王梓茗 綜述 尹愛華 審校

（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣東省婦兒醫(yī)院 醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣東 廣州 511442）

地中海貧血是一種常見的單基因遺傳病，高發(fā)于熱帶、亞熱帶地區(qū)如東南亞、印度、地中海、中東、北非等地區(qū)及中國廣西、廣東、海南等省份。我國以α-地中海貧血最常見，α-地中海貧血的攜帶率高達(dá)7.88%［1］，其中--SEA則是占比最多的類型，-α3.7、-α4.2次之。--SEA是一條染色體上兩個拷貝的α-珠蛋白基因均缺失DNA，因此無法合成α-珠蛋白，當(dāng)--SEA純合時，則無有效α-珠蛋白合成，胎兒在宮內(nèi)即發(fā)生貧血，胎兒及胎盤高度水腫，即Bart水腫胎，最遲在出生后24小時內(nèi)死亡。當(dāng)夫妻雙方均為--SEA攜帶者，則有25%的概率出現(xiàn)純合型地貧胎兒。

目前認(rèn)為最有效的預(yù)防措施主要是對高危孕婦進(jìn)行產(chǎn)前診斷，并對重型地貧患兒進(jìn)行選擇性流產(chǎn)，從而有效避免重型地中海貧血患兒出生。傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷方法為有創(chuàng)方法，即通過有創(chuàng)方法取樣，直接檢測胎盤或胎兒細(xì)胞中的遺傳物質(zhì)，是產(chǎn)前診斷中的金標(biāo)準(zhǔn)，但具有流產(chǎn)、胎兒損傷的風(fēng)險。直到孕婦血漿中胎兒游離DNA的發(fā)現(xiàn)，使得無創(chuàng)、準(zhǔn)確、簡便、快速的產(chǎn)前診斷方法得以發(fā)展。本文主要綜述無創(chuàng)產(chǎn)前診斷技術(shù)在α-地中海貧血方面的技術(shù)進(jìn)展。

1 有創(chuàng)產(chǎn)前診斷方法現(xiàn)狀

常用有創(chuàng)產(chǎn)前診斷方法主要包括：①絨毛活檢術(shù)：時間是孕11～13＋6周，可用于早期診斷，缺點是胎兒丟失率相對較高（0.22%）；②羊膜腔穿刺術(shù)：在妊娠16周后進(jìn)行，比絨毛活檢安全（胎兒丟失率0.11%），缺點有損傷胎兒的風(fēng)險；③胎兒臍靜脈穿刺術(shù)：穿刺時間在孕24周后，缺點是對穿刺人員技術(shù)要求高，以及術(shù)中、術(shù)后胎兒并發(fā)癥發(fā)生率高，包括短暫的胎兒心動過緩、臍帶出血以及絨毛膜-羊膜炎等［2］。有創(chuàng)產(chǎn)前診斷方法目前廣泛應(yīng)用于核型分析、親子鑒定及地中海貧血、耳聾等多種單基因遺傳病的產(chǎn)前診斷中。

2 孕婦血漿中胎兒遺傳物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)

1990年，Bianchi［3］首次闡述了母血中胎兒游離有核紅細(xì)胞（fetal nucleated red blood cell，F(xiàn)NRBC）的存在，因其具有胎兒全套遺傳物質(zhì)，被認(rèn)為是最理想的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷工具。然而胎兒有核紅細(xì)胞在孕婦外周血中有核紅細(xì)胞的僅占30%～50%［4］，不僅需要的工作量大且易污染。同時，單個細(xì)胞中含有的遺傳物質(zhì)量少，不易檢測多個位點。

