盧建 侯亞萍 黃偉偉 李怡 周偉寧 尹愛華

（廣東省婦幼保健院 醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣東 廣州 511442）

染色體非整倍體異常是造成我國出生缺陷的主要原因之一。常見的染色體非整倍體異常主要涉及21、18、13、X和Y染色體，且發(fā)病率相對(duì)較髙。目前對(duì)于這類染色體非整倍體異常造成的疾病尚無有效的治療方法，及時(shí)通過產(chǎn)前篩查和診斷檢出異常胎兒成為預(yù)防此類出生缺陷的唯一有效途徑。自20世紀(jì)90年代起，我國逐漸采用孕中期（15～20周）血清學(xué)標(biāo)記物對(duì)21-三體和18-三體進(jìn)行產(chǎn)前篩查，并取得了一定效果，但這一篩查方法假陽性率和假陰性率均較高，導(dǎo)致了過度產(chǎn)前診斷和漏診的風(fēng)險(xiǎn)。近年來，母體外周血中胎兒游離DNA的發(fā)現(xiàn)［1］和新一代基因測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用，特別是大規(guī)模平行測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展，為無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)胎兒染色體非整倍體異常開辟了新的發(fā)展方向［2］。目前，無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)技術(shù)（non-invasive prenatal testing，NIPT）以其無創(chuàng)性、髙準(zhǔn)確性等優(yōu)勢(shì)越來越廣泛地應(yīng)用于臨床。本研究對(duì)近兩年于本院因無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)陽性并進(jìn)一步行產(chǎn)前診斷孕婦的診斷結(jié)果進(jìn)行回顧性分析，總結(jié)NIPT陽性結(jié)果進(jìn)行有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷符合率情況，為遺傳咨詢提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2015年4月至2017年4月因無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)（NIPT）結(jié)果陽性于本院進(jìn)一步行產(chǎn)前診斷的471例孕婦，其中11例為雙胎妊娠。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 對(duì)NIPT陽性孕婦進(jìn)行產(chǎn)前遺傳咨詢，在知情同意原則下行介入性手術(shù)，采集羊水或臍血標(biāo)本進(jìn)行產(chǎn)前診斷。

1.2.2 QF-PCR 在21、18、13、X和 Y 染色體上選擇22個(gè)STR位點(diǎn)進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物通過3500xl遺傳分析儀（美國LIFE公司）進(jìn)行毛細(xì)管電泳，檢測(cè)結(jié)果應(yīng)用GeneScan3.7軟件進(jìn)行分析處理，根據(jù)峰圖形式進(jìn)行結(jié)果判斷。STR位點(diǎn)信息及PCR反應(yīng)條件具體參見文獻(xiàn)［3］。

1.2.3 核型分析 按照常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，制片，G顯帶，參照ISCN（2009）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行核型分析。

1.2.4 染色體微陣列分析（CMA） 使用QIAGEN公司生產(chǎn)的Qiamp DNA Blood Mini Kit進(jìn)行基因組DNA的提取，使用美國昂飛公司生產(chǎn)的cyto 750k芯片進(jìn)行CMA檢測(cè)，嚴(yán)格按照試劑操作說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果使用Chromosome Analysis Suite（Ch AS；version 3.0.0.15）軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 NIPT結(jié)果與有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷結(jié)果比較 471例NIPT陽性孕婦中，其中21-三體232例、18-三體83例、13-三體45例、性染色體異常77例、其他染色體異常34例；通過有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷發(fā)現(xiàn)21、18、13及性染色體NIPT假陽性率分別為7.33%、25.30%、51.11%和51.95%；其他染色體NIPT假陽性率為91.85%（表1）。

2.2 CMA結(jié)果 81例核型結(jié)果正常和3例核型分析提示染色體結(jié)構(gòu)異常胎兒則在知情同意下選擇CMA進(jìn)一步診斷，發(fā)現(xiàn)7例CMA結(jié)果異常（表2），其中3例核型分析結(jié)果與CMA結(jié)果一致，且與NIPT提示異常相符，4例核型分析結(jié)果提示正常。

