黃若干　裴澤建　黃平權(quán)　藍(lán)曉東　覃佩莉　梁杰敏　林海英　王小紅

【摘 要】 目的：提高九味補(bǔ)血口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用薄層色譜法對(duì)人參、絞股藍(lán)、黃芪進(jìn)行定性鑒別，采用HPLC法對(duì)五味子中五味子醇甲進(jìn)行定量分析。結(jié)果：人參與絞股藍(lán)、黃芪的薄層色譜均具有特征性的清晰斑點(diǎn)，陰性溶液無(wú)干擾；五味子醇甲在005100～15300μg范圍內(nèi)其峰面積與進(jìn)樣量呈良好的線性關(guān)系，平均加樣回收率為10097%（RSD=091%）。結(jié)論：研究建立的定性鑒別與定量分析方法靈敏、準(zhǔn)確，具有良好專屬性和重現(xiàn)性，更能有效控制九味補(bǔ)血口服液的質(zhì)量。

【關(guān)鍵詞】 九味補(bǔ)血口服液；人參；絞股藍(lán)；黃芪；五味子醇甲

【中圖分類號(hào)】R284 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2016）23-0016-04

九味補(bǔ)血口服液由人參、黃芪、絞股藍(lán)、當(dāng)歸等藥味組成，具有益氣補(bǔ)血、健脾益胃的功效。原標(biāo)準(zhǔn)只建立當(dāng)歸、甘草、陳皮的薄層色譜鑒別和正丁醇提取物測(cè)定方法，方中君藥人參、黃芪等均未建立有定性或定量的質(zhì)控指標(biāo)，為能更加有效控制本品質(zhì)量，實(shí)驗(yàn)開(kāi)展人參、黃芪、絞股藍(lán)薄層色譜鑒別研究和五味子中五味子醇甲HPLC測(cè)定研究。

1 儀器與材料

11 儀器 LC-10ATVP高效液相色譜儀（日本島津）。

12 材料 人參皂苷Rb1（批號(hào)：110704-200318）、人參皂苷Rg1（批號(hào)：110713-200322）、黃芪甲苷（批號(hào)：0781-200109）、五味子醇甲（批號(hào)：110857-201513）對(duì)照品、人參（批號(hào)：120917-200406）、絞股藍(lán)（批號(hào)：121311-200402）對(duì)照藥材均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定研究院；九味補(bǔ)血口服液（批號(hào)：131201、131202、131203，廣西盈康藥業(yè)有限責(zé)任公司）。乙腈、磷酸為色譜醇；水為純化水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

21 薄層色譜鑒別

211 人參和絞股藍(lán)的薄層鑒別 取本品30mL，加三氯甲烷30mL，振搖提取，分取上層溶液，用水飽和的正丁醇振搖提取3次（30mL，30mL，20mL），合并正丁醇提取液，用氨試液提取2次，每次50mL，再用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次50mL，分取正丁醇液，蒸干，殘?jiān)?0%乙醇5mL使溶解，通過(guò)D101型大孔吸附樹(shù)脂柱（內(nèi)徑15cm，長(zhǎng)12cm），用水50mL洗脫，棄去水洗脫液，再用40%乙醇30mL洗脫，棄去40%乙醇洗脫液，繼用70%乙醇50mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)眉状?mL使溶解，作為供試品溶液。另取人參對(duì)照藥材08g和絞股藍(lán)對(duì)照藥材2g，同法制備成對(duì)照藥材溶液；再取人參皂苷Rb1、Rg1對(duì)照品加甲醇制成每1mL各含1mg的對(duì)照品溶液。按處方比例制備缺人參、絞股藍(lán)的陰性樣品，同法制成陰性溶液。照薄層色譜法（中國(guó)藥典2015版四部通則0502）試驗(yàn)，吸取上述溶液各1～2μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶[KG-*3/5]7∶[KG-*3/5]2）10℃以下放置分層的下層溶液為展開(kāi)劑[1]8，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。置日光下檢視，供試品色譜中，分別與對(duì)照品、對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；置紫外光（365nm）下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照品、對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾。見(jiàn)圖1。