1997年，Lo［5］首次從孕婦血漿中檢測出男性胎兒Y染色體上特異序列，證實了胎兒游離DNA（cell-free fetal DNA，cff DNA）的存在，使檢測孕婦血漿中胎兒游離核酸為基礎(chǔ)的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷（noninvasive prenatal diagnosis，NIPD）成為現(xiàn)實。Lo［6］的研究還表明，胎兒游離DNA最早可在孕7周時檢出，即理論上在孕早期就可進(jìn)行檢測，胎兒游離DNA含量隨著孕周的增加而逐漸增加。胎兒游離DNA是同時期胎兒細(xì)胞成分的21倍，胎兒游離DNA具有重要的特征：①胎兒游離DNA明顯短于孕婦來源的游離DNA［7］；②胎兒游離DNA的主要來源是進(jìn)入母血中的胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡釋放［8］；③胎兒游離DNA在母親血漿中平均半衰期僅為16分鐘［9］；④胎兒游離DNA在胎兒娩出后迅速被清除，在產(chǎn)后2小時后即從母血中消失，不易受既往妊娠影響；⑤胎兒游離DNA的含量與胎兒孕周、孕婦體重、先兆子癇等多種因素相關(guān)。相比于胎兒有核紅細(xì)胞，胎兒游離DNA含量更加豐富［6］，且富集血漿游離DNA相對容易。

3 胎兒游離DNA的產(chǎn)前診斷研究現(xiàn)狀

無創(chuàng)產(chǎn)前診斷最早應(yīng)用于檢測胎兒性別決定基因（SRY）及DYS14以排除X連鎖遺傳疾病，以及從RhD（－）的孕婦血漿中檢測胎兒Rhesus D基因以獲得胎兒處置的診斷依據(jù)［10，11］。時至目前，無創(chuàng)產(chǎn)前診斷已應(yīng)用于多種單基因遺傳病的排除性診斷，如囊性纖維病、軟骨發(fā)育不全、亨廷頓病、先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥等［12］。

第二代測序（next-generation sequencing，NGS）應(yīng)用于非整倍體無創(chuàng)產(chǎn)前檢測的理念最早于2008年提出［13］，目前該技術(shù)已應(yīng)用于13、18、21號染色體的非整倍體無創(chuàng)產(chǎn)前診斷中，21-三體檢出率達(dá)到99.3%，13-三體、18-三體檢出率均達(dá)97.4%［14］。同時隨著二代測序的平臺的發(fā)展，已經(jīng)通過全基因組測序的方法繪制出完整的胎兒游離DNA圖譜，以及新算法的提出，例如基于NGS平臺對于序列的絕對定量而提出的相對單體型劑量（relative haplotype dosage，RHDO）方法，可以借助單體型分析估算胎兒遺傳的母源位點［8］，推動了無創(chuàng)產(chǎn)前診斷方法的進(jìn)步。捕獲序列測序方法較全基因組測序更有針對性，測序成本更低廉，目標(biāo)區(qū)域測序更精準(zhǔn)，逐漸取代全基因組測序成為新的發(fā)展方向。

4 α-地中海貧血無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的方法進(jìn)展

Chiu［15］在2002年首次報道了地中海貧血無創(chuàng)產(chǎn)前診斷應(yīng)用，利用熒光定量PCR的方法，從孕婦血漿檢測胎兒是否遺傳父親的β-地中海貧血致病基因，從而開啟了地中海貧血無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的道路。常用檢測策略為排除法，即排除父源突變位點的方法，目前已有報道MALDI-TOF、單堿基引物延伸芯片、熒光定量PCR等多種方法在無創(chuàng)產(chǎn)前診斷方面的研究，且同樣適用于β-地中海貧血以外的以點突變?yōu)橹鞯亩喾N單基因遺傳病的。而常見的α-地中海貧血類型為缺失型，且缺失片段較大，其常用檢測方法主要包括gap-PCR、多重?zé)晒舛縋CR、多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）等方法，而這些方法在高度片段化的cf DNA中檢測大片段缺失存在困難。同時，Bart水腫胎發(fā)生在攜帶--SEA的母親當(dāng)中，則cf DNA背景中本身包含有1∶1比例的--SEA和野生型序列，排除法并不適用。目前研究的策略可以大體分為定量方法及多態(tài)位點分析方法。定量分析方法包括直接定量及相對劑量方法。相對突變含量方法是同時擴(kuò)增含有對野生型或突變型基因的片段并分別定量，利用孕婦血漿中兩種型別的序列是否存在不平衡而判斷胎兒的基因型。而當(dāng)胎兒為雜合時，突變型基因與野生型基因仍保持1∶1；當(dāng)胎兒為突變型基因純合時，突變型基因含量顯著多于野生型。多態(tài)位點分析方法是利用致病基因緊密連鎖的STR及SNP位點，從孕婦血漿中檢測胎兒特異的STR或SNP位點，從而判斷胎兒是否遺傳來自父親的野生型或突變型位點。該方法需要事先明確父母雙方致病基因相關(guān)的SNP或STR位點，當(dāng)雙方均攜帶相同的SNP或STR時，該方法無法識別父源位點。

