王 蔚 杜 淵 白 雪 楊思進

西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院 646000 四川瀘州市春暉路16號

·實驗研究·

蛭龍活血通瘀膠囊對腦出血大鼠腦組織AQP－4、MMP－9及TIMP－1蛋白表達的影響

王 蔚 杜 淵 白 雪 楊思進

西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院 646000 四川瀘州市春暉路16號

目的：觀察蛭龍活血通瘀膠囊對腦出血大鼠腦組織AQP－4、MMP－9、TIMP－1蛋白表達的影響，探討蛭龍活血通瘀膠囊對腦組織的保護作用機制。方法：將45只SD大鼠隨機分為5組：假手術組，模型組，蛭龍活血通瘀膠囊高、中、低劑量組，各組又分為12 h、48 h、72 h 3個亞組。采用自體尾部血注入法制備腦出血大鼠模型，Western blot法檢測AQP－4、MMP－9、TIMP－1蛋白的表達。結果：與模型組比較，蛭龍活血通瘀膠囊各劑量組AQP－4、MMP－9蛋白表達均有不同程度的降低，TIMP－1蛋白表達均有不同程度的升高，具有顯著性差異（P＜0.01）；蛭龍活血通瘀膠囊各劑量組之間比較，低、中劑量組在各時間點腦組織AQP－4、MMP－9、TIMP－1蛋白表達與高劑量組差異有顯著性意義（P＜0.01）。結論：蛭龍活血通瘀膠囊能夠明顯降低腦出血大鼠腦組織AQP－4、MMP－9蛋白的表達，并升高TIMP－1蛋白的表達，該作用存在一定的量效關系，蛭龍活血通瘀膠囊高劑量組作用最為明顯。

蛭龍活血通瘀膠囊；腦出血；AQP－4；MMP－9；TIMP－1；實驗研究

腦出血是常見的內(nèi)科急癥，臨床病理研究證實，腦出血急性期惡化和死亡的主要原因是腦水腫及出血［1］。腦出血后在出血區(qū)域形成血腫，對周圍腦組織造成壓迫，引起顱內(nèi)的急性占位效應，并對周圍的腦組織產(chǎn)生進一步的損害，因此腦水腫被認為是腦出血后最重要的繼發(fā)性病理變化之一。研究表明，水通道蛋白－4（aquaporins－4，AQP－4）、基質(zhì)金屬蛋白酶－9（matrix metalloproteinase－9，MMP－9）、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinase－1，TIMP－1）與腦水腫密切相關，參與了多種疾病所引起的腦水腫的病理過程［2－4］。蛭龍活血通瘀膠囊具有益氣活血、化瘀通絡功效，本實驗觀察其對大鼠腦出血后腦組織AQP－4、MMP－9、TIMP－1蛋白表達的影響，旨為揭示其治療腦出血的作用機理?，F(xiàn)將結果報道如下。

1 實驗材料

1.1 動物 清潔級雄性健康SD大鼠45只，體重250～300 g，由西南醫(yī)科大學動物實驗中心提供，實驗動物使用許可證號為SYXK（川）2013－065。動物按照每籠5只進行飼養(yǎng)，室溫22±2℃，濕度30%～40%，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由攝食及飲水。

1.2 藥物及試劑 蛭龍活血通瘀膠囊由黃芪、水蛭、地龍、大血藤、桂枝等藥物組成，規(guī)格為每粒0.4 g，相當于每粒含生藥2.625 g，由西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供，批號為20151201；兔抗AQP－4多克隆抗體 （Santa Cruze，Sc－20812）；兔抗MMP－9多克隆抗體（proteintech，10375－2－AP）；鼠抗TIMP－1單克隆抗體（Minipore，MAB3300）；蛋白 marker（Thermo fermentas，SM0431）；β－action抗體（中杉金橋，TA－09）；G250考馬斯亮藍溶液（上海生工，A602151－0250）；Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate（曝光液，Minipore，WBKLS0100）。