表1 471例NIPT檢測(cè)陽性病例產(chǎn)前診斷結(jié)果及假陽性率

表2 CMA檢測(cè)陽性結(jié)果

3 討論

近年來，采用無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)（NIPT）技術(shù)篩查胎兒染色體非整倍體異常已廣泛應(yīng)用于臨床，但由于其存在一定比例的假陽性率和假陰性率，目前僅可作為篩查手段，尚不能用于診斷。本研究發(fā)現(xiàn)NIPT陽性孕婦進(jìn)一步有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷符合率分別為21-三體92.7%（215／232）、18-三體74.7%（62／83）、13-三體48.9%（22／45）、性染色體異常48.1%（37／77），其他染色體異常8.8%（3／34），與文獻(xiàn)報(bào)道基本相符（表3）。由于文獻(xiàn)報(bào)道中的13-三體及其他染色體異常高風(fēng)險(xiǎn)陽性例數(shù)較少，導(dǎo)致不同文獻(xiàn)中這兩類異常陽性符合率跨度較大，而本研究中這兩類異常陽性例數(shù)較多，因此也相對(duì)更加接近真實(shí)符合率。

表3 本研究無創(chuàng)陽性結(jié)果產(chǎn)前診斷符合率與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比較

由于染色體核型分析技術(shù)耗時(shí)較長(zhǎng)，為緩解NIPT高風(fēng)險(xiǎn)孕婦的焦慮情緒，我們?cè)趯?duì)孕婦進(jìn)行產(chǎn)前診斷的同時(shí)采用QF-PCR技術(shù)對(duì)常見的13、18、21號(hào)染色體和性染色體數(shù)目異常進(jìn)行快速診斷以獲得初步結(jié)果。從本研究可以看出，QF-PCR對(duì)13、18、21號(hào)染色體非整倍體和性染色體數(shù)目異常檢測(cè)結(jié)果與核型分析結(jié)果符合率為99.4%（334／336），2例不一致結(jié)果均是染色體非平衡結(jié)構(gòu)異常導(dǎo)致｛1 例為18 衍生染色體 ［46，XN，der（18）t（18；？）（p？11.32；？）］；1例為X衍生染色體攜帶者［46，X，der（X）t（X；？）（p22.3；？）］，進(jìn)一步 CMA 檢測(cè)提示為14號(hào)和X染色體的非平衡易位｝，超出了QF-PCR的檢測(cè)范圍。因此，當(dāng)NIPT提示高風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，QF-PCR結(jié)果提示為相應(yīng)染色體非嵌合型三體時(shí)，提前做出臨床處置是可行的；但當(dāng)QF-PCR提示為嵌合體或與NIPT結(jié)果不相符時(shí)，則建議等待染色體核型分析結(jié)果，再做進(jìn)一步處理。

