王英超++周智瑞++金紅++冉早紅

摘 要：利用超聲提取法和牛津杯抑菌法研究棗樹(shù)皮的抑菌效果。以大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌和遲緩愛(ài)德華菌為試驗(yàn)菌，對(duì)提取方法、抑菌方法、提取溶劑等條件分別進(jìn)行抑菌試驗(yàn)研究。結(jié)果表明：以70%乙醇為提取溶劑，超聲波提取法得到的提取液抑菌效果最好；牛津杯法的抑菌效果強(qiáng)于濾紙片法；金絲小棗的老樹(shù)皮的抑菌效果強(qiáng)于新樹(shù)皮。不同品種棗樹(shù)皮的抑菌效果大小為：金絲小棗老樹(shù)皮>紅棗老樹(shù)皮>馬牙棗老樹(shù)皮。金絲小棗老樹(shù)皮在大腸桿菌與溫和氣單胞菌中的最低抑菌濃度為7.5×10-4 g·mL-1，在枯草芽孢桿菌、嗜水氣單胞菌與遲緩愛(ài)德華菌中的最低抑菌濃度都為3.8×10-4 g·mL-1。棗樹(shù)皮提取物對(duì)5種菌有較強(qiáng)的抑菌效果。

關(guān)鍵詞：棗樹(shù)皮；超聲波提取；抑菌效果

中圖分類號(hào)：S665.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.12.009

Antibacterial Effect of Jujube Bark Extraction

WANG Yingchao1，ZHOU Zhirui 1，JIN Hong2，RAN Zaohong2

（1.College of Basic Science，Tianjin Agriculture University，Tianjin 300384，China；2. College of Agronomy and Resource Environment，Tianjin Agriculture University，Tianjin 300384，China）

Abstract：The way of study on bacteriostatic effect of jujube bark extract was ultrasonic extraction and Oxford cup bacteriostaswas. The E. coli， Bacillus subtilwas， Aeromonas hydrophila， Aeromonas sobria and Edwardsiella tarda were selected as the experimental bacteria. The extraction methods， antimicrobial methods， extraction solvents and other conditions were studied respectively. The results showed that the concentration of 70% ethanol as extraction agent， the extract obtained by ultrasonic extraction method had the best bacteriostastic effect. By Oxford cup method， the bacteriostatic effect was better than that of filter method. Gold thread jujube old bark bacteriostaswas effect was stronger than the new bark. Gold thread jujube old bark bacteriostaswas effect in different jujube bark bacteriostaswas effect was the strongest， followed by red dates tree bark， the weakest was Maya jujube tree bark. Gold thread jujube old bark for the minimal inhibitory concentrations （MIC） of E. coli and Aeromonas sobria was 7.5 × 10-4 g·mL-1， for Bacillus subtilwas， Aeromonas hydrophila and Edwardsiella tarda minimal inhibitory concentrations （MIC） was 3.8 × 10-4 g·mL-1. Jujube peel extract had strong inhibitory effect on 5 kinds of bacteria.

Key words： jujube tree bark； ultrasonic extraction； antibacterian effect

棗樹(shù)皮作為一味中藥歷史悠久。在《本草綱目》的記載中，棗樹(shù)皮可以外敷用來(lái)治療由于燒灼而造成的燒傷與外傷出血，內(nèi)服可以收斂止瀉、鎮(zhèn)咳[1-2]。目前對(duì)棗樹(shù)的研究主要集中于棗的果肉部分及樹(shù)皮中的真菌[3-10]，鮮見(jiàn)利用棗樹(shù)皮提取物進(jìn)行抑菌效果研究。本試驗(yàn)以70%濃度的乙醇為提取溶劑，通過(guò)超聲波法提取棗樹(shù)皮有效成分，用牛津杯法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)探究其抑菌效果，以期為棗樹(shù)皮的開(kāi)發(fā)利用提供參考，也為新的植物源抑菌劑的研究開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料和方法

