陶其杰 朱杭 潘浩

去雙前肢大鼠腰椎間盤退變模型構(gòu)造的研究進(jìn)展

陶其杰 朱杭 潘浩

椎間盤退行性變（IVDD）是椎間盤組織在多種原因作用下發(fā)生的生物變性，從而引起椎間盤組織結(jié)構(gòu)特性和力學(xué)的改變，導(dǎo)致椎間盤突出、椎管狹窄、脊柱不穩(wěn)等臨床常見疾?。?］，是引起下腰痛的主要原因。研究表明，＞50歲的人群中，97%存在椎間盤退變的表現(xiàn)。目前對(duì)該疾病的生物學(xué)機(jī)制尚未明確，因此利用動(dòng)物模型研究其退變機(jī)制，同時(shí)也為尋找有效的治療和預(yù)防措施提供一條重要途徑。雖然現(xiàn)有的四肢動(dòng)物模型在某種程度上可以模擬椎間盤退變的病理過程，但僅對(duì)諸多影響因素中的一部分進(jìn)行研究，并不符合人類椎間盤的退變機(jī)制［2-7］。根據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道，大鼠去雙前肢誘導(dǎo)直立模型（下文采用“雙足鼠”替代）是目前國際上公認(rèn)的一種經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，取得一定的研究效果，本文對(duì)雙足鼠的研究進(jìn)展及其前景作一綜述。

1 背景材料

目前已報(bào)道的椎間盤退變動(dòng)物模型有數(shù)十種，主要分為生物力學(xué)改變、結(jié)構(gòu)破壞、自發(fā)退變型和全身疾病型。但大部分模型均未體現(xiàn)致退變的首要因素—重力作用，而那些通過對(duì)動(dòng)物脊柱進(jìn)行軸向加壓誘導(dǎo)出退變的模型也與人體椎間盤生理性情況不符［2-7］。此外，人體椎間盤一直處于上部位結(jié)構(gòu)的垂直載荷及復(fù)合運(yùn)動(dòng)時(shí)（屈伸、側(cè)屈及旋轉(zhuǎn)）所產(chǎn)生多種應(yīng)力的作用下，易造成椎間盤擠壓和磨損。這種生物力學(xué)及運(yùn)動(dòng)學(xué)特點(diǎn)是人類脊柱區(qū)別于爬行動(dòng)物的關(guān)鍵，也是構(gòu)建椎間盤退變動(dòng)物模型的難點(diǎn)。對(duì)此，制備與人類脊柱的運(yùn)動(dòng)學(xué)及生物力學(xué)特點(diǎn)相似的動(dòng)物模型顯得尤為重要。Coff等［8］在 1957 年首次報(bào)道雙足鼠模型的建立，該模型大鼠通過模仿人類直立狀態(tài)下的生活方式，使其腰椎局部受力情況更接近于人類。此后，Higuch等［9］研究發(fā)現(xiàn)雙足鼠髓核的改變與人髓核在增齡上的改變相似。Cassidy等［10］則從直立大鼠的椎旁肌形態(tài)上進(jìn)行闡述，發(fā)現(xiàn)大鼠的腰肌和多裂肌均發(fā)生肌纖維的轉(zhuǎn)變。另外，部分大鼠出現(xiàn)腰椎間盤突出及椎管狹窄等情況。吳靖平等［11］發(fā)現(xiàn)雙足鼠由于活動(dòng)行為的改變，腰椎開始承受體重的應(yīng)力，導(dǎo)致其髓核組織發(fā)生嚴(yán)重的退變，脊索細(xì)胞、軟骨樣細(xì)胞發(fā)生變化，這與人類椎間盤的細(xì)胞退變規(guī)律相符。王衛(wèi)明等［12］對(duì)雙足鼠術(shù)后9～12個(gè)月進(jìn)行組織學(xué)及放射影像學(xué)檢查，發(fā)現(xiàn)模型大鼠的椎間盤出現(xiàn)退變，且與人類椎間盤退變規(guī)律基本一致。也證實(shí)力學(xué)因素對(duì)椎間盤生物學(xué)性質(zhì)的改變起到較明顯的作用。

雖然上述實(shí)驗(yàn)研究在退變機(jī)制上模擬了人體椎間盤，但實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均為乳鼠，建模成功率并不高，且存在建模術(shù)后飼養(yǎng)難度較大等不足［11］。為獲得更為合理的建模時(shí)機(jī)及相對(duì)較高的建模成功率，邱貴興等［13］分別采用為3d齡組、3周齡組和1個(gè)月齡組大鼠進(jìn)行建模，發(fā)現(xiàn)3組雙足鼠日均累計(jì)動(dòng)態(tài)站立時(shí)間無顯著性差異；其中1個(gè)月齡雙足鼠較早出現(xiàn)直立活動(dòng)，具有較快的適應(yīng)能力，達(dá)到比其他建模時(shí)間更好的效果，且1個(gè)月齡大鼠無術(shù)后死亡、因饑餓死亡等情況發(fā)生。