4.1 qPCR 和 QF-PCR Tungwiwat［16］使用巢式qPCR（quantitative real-time polymerase chain reaction）的方法特異性擴(kuò)增突變型（--SEA）基因，正常胎兒（αα／αα）突變型基因拷貝數(shù)為0，而Bart水腫胎中突變型基因則明顯高于標(biāo)準(zhǔn)型和Hb H病，因此能夠分辨Bart水腫胎的發(fā)生。Long［17］則以α1和α2基因之間的區(qū)域、無其他同源性的一段基因作為目的基因，以β-珠蛋白基因為參照，用 QF-PCR（quantitative fluorescence polymerase chain reaction）同時擴(kuò)增內(nèi)參（β-珠蛋白基因）和α-珠蛋白鏈上的目的基因，并使用毛細(xì)管電泳分析PCR產(chǎn)物峰面積比值改變以判斷Bart水腫胎的發(fā)生。定量方法具有簡便、分析簡單、能夠直接估計胎兒基因型的優(yōu)點，但在極低的胎兒濃度下，real-time PCR尚無法區(qū)分目的基因和野生型基因的變化。

Ho［18］則利用--SEA斷裂區(qū)內(nèi)的兩個微衛(wèi)星位點16PTEL05和16PTEL06檢測--SEA基因，--SEA基因并不存在這兩個微衛(wèi)星序列，通過檢測父源特異的微衛(wèi)星序列，即可判斷胎兒是否遺傳父親的野生型基因，反之則遺傳了父親的--SEA基因，該方法能從混合樣本中檢測到僅2%的胎兒DNA，但2／3是由于胎兒遺傳了父母相同的遺傳標(biāo)記或未能檢出父源STR峰而不適用。Yan［19］則利用缺失區(qū)域內(nèi)的9個SNP位點，在孕婦血漿中檢測父源特異的SNP，并能夠排除49.3%的父源性遺傳--SEA導(dǎo)致的Bart＇s水腫胎。盡管如此，因為必須從大樣本隨機(jī)人群中篩選出候選多態(tài)性位點，并在攜帶者人群中篩選出合適的多態(tài)性位點，費時費力；還必須借助繁復(fù)的方法確定其單體型，但由于并非對胎兒致病基因的直接檢測，需要提前獲得父母雙方的單體型，大大增加了檢測周期及檢測成本，難以推廣；該方法有賴于足夠數(shù)量的多態(tài)性位點才可做出準(zhǔn)確診斷，而可用于從孕婦血漿中鑒別的遺傳位點相當(dāng)有限，相當(dāng)比例的病例缺乏或僅有1個可供無創(chuàng)產(chǎn)前診斷檢測的位點，不足以提供足夠的信息分析，局限了對于致病基因的連鎖分析的應(yīng)用。

4.2 高通量測序 Ge［20］則使用目標(biāo)序列捕獲測序方法在檢測胎兒致病性CNV的策略；而 Wang［21］則闡述了利用家系分析確定父母雙方單體型，與孕婦血漿利用隱馬爾科夫模型的Viterbi算法預(yù)測胎兒的單倍型和基因型，且相較于Ge的方法，由于目標(biāo)區(qū)域長度短，且僅涉及少量高變異SNP位點，因此檢測成本低。目標(biāo)捕獲序列針對性高，利用探針捕獲所需研究的區(qū)域，可有效降低測序成本，而且對目標(biāo)區(qū)域的測序深度更深，因此不僅能檢測出SNP或點突變，也能有效識別出較大的缺失片段，如--SEA。然而，兩種方法都對胎兒血漿濃度要求較高，在孕婦血漿中捕獲的目標(biāo)區(qū)域的特異性不如基因組中捕獲［20］，目標(biāo)區(qū)域的覆蓋度易波動，因此在孕早期推行仍需要條件的優(yōu)化；捕獲探針需額外訂制，因此訂制的成本及周期較長。