212 黃芪的薄層鑒別 取黃芪甲苷對(duì)照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。取211項(xiàng)的供試品溶液作為供試品溶液。按本品制法制備缺黃芪陰性樣品，同法制備陰性溶液。照薄層色譜法（中國(guó)藥典2015版四部通則0502）試驗(yàn)，吸取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性溶液各1～2μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以（正丁醇-乙酸乙酯-水（4∶1∶5）上層溶液）-甲醇（10∶1）[1]302為展開(kāi)劑，置氨氣飽和的層析缸內(nèi)，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性試驗(yàn)無(wú)干擾。見(jiàn)圖2。

22 五味子醇甲的含量測(cè)定[1]66

221 色譜條件及系統(tǒng)適用性 照中國(guó)藥典2015版四部通則0512高效液相色譜法，色譜柱為日本島津公司BDS C18柱（46mm×250mm，5μm）；以甲醇-水（60∶[KG-*3/5]40）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為250nm；理論板數(shù)按五味子醇甲峰計(jì)算應(yīng)不低于1500。

222 溶液的配制 ①對(duì)照品溶液制備：精密稱取五味子醇甲對(duì)照品適量，加甲醇制成每1mL含50μg的對(duì)照品溶液。②供試品溶液制備：精密量取本品10mL，置分液漏斗中，加水20mL，混勻，用乙酸乙酯振搖提取4次，每次30mL，合并乙酸乙酯液，置水浴上蒸干，殘?jiān)执渭蛹状歼m量使溶解并轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。③陰性樣品溶液制備：按標(biāo)準(zhǔn)處方工藝制備不含五味子的陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制備成陰性樣品溶液。

分別精密吸取上述溶液各10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，專屬性試驗(yàn)色譜圖見(jiàn)圖3、4、5。試驗(yàn)結(jié)果表明，供試品色譜圖中，在與對(duì)照品色譜圖相應(yīng)的位置有相應(yīng)的色譜峰出現(xiàn)，且該色譜峰和其他組分色譜峰分離度符合規(guī)定，陰性樣無(wú)干擾，說(shuō)明該方法的系統(tǒng)適用性和專屬性良好。

223 線性關(guān)系試驗(yàn) 精密稱取五味子醇甲對(duì)照品1275mg，置50mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液（含五味子醇甲02550mg/mL），精密量取該貯備液05mL、25mL、50mL、75mL、10mL、125mL、15mL分別置25mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取上述對(duì)照液各10μL注入液相色譜儀，結(jié)果峰面積分別為97065、497390、993624、1500990、2016087、2520814、3022343。以五味子醇甲峰面積（A）為橫坐標(biāo)，對(duì)照品進(jìn)樣量（μg）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=50460×10-7X -00047（r=09999，n=7）。結(jié)果五味子醇甲在005100～15300μg范圍之間線性關(guān)系良好。

224 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一批樣品的供試品溶液10μL注入液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄五味子醇甲色譜圖及峰面積，分別為1075998、1067577、1065693、1067843、1079951、1082658，平均峰面積1073287，RSD為067%（n=6），表明精密度良好，符合要求。

225 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品同一批號(hào)的樣品，照含量測(cè)定項(xiàng)下供試品溶液制備方法平行制備6份供試品溶液，在上述色譜條件下，精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算含量分別為5406、5379、5413、5384、5376、5425μg/mL，平均5397μg/mL，RSD為038%（n=6），說(shuō)明重復(fù)性良好。

226 穩(wěn)定性試驗(yàn) 照上述供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下，取該供試品溶液分別于0h、4h、8h、16h、24h測(cè)定峰面積，分別為1076001、1069854、1072581、1070732、1078765、1069781，平均1072952，RSD為034%。表明供試品溶液24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

226 加樣回收試驗(yàn) 取已知五味子醇甲含量的本品同一樣品（批號(hào)：131201，含量為5397μg/mL），精密量取5mL，加水25mL，共9份，分別精密加入對(duì)照品貯備液（濃度為01376mg/mL）1mL、2mL、3mL，低、中、高濃度各3份，照供試品溶液制備項(xiàng)下的方法處理、測(cè)定。結(jié)果表明，本法加樣回收率相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。結(jié)果見(jiàn)表1。