隨后，有學(xué)者［14-15］通過采用4周齡大鼠進(jìn)行建模，分別在第5、7、9個(gè)月觀察直立的姿勢(shì)對(duì)腰椎間盤影響，組織學(xué)結(jié)果分析表明，椎間盤發(fā)生退行性改變，纖維環(huán)破碎、軟骨終板膠原蛋白結(jié)構(gòu)出現(xiàn)紊亂、椎間盤高度丟失。該研究還指出體重與退變無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。國內(nèi)學(xué)者［16］在進(jìn)一步研究中發(fā)現(xiàn)直立模型大鼠的腰椎間盤存在病理改變，包括CollagenⅩ上調(diào)，CollagenⅡ表達(dá)下調(diào)，纖維環(huán)出現(xiàn)破裂，椎間盤高度降低，椎體軟骨終板鈣化，基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)增強(qiáng)。

Moravec等［17］提出置疑，其認(rèn)為不同實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的雙足鼠模擬人類直立姿勢(shì)的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)存在差異。Cassidy等［10］通過對(duì)Coff技術(shù)的改良，將新生大鼠的前肢用棉線結(jié)扎，通過食物誘導(dǎo)直立活動(dòng)，在術(shù)后14～18個(gè)月通過影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)其腰椎出現(xiàn)楔形變化，但僅有20%的雙足鼠發(fā)生椎間盤退變。Bailey等［18］對(duì)雙足鼠和正常大鼠進(jìn)行全天24h的連續(xù)行為記錄后，指出模型大鼠“直立”時(shí)間并不多于正常大鼠。由此可見，雙足鼠模型尚未能完全模擬人類脊柱運(yùn)動(dòng)機(jī)制；其次，漫長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)周期和較低的成功率等弊端限制了其推廣應(yīng)用。

為提高雙足鼠直立姿勢(shì)持續(xù)時(shí)間，邱貴興等［19］對(duì)雙足鼠術(shù)后直立姿勢(shì)相關(guān)事件與相應(yīng)直立持續(xù)時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，指出雙足鼠直立姿勢(shì)是一個(gè)被動(dòng)過程，食物及飲用水的高度是其盡早站立的主要誘因。另外，通過間斷提高食物高度，可以增加雙足鼠直立姿勢(shì)的效能，但這種相關(guān)性隨增齡逐漸減弱。

2 生物力學(xué)

椎間盤退變是一種由細(xì)胞生物學(xué)和生物力學(xué)互相作用產(chǎn)生的病理過程?，F(xiàn)有研究表明載荷在生理或病理狀態(tài)下調(diào)控椎間盤細(xì)胞的生物學(xué)行為和基質(zhì)代謝方面起著重要作用［20-21］。Stokes等［22］發(fā)現(xiàn)高頻率靜態(tài)和動(dòng)態(tài)的壓力可以產(chǎn)生細(xì)胞凋亡、增加代謝基因的表達(dá)、增加酶活性、改變結(jié)構(gòu)性質(zhì)。Gilbert等［23］研究指出椎間盤在周期性高應(yīng)力作用下，會(huì)引起椎間盤基質(zhì)分解增加、合成減少，進(jìn)而導(dǎo)致椎間盤退變。Sowa等［24］對(duì)體外椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞牽拉實(shí)驗(yàn)表明：椎間盤組織基質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)與載荷的方式、頻率、幅度、時(shí)間及組織退變有關(guān)。張德宏等［25］采用 Flexcell4000 牽張系統(tǒng)對(duì)體外培養(yǎng)的髓核組織分別予以施加牽張應(yīng)變?yōu)?2%和 10%、頻率為1.0Hz，時(shí)間為 2 h 和 12 h 的周期性牽張，發(fā)現(xiàn)：（1）2%牽拉力對(duì)肌動(dòng)蛋白骨架形成的應(yīng)力纖維影響不是很明顯，10%牽拉可以促進(jìn)肌動(dòng)蛋白骨架明顯解聚。（2）2%牽拉促進(jìn)合成代謝，使Aggrecan mRNA表達(dá)上調(diào)，使基質(zhì)金屬蛋白酶 2（MMP-2）mRNA和組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑2（TIMP-2）mRNA表達(dá)下調(diào)，從而達(dá)到二者動(dòng)態(tài)平衡。（3）10%牽拉對(duì) Aggrecan 無影響。MMP-2 上調(diào)、TIMP-2下調(diào)與牽拉時(shí)間無明顯相關(guān)性。最后得出周期性牽張可以在基因水平上對(duì)纖維環(huán)細(xì)胞 Aggrecan、MMP-2和TIMP-2基因進(jìn)行調(diào)節(jié)，通過調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白骨架從而對(duì)力學(xué)刺激產(chǎn)生響應(yīng)。