1.3 儀器 大鼠腦立體定位儀（安徽正華生物儀器設備有限公司）；Thermo 991－80℃超低溫冰箱（美國賽默飛世爾）；IMS－40全自動雪花制冰機（常熟雪珂電器有限責任公司）；KJ201－BS型震蕩器（江蘇康健醫(yī)療用品有限公司）；DYY－10C電泳儀（北京六一儀器廠）；Y－SPCT型水平電泳槽（北京君藝東方）；BioMate 3S紫外分光光度計（美國Thermo Fisher Lab－Serv）；ChemiDoc XRS凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio－Rad）。

2 方法

2.1 動物分組與造模 將45只SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為5組：假手術組，模型組，蛭龍活血通瘀低、中、高劑量組（分別簡稱為“ZL低劑量組”“ZL中劑量組”“ZL高劑量組”），每組9只。并按指標檢測的時間劃分為12 h、48 h、72 h 3個亞組，每亞組3只。大鼠術前禁食12 h，稱重麻醉后斷尾取尾部自體血50 μl。將大鼠用立體定位儀俯臥位固定，備皮消毒，暴露手術區(qū)域，沿頭皮正中縱行切開約10 mm，用30%雙氧水腐蝕骨膜，參照文獻［5］方法，并根據(jù)《腦立體定位圖譜》［6］進行尾殼核定位（矢狀縫右側旁開3.0 mm，前囟前0.2mm處），用微量進樣器按5μl/min的速度緩慢勻速注入自體血，留針15 min后緩慢退針，骨蠟封閉顱骨，縫合頭皮。假手術組只進針，不注血。參照文獻［7］“5分制法”對大鼠進行神經(jīng)功能缺損評分。以評分為1～3分認為造模成功，0分則認為造模失敗，4分和死亡大鼠均被剔除并根據(jù)分組進行相應補充。假手術組大鼠在術后清醒后無明顯神經(jīng)功能缺損癥狀，評分為0分。

2.2 給藥 大鼠麻醉自然蘇醒后進行灌胃。各藥物組均給予蛭龍活血通瘀膠囊藥物的等體積和相應的濃度進行灌胃。蛭龍活血通瘀膠囊成人的臨床用藥量為3.6 g/d，按照人體用量的5倍、10倍、20倍定為低、中、高劑量。成人體重按60 kg計算，換算成各藥物組大鼠的每日用藥量，分別為0.3 g/（kg·d）、0.6 g/（kg·d）、1.2 g/（kg·d）。大鼠的灌胃體積為3 ml，給藥次數(shù)為1次/日。模型組、假手術組給予等體積（3 ml）的生理鹽水灌胃，給藥次數(shù)同藥物組。

2.3 腦組織 AQP－4、MMP－9、TIMP－1蛋白的表達 采用蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）。稱取0.05 g腦組織提取蛋白，以考馬斯亮藍比色法測定蛋白濃度并經(jīng)凝膠染色檢測提取蛋白質(zhì)量。按照Western blot操作步驟：制膠→電泳→轉膜→封閉→一抗孵育→二抗孵育，孵育完畢用TBST緩沖液沖洗PVDF膜 3次，每次 5 min，將PVDF膜倒扣在曝光液中，約1 min后通過凝膠成像系統(tǒng)進行信號檢測。蛋白的相對表達量為蛋白灰度值與內(nèi)參β－actin灰度值的比值。

2.4 統(tǒng)計方法 應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（Oneway ANOVA），多重比較采用LSD及Dunnett法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 蛭龍活血通瘀膠囊對AQP－4蛋白的影響 見表1。

表1顯示，假手術組大鼠腦組織中有微量的AQP－4蛋白表達，在12 h、48 h及72 h的表達量無明顯差異（P＞0.05）；與假手術組相比，模型組及ZL低、中、高劑量組各時間點AQP－4蛋白的表達均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；模型組術后AQP－4蛋白表達呈進行性升高，72 h時最為顯著；與模型組相比，ZL各劑量組AQP－ 4蛋白表達均有不同程度的降低，具有顯著性差異（P＜0.01），其中以ZL高劑量組降低最為顯著，明顯低于ZL低、中劑量組（P＜0.01）。

