沒有影響。考慮經(jīng)濟(jì)方面，將種子用清水洗滌3次后，置于室溫下在水中浸泡12～24 h。

2.2 固定樣品至冷臺

設(shè)定冷凍切片機(jī)溫度（-20℃），將試驗(yàn)用的毛筆、鑷子放入冷凍切片機(jī)內(nèi)一起降溫。待溫度降到-15℃以下時，用毛筆刷去除冷臺上的薄霜。將刀片固定在切片機(jī)的刀槽上，當(dāng)冷凍箱溫度降低至-20℃時，將種子放在托盤上，然后滴加OCT包埋劑或膠水，用大頭針使種子均勻地分散在包埋劑中。然后置于冷臺上，OCT冷凍5～8 min或膠水冷凍20～30 mim，使材料迅速冷凍并能夠牢固地黏附在托盤上。

2.3 切片

將托盤置于冷臺固定槽上，調(diào)節(jié)旋轉(zhuǎn)切片厚度的旋鈕，搖動旋轉(zhuǎn)手輪進(jìn)行切片。切片不可太厚，否則細(xì)胞容易重疊而影響觀察結(jié)果；也不可過薄，否則切片易碎、不完整。經(jīng)過多次試驗(yàn)，將種子切片厚度調(diào)為8～12 μm，在切片的過程中，切片刀上的霜層較厚，應(yīng)及時啟動除霜程序去除霜層或者用毛筆刷刷掉，以防止卷片。

2.4 展片

用毛筆刷將切片移到載玻片上，或者直接將載玻片以合適的位置靠近刀片。由于溫差作用，切片自動黏附在載玻片上。取出載玻片，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察等后續(xù)試驗(yàn)。

2.5 染色

載玻片上的材料用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的番紅水溶液染色20 min，用蒸餾水洗滌3～5次，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的固綠染色30 s，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的乙醇沖洗固綠至材料不褪色為止，之后滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的甘油于材料表面，蓋上蓋玻片。

2.6 觀察并拍照

使用尼康80i顯微成像系統(tǒng)觀察切片并拍照。

3 結(jié)果

3.1 黨參種子微觀特征

黨參種子結(jié)構(gòu)由種皮、胚乳和胚3部分組成，種皮細(xì)胞排列整齊，其表面紋理呈條型網(wǎng)狀紋飾，網(wǎng)眼呈長條形或梭形。橫切面：種皮為一列棕紅色厚壁細(xì)胞，細(xì)胞呈柱狀，相鄰細(xì)胞間沒有間隙；胚乳細(xì)胞多層，呈多角形作徑向延長排列，內(nèi)含較多的糊粉粒；胚位于中央，外層細(xì)胞呈長方形或近方形環(huán)狀排列，靠近最里面呈徑向排列（如圖1中A黨參種子橫切顯微結(jié)構(gòu)）?？v切面：種皮細(xì)胞呈縱向長條形或梭形，細(xì)胞切向延長，壁孔紋增厚，胚乳多層，胚位于中央，呈長方形作徑向排列。

3.2 素花黨參種子微觀特征

與黨參種子結(jié)構(gòu)及其相似。橫切面：種皮表皮為一列棕紅色厚壁細(xì)胞，細(xì)胞柱狀；胚乳多層；胚位于中央?？v切面：種皮細(xì)胞呈縱向長條形或梭形；胚乳多層，呈多角形切向延長排列；胚位于中央，呈長方形作徑向排列，種皮細(xì)胞呈縱向長條形或梭形（如圖1中B素花黨參種子縱切顯微結(jié)構(gòu)）。

3.3 川黨參種子微觀特征

與黨參、素花黨參種子結(jié)構(gòu)及其相似，表面具有排列整齊的條型網(wǎng)狀紋飾，網(wǎng)眼呈梭形或長條形。橫切面：種皮為一列棕紅色厚壁細(xì)胞，細(xì)胞柱狀，外壁互相連接；胚乳多層，呈多角形作徑向延長排列，內(nèi)含較多的糊粉粒；胚位于中央，外層細(xì)胞呈近長方形或不規(guī)則方形環(huán)狀排列，靠近最里面呈徑向排列（如圖1中C川黨參種子橫切顯微結(jié)構(gòu)）。縱切面：種皮細(xì)胞呈縱向長條形或梭形；胚乳多層，呈多角形切向延長排列；胚位于中央，呈長方形作徑向排列。