4.3 數(shù)字PCR 數(shù)字PCR的反應(yīng)體系與熒光定量PCR相似，但是通過稀釋后將不同靶分子分布于單個反應(yīng)室中，大部分反應(yīng)室僅含不超過1個目標(biāo)DNA分子，每個反應(yīng)室單獨進(jìn)行PCR擴(kuò)增，不同靶分子的分布符合泊松分布，通過對所有反應(yīng)室中的陽性結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計，可以做出目標(biāo)分子的精確定量。早期需稀釋加樣到96孔板、384孔板或1536孔板，依賴繁瑣的加樣工作。微流式PCR芯片的出現(xiàn)，大大節(jié)省了加樣工作，能將樣品分布于芯片上預(yù)制的20 000個微孔中，但微流控芯片昂貴且通量有限，且易分散不均勻而影響分析。時至2011年，Bio--Rad公司的微滴數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）技術(shù)推出，其原理是將樣品分成大小均一的20 000個“油包水”微滴進(jìn)行數(shù)字計數(shù)，生成的反應(yīng)體系在直接96孔板上進(jìn)行反應(yīng)，最多可同時檢測95個樣品，最終利用雙熒光通道檢測，對擴(kuò)增陽性油滴進(jìn)行計數(shù)，且分散效果更穩(wěn)定。傳統(tǒng)熒光定量PCR依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線，需要額外的標(biāo)準(zhǔn)品，且易受擴(kuò)增效率影響，而數(shù)字PCR用陽性結(jié)果數(shù)代替標(biāo)準(zhǔn)曲線，不僅減少了工作量和耗材，而且同時提供了定性和精確定量的結(jié)果，有利于數(shù)字化的分析。同時，單分子擴(kuò)增的環(huán)境，使目標(biāo)基因和參照基因可在獨立的環(huán)境中擴(kuò)增并獨立統(tǒng)計，能同時對兩個基因進(jìn)行精確定量，進(jìn)而基于目標(biāo)基因拷貝數(shù)／參照基因拷貝數(shù)得出精確的拷貝數(shù)定量，而qPCR的模板含量改變間接推算拷貝數(shù)變化，并非直接拷貝數(shù)改變定量，且僅能分辨1.5～2倍的變化。由于獨立的單分子擴(kuò)增，極大程度上降低了與目標(biāo)序列有競爭性作用的背景序列濃度，可從高度同源的背景中檢測出低至0.001%的突變［22］，大大提高稀有基因的檢測靈敏度。

Lun［23］的研究證實了數(shù)字PCR在目標(biāo)分子拷貝數(shù)定量的優(yōu)勢，利用相對突變劑量（relative mutation dosage，RMD）和SPRT算法能識別出野生型和突變型基因含量的不平衡，從而預(yù)測胎兒在目標(biāo)等位基因的基因型，是針對單基因病無創(chuàng)產(chǎn)前檢測的重要策略。Pornprasert在數(shù)字PCR平臺上分別定量，計算野生型、突變型基因的相對含量，能精確區(qū)分出Bart＇s水腫胎、標(biāo)準(zhǔn)型α-地中海貧血及正常人群，其結(jié)果也是符合預(yù)期，即在懷有Bart＇s水腫胎的孕婦血漿中，該比值為0，而懷有正常的胎兒的孕婦的比值相較于東南亞缺失型雜合的胎兒的比值顯著升高。此外，數(shù)字PCR是高通量測序之外有力的CNV分析工具，且可以在原始樣品上直接檢測，不僅工作量小，檢測周期短，也避免了高通量測序建庫時引入的誤差，以及測序深度、覆蓋度對于分析精度的影響［22］，有文獻(xiàn)報道，通過利用多重?zé)晒鈹?shù)字PCR檢測α-珠蛋白基因基因拷貝數(shù)來辨別常見的缺失型突變的方法［24］，對珠蛋白基因簇上多個位點進(jìn)行定量。盡管如此，目前這些工作主要在外周血基因組DNA中分析，應(yīng)用到無創(chuàng)產(chǎn)前診斷中仍然存在挑戰(zhàn)。其中，在高度片段化的cffDNA中，高度同源的序列，尤其是假基因的存在，仍會給引物的設(shè)計帶來困難，對拷貝數(shù)定量帶來干擾。