1.1 材 料

棗樹(shù)皮：金絲小棗樹(shù)皮取自河北滄州棗園。馬牙棗、紅棗樹(shù)皮取自靜?？h子牙鎮(zhèn)棗園。用清水洗凈樹(shù)皮后，60 ℃烘干，粉碎過(guò)孔徑0.21 mm的篩備用。

菌種：天津農(nóng)學(xué)院生化實(shí)驗(yàn)室保存，包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌和遲緩愛(ài)德華菌。

1.2 試 劑

乙酸乙酯、濃鹽酸、氫氧化鈉（粒狀）、氯化鈉購(gòu)自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；牛肉蛋白胨購(gòu)自天津艾勒科技有限公司；酵母浸粉購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；瓊脂粉購(gòu)自上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；無(wú)水乙醇購(gòu)自天津市華東試劑廠。

1.3 儀 器

DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海恒科技有限公司；YS-08型粉碎機(jī)，北京燕山正德機(jī)械設(shè)備有限公司；BSA223S型電子天平，賽多利斯（北京）科學(xué)儀器有限公司；P180H型超聲波清洗器，Elma-Hans Schmidbauer GmbH； L550型臺(tái)式低速離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.4 方 法

1.4.1 菌種的活化及菌懸液的制備 將保存的5個(gè)菌種活化于固體斜面培養(yǎng)基上。大腸桿菌與枯草芽孢桿菌放在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌與遲緩愛(ài)德華菌放在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24～48 h后活化完成。將活化好的菌種，用無(wú)菌水稀釋至菌懸液的濃度為105～106 CFU·mL-1備用。

1.4.2 棗樹(shù)皮提取物的制備 將棗樹(shù)皮按料液比1∶15（g·mL-1）加入70%的乙醇進(jìn)行超聲提取。超聲功率266 W、60 ℃下提取60 min。提取結(jié)束后，4 000 r·min-1離心10 min，將上清液過(guò)濾后減壓旋蒸，收集提取物粉末備用。

1.4.3 不同提取方法對(duì)抑菌效果的影響 （1）浸提法：取金絲小棗樹(shù)皮粉末，按1∶15料液比（g·mL-1）加入70%乙醇，60 ℃下浸提48 h。（2）水浴回流法：取金絲小棗樹(shù)皮粉末，按1∶15料液比（g·mL-1）加入70%乙醇，60 ℃下水浴回流6 h。（3）超聲波提取法：取金絲小棗樹(shù)皮粉末，按1∶15料液比（g·mL-1）加入70%乙醇。超聲功率266 W，60 ℃下超聲提取60 min。取上述3種方法得到的上清液分別過(guò)0.22 μm的有機(jī)濾膜過(guò)濾除菌，以牛津杯法做抑菌實(shí)驗(yàn)，比較不同提取方法下的抑菌效果。

1.4.4 不同抑菌方法的比較 （1）牛津杯法（牛津杯的內(nèi)徑為7.5 mm）。將大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌和遲緩愛(ài)德華菌用1.4.1的方法制備成菌懸液。用移液槍吸取100 μL菌懸液于LB培養(yǎng)基上，涂布均勻放上牛津杯，靜置1 h。待牛津杯底部與培養(yǎng)基表面緊密貼合后，再用移液槍吸取棗樹(shù)皮提取液于牛津杯中。放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察抑菌效果。

（2）濾紙片法。將濾紙片用7.5 mm內(nèi)徑的打孔器制成小圓片，經(jīng)過(guò)濕熱滅菌后放入棗樹(shù)皮提取液中浸泡48 h后備用。將5種菌涂布在培養(yǎng)基上，將蘸有提取物的濾紙圓片放在培養(yǎng)基表面。放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察抑菌效果。用牛津杯法與濾紙片法分別做3次平行試驗(yàn)，根據(jù)抑菌圈大小比較兩種方法的抑菌效果。

1.4.5 不同提取溶劑對(duì)抑菌效果的影響 選取水、70%乙醇和乙酸乙酯為提取溶劑進(jìn)行比較。稱取3份金絲小棗樹(shù)皮粉末，每份10 g，分別以水、70%乙醇和乙酸乙酯為提取溶劑。按照1.4.2條件進(jìn)行超聲提取。用牛津杯法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，根據(jù)抑菌圈大小比較各提取溶劑的提取效果。