圖1 不同基源黨參種子橫（縱）切面顯微結(jié)構(gòu)圖

4 結(jié)論與討論

4.1 不同冰凍切片條件的比較

新鮮材料直接包埋冷凍切片的關(guān)鍵是既有適合切片的冷凍溫度，又有最大程度減少冰晶形成的冷凍時間。為了得到適宜的冷凍溫度和冷凍時間，在冷臺溫度為-15℃、-20℃、-25℃的條件下，冷凍不同時間（20～40 min），觀察切片效果。通過反復(fù)比較發(fā)現(xiàn)，冷臺溫度-20℃、冷凍時間根據(jù)不同包埋劑冷凍時間不同、膠水作包埋劑一般冷凍25～30 min切片效果最好。若冷凍時間太短（20 min），因?yàn)榻M織本身較軟，會因包埋劑和材料的硬度不一致，在切片時易產(chǎn)生空洞，造成胚丟失，從而影響成片；若時間太長（40 min），則會導(dǎo)致冰晶太多，細(xì)胞破損，故20～30 mim較為適宜。OCT包埋劑一般冷凍約5～8 min，時間過長也不利于切片。

4.2 包埋劑對切片效果的影響

冰凍切片常用的包埋劑有水、普通膠水和OCT，比較分析了這3種包埋劑對冰凍切片的影響，結(jié)果表明，用水作包埋劑，較難切出完整的切片，種子都集中到底部，且無法進(jìn)行切片；OCT包埋劑與普通膠水效果基本相同，都能切出完整的切片，但用普通膠水必須用熱水沖洗后才能染上色，否則無法染色，但由于種子本身小，用水沖洗幾次就很難找到種子，且沖洗過程中種子容易碎；用OCT包埋后直接用水合氯醛透化染色再滴稀甘油蓋上蓋玻片后，就可以觀察清楚種子組織結(jié)構(gòu)。如果在冰凍前將材料浸沒在OCT中，讓OCT充分滲透進(jìn)組織中，切片效果更好。

4.3 切片厚度對細(xì)胞形態(tài)的影響

經(jīng)過多次試驗(yàn)，種子切片厚度為8～15 μm時，切片效果良好，厚薄均勻、無皺折，鏡下組織結(jié)構(gòu)完整、細(xì)胞形態(tài)清晰、無明顯收縮、組織無人為裂隙、無空泡及空網(wǎng)狀形成、無冰晶等。主要觀察的組織結(jié)構(gòu)能較完整地呈現(xiàn)，與石蠟切片觀感相似，層次分明、分辨率良好。

綜上所述，冰凍切片是植物細(xì)胞和形態(tài)結(jié)構(gòu)研究的一種簡便、快捷、高效的方法。筆者以不同基源的黨參種子冰凍切片，取得了良好的效果。冰凍切片不易掌握，要做好一張冰凍切片不能只注重速度，其他步驟也很重要。

[1]包翠芬,劉霞,穆長征,等.冰凍切片幾種防冰晶方法的比較[J].中國誤診學(xué),2006，6(17):3 310-3 311.

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1005-2690（2016）11-0112-02

：S567.5+3

：B

2016-06-24）

2012年中醫(yī)藥部門公共衛(wèi)生專項(xiàng)“2012年國家基本藥物所需中藥原料資源調(diào)查和監(jiān)測”（財社〔2012〕13號）課題“國家基本藥物所需中藥材種子種苗繁育基地建設(shè)”

劉玉（1991-），漢族，陜西榆林人，碩士，研究方向?yàn)橹兴庂Y源開發(fā)與質(zhì)量綜合評價。

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：杜弢(1967-)，漢，碩士，教授，主要從事藥用植物育種、栽培的教學(xué)與研究。