5 展望

無創(chuàng)產(chǎn)前診斷是直接獲取孕婦血漿中胎兒游離DNA進(jìn)行檢測的手段，相較于有創(chuàng)方法更安全、樣本獲得更方便、無并發(fā)癥、早期診斷、快速等優(yōu)點，是產(chǎn)期診斷中的重要研究方向，以實現(xiàn)胎兒的早期檢測、及早干預(yù)，避免患病胎兒出生。而地中海貧血作為中國南方最主要的單基因遺傳病，其無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的實施具有重大意義?，F(xiàn)時的技術(shù)難題包括：①cff DNA濃度低，尤其是孕早期，有賴于高靈敏的檢測方法；②排除法診斷僅能避免50%的介入診斷手段；③cf DNA是高度片段化的，富集、檢測仍存在挑戰(zhàn)。而數(shù)字PCR平臺能夠在復(fù)雜的孕婦血漿DNA背景中檢測出微量的胎兒基因，可靈敏地檢測出胎兒特異點突變。高通量測序、數(shù)字PCR是“數(shù)字化”定量目標(biāo)分子的平臺，從單分子層面同時對大量DNA分子進(jìn)行分析，準(zhǔn)確度優(yōu)于傳統(tǒng)分析平臺，從而在較低的胎兒濃度下進(jìn)行精確的差異分析。而微滴數(shù)字PCR在檢測時間和檢測成本上都優(yōu)于高通量測序，且相比高通量測序不受測序深度、覆蓋度、均一性影響，不僅分析更簡便，對突變的識別和計數(shù)更具優(yōu)勢，理論上可精確到單個突變分子的檢測。目前已有文獻(xiàn)報道利用數(shù)字PCR在多種點突變?yōu)橹鞯膯位虿〉臒o創(chuàng)產(chǎn)前診斷，但在缺失型突變的檢測上仍然是困難的。同時，需要明確，數(shù)字PCR和傳統(tǒng)PCR方法一樣，只能針對常見的突變和缺失，對于新的突變或罕見突變和缺失的檢測仍存在障礙，需要逐步摸索完善方法學(xué)。但隨著新方法的普及和大樣本臨床研究的推行，方法學(xué)的探索將逐漸成熟，地中海貧血的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷有望走入臨床應(yīng)用。

［1］ Lai K，Huang G，Su L，et al.The prevalence of thalassemia in mainland China：evidence from epidemiological surveys［J］.Sci Rep，2017，7（1）：920.

［2］ Akolekar R，Beta J，Picciarelli G，et al.Procedure-related risk of miscarriage following amniocentesis and chorionic villus sampling：a systematic review and meta-analysis［J］.Ultrasound Obstet Gynecol，2015，45（1）：16-26.

［3］ Bianchi DW，F(xiàn)lint AF，Pizzimenti MF，et al.Isolation of fetal DNA from nucleated erythrocytes in maternal blood［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1990，87（9）：3279-3283.

［4］ Troeger C，Zhong XY，Burgemeister R，et al.Approximately half of the erythroblasts in maternal blood are of fetal origin［J］.Mol Hum Reprod，1999，5（12）：1162-1165.

［5］ Lo YM，Corbetta N，Chamberlain PF，et al.Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum［J］.Lancet，1997，350（9076）：485-487.