表1 各組大鼠腦組織AQP－4蛋白相對表達量比較 （x±s）

3.2 蛭龍活血通瘀膠囊對MMP－9蛋白的影響 見表2。

表2 各組大鼠腦組織MMP－9蛋白相對表達量比較 （x±s）

表2顯示，假手術組大鼠腦組織中MMP－9蛋白有少量的表達，術后12 h、48 h及72 h時表達比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與假手術組比較，模型組及ZL低、中、高劑量組各時間點MMP－9蛋白表達均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；模型組腦組織MMP－9蛋白表達于術后48 h時達到高峰，72 h時略有下降；與模型組相比，ZL各劑量組MMP－9蛋白表達均降低，具有顯著性差異（P＜0.01），尤以ZL高劑量組下降最為顯著，明顯低于低、中劑量組（P＜0.01）。

3.3 蛭龍活血通瘀膠囊對TIMP－1蛋白的影響 見表3。

表3 各組大鼠腦組織TIMP－1蛋白相對表達量比較 （x±s）

表3顯示，假手術組大鼠腦組織中TIMP－1蛋白僅有微量的表達，且在術后12 h、48 h及72 h時的表達量比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與假手術組比較，模型組及ZL低、中、高劑量組大鼠各時間點TIMP－1蛋白表達均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；模型組大鼠腦組織TIMP－1蛋白表達在術后48 h時上升明顯并達到高峰，72 h時略有下降；與模型組相比，ZL各劑量組TIMP－1蛋白表達均有顯著升高，具有顯著性差異（P＜0.01），其中以ZL高劑量組升高最為顯著，明顯高于低、中劑量組（P＜0.01）。

4 討論

AQP－4又稱為汞不敏感水通道蛋白（mercury insensitive water channel，MIWC），是水通道蛋白家族中的一員［8］。AQP－4在中樞神經(jīng)系統(tǒng)分布上最顯著的特點是呈極性分布，具有高度選擇性［9］。AQP－4有兩個主要表達區(qū)域，一個是位于形成膠質(zhì)界膜的致密星形膠質(zhì)細胞足突上，其參與形成與腦脊液接觸的軟腦膜和室管膜的表面屏障；另一個是位于包繞血管周圍的星形膠質(zhì)細胞的足突上，并在與血管直接接觸的足突上呈極性分布［10］。AQP－4的這種分布特點提示其在維持大腦水的平衡中發(fā)揮了重要作用，AQP－4是膠質(zhì)細胞與腦脊液以及血管間的水調(diào)節(jié)和轉運的重要結構基礎［11］。研究表明［12］，腦出血后血腫周圍AQP－4表達的升高導致腦水腫加劇、血腦屏障通透性破壞、神經(jīng)功能缺損，提示AQP－4的動態(tài)變化與腦水腫、腦損傷發(fā)生發(fā)展過程密切相關。

MMP－9又被稱為明膠酶 B（gelatinase－B），是一種依賴金屬鋅離子的金屬酶，MMP－9參與組織發(fā)育與重構，胚胎形成，創(chuàng)傷修復，血管新生等多種生理過程［13］。近年的研究表明，MMP－9與腦血管疾病關系密切，在腦出血后腦水腫的形成和發(fā)展中發(fā)揮重要作用［3］。研究顯示，MMP－9定位于神經(jīng)元、血管內(nèi)皮細胞和膠質(zhì)細胞，在腦出血時MMP－9含量增加［14］。內(nèi)源性MMP－9來自星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞，外源性MMP－9來自內(nèi)皮細胞、滲出的中性粒細胞和巨噬細胞。MMP－9啟動后，可以通過降解細胞外基質(zhì)成分，從而對血腦屏障完整性造成破壞。在對腦組織、血漿、腦脊液和血腫抽吸液等MMPs蛋白水平的檢測結果發(fā)現(xiàn)［15－16］，MMP－9于出血后數(shù)小時開始升高，達到峰值后很快降低，與腦損害后腦水腫出現(xiàn)的高峰一致。