NIPT結(jié)果假陽性原因很多，主要有限制性胎盤嵌合［8，9］、孕婦本身存在拷貝數(shù)變異［10］、孕婦本身染色體嵌合［11］和雙胎之一胚胎停育［12］等。因此對(duì)于NIPT假陽性病例，進(jìn)一步的CMA檢測(cè)可幫助解釋導(dǎo)致假陽性的可能原因及發(fā)現(xiàn)一些核型分析無法發(fā)現(xiàn)的染色體微缺失微重復(fù)。一些多中心研究［13］，對(duì)于核型結(jié)果正常樣本中，如果產(chǎn)前超聲提示異常，CMA可檢出6.5% （201／3090）的陽性率；對(duì)于高齡孕婦，其CMA陽性率是1.0%（50／5108）；其他因素如血清學(xué)篩查陽性、焦慮、染色體異常生育史等，其陽性率是1.1%（44／4164）。因此對(duì)于NIPT陽性核型分析正常孕婦，如存在超聲異常根據(jù)相關(guān)指南應(yīng)建議進(jìn)一步進(jìn)行CMA檢測(cè)［14］；其他因素如血清學(xué)篩查陽性、高齡等原因，如核型檢測(cè)正常，進(jìn)一步CMA檢測(cè)雖可以增加約1%的檢出率，但同時(shí)會(huì)有約1%～2%臨床意義不明CNV檢出率［15，16］，對(duì)于這類人群是否進(jìn)行CMA檢測(cè)存在爭(zhēng)議，因此檢測(cè)前充分的遺傳咨詢必不可少。本研究中發(fā)現(xiàn)的1例NIPT 21-三體高風(fēng)險(xiǎn)假陽性是由于孕婦和胎兒均存在21號(hào)染色體微重復(fù)而導(dǎo)致；1例NIPT 16-三體高風(fēng)險(xiǎn)假陽性病例發(fā)現(xiàn)胎兒16號(hào)染色體存在大片段的雜合性缺失，考慮為部分型UPD（16），從單親二體產(chǎn)生原因推測(cè)造成NIPT 16-三體高風(fēng)險(xiǎn)的原因可能是胎盤中尚存在16-三體細(xì)胞系。另外，本研究中1例NIPT提示性染色體數(shù)目偏多孕婦，CMA檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)胎兒性染色體異常，而發(fā)現(xiàn)胎兒1號(hào)染色體存在一處臨床意義不明CNV，進(jìn)而檢測(cè)胎兒父母時(shí)，發(fā)現(xiàn)胎兒母親為X三體，這一結(jié)果提醒臨床醫(yī)生在NIPT提示性染色體異常高風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，要考慮到可能孕婦本身性染色體異常，從而造成NIPT檢測(cè)結(jié)果假陽性的可能。

對(duì)于雙胎妊娠病例進(jìn)行NIPT篩查的數(shù)據(jù)尚不充足，因此需要謹(jǐn)慎選擇使用［17］，但目前的一些研究發(fā)現(xiàn)NIPT對(duì)于雙胎妊娠仍有較好檢出率［18，19］。本研究中有11例雙胎孕婦，NIPT提示6例21-三體高風(fēng)險(xiǎn)、3例18-三體高風(fēng)險(xiǎn)、1例性染色體異常高風(fēng)險(xiǎn)和1例其他染色體異常高風(fēng)險(xiǎn)。其中21-三體和18-三體高風(fēng)險(xiǎn)孕婦均被染色體核型分析證實(shí)雙胎之一染色體異常；性染色體和其他染色體異常高風(fēng)險(xiǎn)孕婦雙胎染色體核型分析結(jié)果均正常。這些結(jié)果說明，NIPT對(duì)雙胎妊娠仍有較高的檢出率，但由于總例數(shù)較少，尚不能確定NIPT在雙胎妊娠與單胎妊娠中產(chǎn)前診斷符合率的差別。

綜上所述，無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)（NIPT）作為一種新的篩查技術(shù)，相較傳統(tǒng)的血清學(xué)篩查具有較高的檢測(cè)敏感性和特異性，可大大降低有創(chuàng)產(chǎn)前診斷例數(shù)，減少過度產(chǎn)前診斷。但由于循環(huán)游離DNA（cell free DNA，cfDNA）主要來源于胎盤絨毛的滋養(yǎng)層細(xì)胞，后者并不總是能代表胎兒情況，導(dǎo)致該技術(shù)尚存在一定的假陽性率，因此NIPT提示高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦仍需進(jìn)一步行有創(chuàng)產(chǎn)前診斷來進(jìn)行確診［20］。

［1］ Lo YM，Corbetta N，Chamberlain PF，et al.Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum［J］.Lancet，1997，350（9076）：485-487.

［2］ Chiu RW，Chan KC，Gao Y，et al.Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma［J］.Proc Natl AcadSci USA，2008，105（51）：20458-20463.

［3］ 盧建，杜麗，李海霞，等.應(yīng)用QF-PCR技術(shù)對(duì)3075例常見染色體非整倍體快速產(chǎn)前診斷結(jié)果分析［J］.熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2012，12（9）：1083-1085，1099.