1.4.6 新樹(shù)皮與老樹(shù)皮抑菌效果的影響 選取金絲小棗的新樹(shù)皮與老樹(shù)皮粉末通過(guò)1.4.2的方法制備提取液。牛津杯法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，比較二者抑菌圈的大小，分析它們的抑菌效果的強(qiáng)弱。

1.4.7 不同品種棗樹(shù)皮的抑菌效果的比較 取金絲小棗，馬牙棗和紅棗3種老樹(shù)皮粉末通過(guò)1.4.2的方法制備提取液。牛津杯法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，測(cè)量出3種棗樹(shù)皮的抑菌圈的的大小。根據(jù)抑菌圈大小比較抑菌效果的差異。

1.4.8 最小抑菌濃度的確定 選用金絲小棗老樹(shù)皮旋蒸后提取物，采用2倍稀釋法對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、和遲緩愛(ài)德華菌進(jìn)行對(duì)應(yīng)的抑菌試驗(yàn)，分析其最小抑菌濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法對(duì)抑菌效果的影響

不同提取方法的抑菌效果見(jiàn)表1。由表1可知， 浸提法提取物對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、溫和氣單孢菌無(wú)抑菌效果，對(duì)嗜水氣單胞菌、遲緩愛(ài)德華菌具有一定的抑菌效果，抑菌圈平均有效直徑達(dá)到1.5 mm。水浴法提取物對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、溫和氣單孢菌無(wú)抑菌效果，對(duì)嗜水氣單胞菌、遲緩愛(ài)德華菌具有一定的抑菌效果，抑菌圈平均有效直徑分別達(dá)到2，3 mm。超聲法提取物對(duì)5種菌均具有抑菌效果，抑菌圈平均有效直徑范圍在0.5～3.5 mm。綜合以上3種提取方法的抑菌效果，選定超聲法作為后續(xù)試驗(yàn)提取方法。

2.2 抑菌方法的比較

牛津杯法與濾紙片法比較結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，濾紙片法得到的抑菌圈直徑大小為7.5 mm，本身的直徑大小也是7.5 mm，表明濾紙片法對(duì)以上5種菌沒(méi)有抑菌效果。這可能是由于濾紙片貼在培養(yǎng)皿的表面后，由于浸染的提取液主要成分是70%乙醇，乙醇的揮發(fā)導(dǎo)致提取液有效成分結(jié)晶析出而不能產(chǎn)生抑菌作用。牛津杯法測(cè)得棗樹(shù)樹(shù)皮提取物在5種菌中的抑菌圈直徑分別為8.5，10.6，10.0，8.8，11.2 mm，減去牛津杯外徑7.5 mm，即平均有效抑菌直徑分別為1.0，3.1，2.0，1.3，3.7 mm。故而選用牛津杯法進(jìn)行后續(xù)的抑菌試驗(yàn)。

2.3 提取溶劑對(duì)抑菌效果的影響

由表3可知，水與乙酸乙酯作為提取劑提取的物質(zhì)對(duì)5種菌均無(wú)抑菌效果。以70%的乙醇作為提取劑時(shí)，提取物對(duì)大腸桿菌、溫和氣單胞菌、嗜水氣單胞菌具有較弱的抑菌效果，對(duì)遲緩愛(ài)德華菌和枯草芽孢桿菌有較強(qiáng)的抑菌效果。所以，選用70%的乙醇作為棗樹(shù)皮的提取溶劑。

2.4 新樹(shù)皮與老樹(shù)皮對(duì)抑菌效果的影響

由表4可知，金絲小棗老樹(shù)皮對(duì)于大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌和遲緩愛(ài)德華菌的抑菌圈直徑都大于金絲小棗新樹(shù)皮的平均有效抑菌圈直徑。金絲小棗新樹(shù)皮對(duì)于遲緩愛(ài)德華菌的抑菌效果最強(qiáng)，平均有效抑菌直徑為3.0 mm；其次為溫和氣單胞菌，平均有效抑菌直徑為1.0 mm。老樹(shù)皮對(duì)嗜水氣單胞菌、遲緩愛(ài)德華菌的抑菌效果強(qiáng)于其它3種菌。這可能是由于老樹(shù)皮的生長(zhǎng)時(shí)間相對(duì)于新樹(shù)皮更長(zhǎng)，積累的抑菌有效成分會(huì)更多。