227 樣品的含量測(cè)定 按上述含量測(cè)定方法測(cè)定了本品10批樣品五味子醇甲的含量，結(jié)果分別為540、617、456、731、542、428、419、563、647、692μg/mL。

3 討論

31 人參中含有多種人參皂苷，絞股藍(lán)中主要含四環(huán)三萜皂苷，其中多種皂苷結(jié)構(gòu)與人參皂苷相同，如人參皂苷Rb1、Rd、Rb3和F2等[2]，為方便實(shí)驗(yàn)操作，故在預(yù)試驗(yàn)時(shí)就設(shè)計(jì)采用同一方法同時(shí)對(duì)這兩味藥材進(jìn)行薄層鑒別。在進(jìn)行人參、絞股藍(lán)薄層鑒別預(yù)試驗(yàn)摸索過(guò)程中，曾嘗試使用過(guò)（正丁醇-乙酸乙酯-水（4∶[KG-*3/5]1∶[KG-*3/5]5）上層溶液）-甲醇（10∶[KG-*3/5]1）、三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶[KG-*3/5]40∶[KG-*3/5]22∶[KG-*3/5]10）等展開(kāi)劑，但因制劑中含皂苷成分太多，分離效果均不夠理想，最終以三氯甲烷-甲醇-水（13∶[KG-*3/5]7∶[KG-*3/5]2）10℃以下放置分層的下層溶液為展開(kāi)劑最為理想，在此條件下，斑點(diǎn)能較好的分離且清晰圓整，Rf值適宜，方法簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性好。

32 《中國(guó)藥典》中黃芪使用黃芪甲苷作為對(duì)照品進(jìn)行薄層鑒別，我們也擬定采用黃芪甲苷作為本藥材的鑒定指標(biāo)。在進(jìn)行黃芪薄層鑒別預(yù)試驗(yàn)時(shí)，曾嘗試使用三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）的下層溶液、三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22∶10）10℃以下放置的下層液等展開(kāi)劑，分離效果均不夠理想，最終以（正丁醇-乙酸乙酯-水（4∶1∶5）上層溶液）-甲醇（10∶1）為展開(kāi)劑最為理想，此法重現(xiàn)性好，專屬性強(qiáng)。

33 在進(jìn)行本試驗(yàn)的含量測(cè)定方法摸索時(shí)，曾嘗試使用HPLC法對(duì)方中的人參、絞股藍(lán)建立含量測(cè)定方法，以人參皂苷Rb1、Rg1對(duì)照品為含測(cè)指標(biāo)，但陰性樣有干擾而無(wú)法建立。五味子醇甲含測(cè)方法流動(dòng)相經(jīng)選擇甲醇-水不同比例進(jìn)行比較，最終甲醇-水的比例為60∶40時(shí)主成分峰分離度、峰形最佳；五味子醇甲甲醇溶液在250nm處有最大吸收而選擇此波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)；對(duì)于供試品溶液的制備，曾選用乙醚、乙酸乙酯對(duì)樣品進(jìn)行萃取處理，結(jié)果乙醚萃取乳化嚴(yán)重，而乙酸乙酯萃取效果良好而被選用。

本試驗(yàn)對(duì)方中的人參、絞股藍(lán)、黃芪等藥味進(jìn)行定性鑒別和對(duì)五味子醇甲進(jìn)行定量測(cè)定，方法靈敏、準(zhǔn)確，具有較好專屬性和重現(xiàn)性，為九味補(bǔ)血口服液提升質(zhì)量控制方法提供具有參考價(jià)值的科學(xué)依據(jù)。從測(cè)定的10批樣品中五味子醇甲的含量來(lái)看，五味子醇甲的最低含量為419μg/mL，最高為731μg/mL。造成樣品中五味子醇甲含量高低不均的原因，應(yīng)該是五味子藥材不同批次之間因產(chǎn)地、采收季節(jié)、貯藏等因素的影響而使五味子醇甲含量存在差異性，因此在投料生產(chǎn)時(shí)要把好藥材質(zhì)量關(guān)，以保證制劑質(zhì)量的穩(wěn)定性。

參考文獻(xiàn)

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[2]國(guó)家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會(huì).中華本草[M].上海：上?？萍汲霭嫔?，1999：533.

（編輯：程鵬飛）