［4］ 張玢，劉建兵，張曉青，等.高通量基因測(cè)序產(chǎn)前篩查技術(shù)在常州地區(qū)的臨床應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)總結(jié)［J／CD］.中國產(chǎn)前診斷雜志（電子版），2016，8（3）：25-30.

［5］ 楊潔霞，郭芳芳，彭海山，等.無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)技術(shù)在胎兒染色體非整倍體篩查中的應(yīng)用研究［J／CD］.中國產(chǎn)前診斷雜志（電子版），2016，8（3）：31-34.

［6］ 吳琦嫦，孫麗，許亞松，等.廈門地區(qū)11118例無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)結(jié)果回顧性分析［J］.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2017，25（1）：31-33.

［7］ 林穎，胡平，馬定遠(yuǎn)，等.胎兒常見染色體非整倍體無創(chuàng)基因檢測(cè)結(jié)果分析與遺傳咨詢［J］.中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2014，31（5）：672-673.

［8］ Choi H，Lau TK，Jiang FM，et al.Fetal aneuploidy screening by maternal plasma DNA sequencing：“False positive”due to confined placental mosaicism［J］.Prenat Diagn，2013，33：198-200.

［9］ Crooks K，Edwardsen G，O＇Connor S，et al.Cell-free DNA testing in a trisomy 21 pregnancy with confined placental mosaicism for a cell line with trisomy for both chromosomes 18 and 21［J］.Clin Case Reports，2016，4：19-22.

［10］ Snyder MW，Simmons LE，Kitzman JO，et al.Copy-number variation and false positive prenatal aneuploidy screening results［J］.N Engl J Med，2015，372：1639-1645.

［11］ Wang YL，Chen Y，Tian F，et al.Maternal mosaicism is a significant contributor to discordant sex chromosomal aneuploidies associated with noninvasive prenatal testing［J］.Clin Chem，2014，60：1 251-259.

［12］ Gr?mminger S，Yagmur E，Erkan S，et al.Fetal aaneuploidydetection by cell-free DNA sequencing for multiple pregnancies and quality issues with vanishing twins［J］.J Clin Med，2014，3：679-692.

［13］ Callaway JL，Shaffer LG，Chitty LS，et al.The clinicalutility of microarray technologies applied to prenatal cytogenetics in thepresence of a normal conventional karyotype：a review of the literature［J］.Prenat Diagn，2013，33：1119-1123.

［14］ 染色體微陣列分析技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用協(xié)作組.染色體微陣列分析技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用專家共識(shí)［J］.中華婦產(chǎn)科雜志，2014，49（8）：570-572.

［15］ Hillman SC，Mc Mullan DJ，Hall G，et al.Use of prenatal chromosomal microarray：prospective cohort study and systematic review and meta analysis［J］.Ultrasound Obstet Gynecol，2013，41：610-620.

［16］ Shaffer LG，Dabell MP，F(xiàn)isher AJ，et al.Experience with microarray based comparative genomic hybridization for prenatal diagnosis in over 5000 pregnancies［J］.Prenat Diagn，2012，32：976-985.

［17］ 劉俊濤，周希亞.雙胎妊娠非整倍體異常的產(chǎn)前篩查與產(chǎn)前診斷［J］.中國實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志，2015，31（7）：607-609.

［18］ Fosler L，Winters P，Jones KW，et al.Aneuploidy screening by non-invasive prenatal testing in twin pregnancy［J］.Ultrasound Obstet Gynecol，2017，49（4）：470-477.

［19］ Huang X，Zheng J，Chen M，et al.Noninvasive prenatal testing of trisomies 21 and 18 by massively parallel sequencing of maternal plasma DNA in twin pregnancies［J］.Prenat Diagn，2014，34（4）：335-340.

［20］ 李旭紅，尚麗新.83例妊娠中期胎兒出生缺陷分析［J／CD］.發(fā)育醫(yī)學(xué)電子雜志，2017，5（4）：244-247.