2.5 不同品種棗樹(shù)皮抑菌效果的比較

由表5可知，在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌和遲緩愛(ài)德華菌5種菌的抑菌效果比較中，馬牙棗老樹(shù)皮對(duì)5種菌的抑菌效果最差，平均有效抑菌圈直徑分別為0，1.0，2.0，2.5，0 mm。金絲小棗老樹(shù)皮在枯草芽孢桿菌、溫和氣單胞細(xì)菌、遲緩愛(ài)德華菌中的抑菌效果較好，平均有效抑菌直徑均為3.5 mm。對(duì)大腸桿菌和嗜水氣單胞菌的抑菌效果較差。紅棗老樹(shù)皮在大腸桿菌和溫和氣單胞細(xì)菌中的抑菌效果最好，平均有效抑菌直徑為3.5 mm，對(duì)其它3種菌的抑菌效果較弱。綜合分析抑菌效果，金絲小棗老樹(shù)皮抑菌效果稍強(qiáng)于紅棗樹(shù)皮，馬牙棗老樹(shù)皮抑菌效果最弱。究其原因可能是因?yàn)椴煌N類棗樹(shù)皮的抑菌成分及其含量有所不同造成。

2.6 棗樹(shù)皮提取物在5種細(xì)菌中最低抑菌濃度的測(cè)定

由表6可知，大腸桿菌與溫和氣單胞菌在稀釋2倍后無(wú)抑菌效果，故而其最低抑菌濃度為7.5×10-4 g·mL-1?？莶菅挎邨U菌、嗜水氣單胞菌與遲緩愛(ài)德華菌在稀釋4倍后無(wú)抑菌效果，所以其最低抑菌濃度為3.8×10-4 g·mL-1。

3 討 論

在傳統(tǒng)的棗樹(shù)皮的使用中，多為煎煮內(nèi)服治療止瀉、研磨成粉外敷愈合燒傷。棗樹(shù)皮內(nèi)含有黃酮、單寧等多種有效成分，同時(shí)也可能含有萜類、生物堿類、苷類、木脂素、酯類、酚類、醛類、醇類、甾類等抑菌成分，可以利用現(xiàn)代技術(shù)工藝加工棗樹(shù)皮，利用其更大的藥用價(jià)值。試驗(yàn)表明，棗樹(shù)皮提取物對(duì)嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌和遲緩愛(ài)德華菌這3種水產(chǎn)治病菌都有一定的抑菌效果。所以，在實(shí)際的水產(chǎn)養(yǎng)殖中，可以將棗樹(shù)皮抑菌劑與化學(xué)藥劑交替使用，防治魚(yú)類疾病，其植物源類抑菌劑綠色安全的特點(diǎn)可以緩解水產(chǎn)品食用安全問(wèn)題。

4 結(jié) 論

采用超聲法進(jìn)行提取棗樹(shù)皮的有效成分，牛津杯法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以70%的乙醇作為提取溶劑抑菌效果最好；金絲小棗樹(shù)皮的老樹(shù)皮的抑菌效果強(qiáng)于新樹(shù)皮，且對(duì)于大腸桿菌與溫和氣單胞菌的最低抑菌濃度為7.5×10-4 g·mL-1，對(duì)于枯草芽孢桿菌、嗜水氣單胞菌與愛(ài)德華遲緩菌最低抑菌濃度為3.8×10-4 g·mL-1。在不同種類的棗樹(shù)樹(shù)皮抑菌效果中，金絲小棗樹(shù)皮抑菌效果最好，紅棗樹(shù)皮次之，馬牙棗樹(shù)皮最弱。

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