TIMP－1屬于基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子（Tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMPs）家族，是一類對基質(zhì)金屬蛋白酶（metalloproteinase，MMPs）活性進行抑制的生物大分子物質(zhì)［17］。TIMP－1的主要作用是抑制膠原酶的活性，同時抑制基質(zhì)分解素和明膠酶B（MMP－9）［18－19］。TIMP－1能夠抑制大部分的MMPs［20］。腦出血時MMPs被活化，打破了MMPs與TIMPs之間的動態(tài)平衡，進而促進了腦水腫的形成和腦細胞死亡［21］。TIMP－1與腦出血后腦水腫密切相關。王復新等［22］研究大鼠腦出血周邊組織MMP－9和TIMP－1表達對腦水腫的影響，結果發(fā)現(xiàn)腦出血后腦組織含水量于72 h達到高峰，EB含量在 48 h達到高峰，MMP－9和TIMP－1表達在48 h達到高峰，血腦屏障在各時間點均有破壞，提示腦出血后MMP－9表達可導致血腦屏障的通透性增加，而TIMP－1通過抑制MMP－9的表達以減輕腦水腫。

本研究結果顯示，腦出血模型大鼠在術后12 h、48 h及72 h腦組織中AQP－4、MMP－9、TIMP－1蛋白的表達均有明顯上升，其中，AQP－4蛋白表達呈進行性升高，在72 h時升高最為明顯，MMP－9、TIMP－1蛋白表達也有明顯升高，在48 h時上升明顯并達到高峰，在72 h時略有下降。而蛭龍活血通瘀膠囊低、中、高劑量干預組在術后12 h、48 h及72 h時大鼠腦組織AQP－4、MMP－9蛋白的相對表達量均有不同程度的下降，而TIMP－1蛋白的相對表達量有所升高，與模型組比較，均具有顯著性差異（P＜0.01）。結果顯示，蛭龍活血通瘀膠囊能夠明顯降低腦出血大鼠腦組織AQP－4、MMP－9蛋白的表達，同時升高TIMP－1蛋白的表達，且該作用存在一定的量效關系，ZL高劑量組作用最為明顯。蛭龍活血通瘀膠囊能夠下調(diào)AQP－4、MMP－9蛋白在腦組織的表達，上調(diào)TIMP－1蛋白的表達，因而具有腦保護作用。

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（2016－10－20收稿/編輯 陳明偉）

The Effect ofZhilonghuoxuetongyu（ZLHXTY）Capsule on the Protein Expression of AQP－4，MMP－9 and TIMP－1 in Brain Tissue in Rats after Cerebral Hemorrhage

Wang Wei Du Yuan Bai Xue Yang Sijin
The Affiliated TCM Hospital of Southwest Medical Hospital NO.16，Chunhui Road，Luzhou City，Sicuan

Objective：To observe the effect of Zhilonghuoxuetongyu（ZLHXTY）capsule on the protein expression of AQP－4，MMP－9 and TIMP－1 in brain tissue after cerebral hemorrhage in rats and to investigate the protective mechanism of ZLHXTY capsule on brain tissue.Methods：Forty－five SD rats were randomly divided into 5 groups：sham operation group，model group，ZLHXTY capsules of high，middle and low dose groups.Each group was divided into three subgroups of 12h，48h and 72h respectively.The rat model of cerebral hemorrhage was prepared by autologous tail blood injection.The expression of AQP－4，MMP－9 and TIMP－1 protein was detected by Western blot.Results：There were significant reductions to different degrees in the protein expression of AQP－4 and MMP－9 in ZLHXTY capsules of each dose group compared with that in the model group；The protein expression of TIMP－1 in ZLHXTY capsules of each dose group was significantly increased to different degrees compared with that in the model group（P＜0.01）.The protein expression of AQP－4，MMP－9 and TIMP－1 in brain tissue in ZLHXTY capsules of middle and low dose groups was significantly different from that in ZLHXTY capsules of high dose group（P＜0.01）.Conclusions：ZLHXTY capsule can significantly decrease the expression of AQP－4 and MMP－9 and increase the expression of TIMP－1 protein in brain tissue of rats with cerebral hemorrhage，which has a dose－effect relationship.The high dose group of ZLHXTY capsules has the most obvious effect.

Zhilonghuoxuetongyu（ZLHXTY）capsule；cerebral hemorrhage；AQP－4；MMP－9；TIMP－1；experimental research

R285.5

A

1003-0719（2016）06-0067-04

四川省科技廳項目（編號：2011SZ0322）