［6］ Lo YM，Tein MS，Lau TK，et al.Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum：implications for noninvasive prenatal diagnosis［J］.Am J Hum Genet，1998，62（4）：768-775.

［7］ Chan KC，Zhang J，Hui AB，et al.Size distributions of maternal and fetal DNA in maternal plasma［J］.Clin Chem，2004，50（1）：88-92.

［8］ Lo YM，Chan KC，Sun H，et al.Maternal plasma DNA sequencing reveals the genome-wide genetic and mutational profile of the fetus［J］.Sci Transl Med，2010，2（61）：61r-91r.

［9］ Lo YM，Zhang J，Leung TN，et al.Rapid clearance of fetal DNA from maternal plasma［J］.Am J Hum Genet，1999，64（1）：218-224.

［10］ Lo YM.Fetal RhD genotyping from maternal plasma［J］.Ann Med，1999，31（5）：308-312.

［11］ Randen I，Hauge R，Kjeldsen-Kragh J，et al.Prenatal genotyping of RHD and SRY using maternal blood［J］.Vox Sang.2003，85（4）：300-306.

［12］ Drury S，Mason S，Mckay F，et al.Implementing Non-Invasive Prenatal Diagnosis（NIPD）in a National Health Service Laboratory；From Dominant to Recessive Disorders［J］.Adv Exp Med Biol，2016，924：71-75.

［13］ Chiu RW，Chan KC，Gao Y，et al.Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2008，105（51）：20458-20463.

［14］ Taylor-Phillips S，F(xiàn)reeman K，Geppert J，et al.Accuracy of non-invasive prenatal testing using cell-free DNA for detection of Down，Edwards and Patau syndromes：a systematic review and meta-analysis［J］.BMJ Open，2016，6（1）：e10002.

［15］ Chiu RW，Lau TK，Leung TN，et al.Prenatal exclusion of beta thalassaemia major by examination of maternal plasma［J］.Lancet，2002，360（9338）：998-1000.

［16］ Tungwiwat W，F(xiàn)ucharoen S，F(xiàn)ucharoen G，et al.Development and application of a real-time quantitative PCR for prenatal detection of fetal alpha（0）-thalassemia from maternal plasma［J］.Ann N Y Acad Sci，2006，1075：103-107.

［17］ Long XJ，Long GF，Lin WX.Noninvasive prenatal diagnosis of Hb Bart＇s hydrops fetus using cell-free fetal DNA in maternal plasma［J］.Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi，2009，30（3）：175-178.

［18］ Ho SS，Chong SS，Koay ES，et al.Noninvasive prenatal exclusion of haemoglobin Bart＇s using foetal DNA from maternal plasma［J］.Prenat Diagn，2010，30（1）：65-73.

［19］ Yan TZ，Mo QH，Cai R，et al.Reliable detection of paternal SNPs within deletion breakpoints for non-invasive prenatal exclusion of homozygous alpha-thalassemia in maternal plasma［J］.PLoS One，2011，6（9）：e24779.

［20］ Ge H，Huang X，Li X，et al.Noninvasive prenatal detection for pathogenic CNVs：the application in alpha-thalassemia［J］.PLoS One，2013，8（6）：e67464.

［21］ Wang W，Yuan Y，Zheng H，et al.A Pilot Study of Noninvasive Prenatal diagnosis of alpha-and beta-thalassemia with target capture sequencing of cell-free fetal DNA in maternal blood［J］.Genet Test Mol Biomarkers，2017，21（7）：433-439.

［22］ Hindson BJ，Ness KD，Masquelier DA，et al.High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number［J］.Anal Chem，2011，83（22）：8604-8610.

［23］ Lun FM，Tsui NB，Chan KC，et al.Noninvasive prenatal diagnosis of monogenic diseases by digital size selection and relative mutation dosage on DNA in maternal plasma［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2008，105（50）：19920-19925.

［24］ Lee TY，Lai MI，Ramachandran V，et al.Rapid detection of alpha-thalassaemia variants using droplet digital PCR［J］.Int J Lab Hematol，2016，38（4）：435-443.