Wuerta等［26］分別將人和牛髓核細(xì)胞培養(yǎng)在滲透壓為300mOsm/kg，400 mOsm/kg 和500mOsm/kg 的培養(yǎng)基中，通過改變培養(yǎng)基的滲透壓，發(fā)現(xiàn)隨著滲透壓的升高髓核細(xì)胞聚蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的表達(dá)量逐漸上升，而Ⅰ型膠原的表達(dá)量則受到抑制。Neidlinger-Wilke 等［27］從髓核細(xì)胞中的基質(zhì)金屬蛋白酶-3（MMP-3）mRNA 、聚蛋白聚糖兩方面進(jìn)行研究，結(jié)果顯示隨著培養(yǎng)基滲透壓的增加，聚蛋白聚糖表達(dá)上升，MMP-3mRNA表達(dá)量出現(xiàn)下降。MMP-3是髓核細(xì)胞外基質(zhì)降解的主要酶類，與椎間盤退變有著密切聯(lián)系，能夠降解層黏連蛋白、蛋白多糖、纖維連接蛋白等多種細(xì)胞外基質(zhì)成分［28］。

3 操作方法

根據(jù)已報(bào)道的造模案例，目前大致可以分為2種：（1）傳統(tǒng)的截肢造模：①乳鼠：置4℃冰箱低溫處理12～15min后，用絲線結(jié)扎對(duì)肱骨近段及尾部進(jìn)行結(jié)扎，然后截去雙前肢。3周齡后移走母鼠開始固體飼料喂養(yǎng)。在此后的飼養(yǎng)過程中，每周對(duì)大鼠麻醉后測(cè)量身長(zhǎng)來調(diào)整食物及飲水源的高度，誘導(dǎo)大鼠雙后肢站立，以此訓(xùn)練大鼠的直立活動(dòng)。②4周齡大鼠：鹽酸氯氨酮 0.1g/kg行腹腔注射麻醉，將大鼠腋下備皮、碘伏消毒，取上臂中上1/3處橫向切開皮膚，逐層剝離，暴露三角肌下血管神經(jīng)束，予以絲線結(jié)扎，再用組織剪剪斷肌肉、血管和神經(jīng)，用咬骨鉗咬斷肱骨，碘伏擦拭后逐層縫合，最后大腿內(nèi)側(cè)予以青霉素肌注。術(shù)后飼養(yǎng)同乳鼠。（2）臂叢神經(jīng)離斷造模：采用雙前肢離斷容易遭實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)挑戰(zhàn)，肖軍等［29］打破倫理困境，對(duì)肩胛間區(qū)行后正中切口，沿肩胛骨內(nèi)側(cè)緣逐層剝離菱形肌和斜方肌部分肌束，保留肩胛提肌。然后向外牽開肩胛骨，離斷前鋸肌止點(diǎn)，顯露臂叢神經(jīng)主干及其分支，腋動(dòng)靜脈，并用神經(jīng)剝離子鈍性分離，將橈神經(jīng)、正中神經(jīng)、尺神經(jīng)、腋神經(jīng)及胸前神經(jīng)分支離斷。碘伏消毒后，逐層縫合。該方法可實(shí)現(xiàn)大鼠雙前肢廢用、肩關(guān)節(jié)功能運(yùn)動(dòng)喪失，使上肢扶持、爬行等功能缺失，達(dá)到與傳統(tǒng)經(jīng)典的截肢手術(shù)相似的效果。

4 優(yōu)勢(shì)及不足

雙足鼠誘導(dǎo)腰椎間盤退行性變是目前國際上公認(rèn)的一種經(jīng)典的方案，其顯著優(yōu)點(diǎn)是：（1）雙足鼠可以模仿人類直立行走過程中腰椎局部受力情況，更接近人腰椎間盤退變的發(fā)病機(jī)制，符合緩慢退變的特點(diǎn)。（2）大鼠具有廉價(jià)、易飼養(yǎng)、抗病能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。（3）大鼠椎間盤在解剖結(jié)構(gòu)上與人類椎間盤極為類似［30］。（4）具有較強(qiáng)的可操作性［31］。顧韜等［31］認(rèn)為雙足鼠的造模需要注意以下問題：（1）雙足鼠模擬人類直立姿勢(shì)的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)存在差異。（2）受到倫理學(xué)約束。（3）動(dòng)物模型重復(fù)性中等，可調(diào)控性差，損傷大、投入大、干擾因素多。（4）漫長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)周期和較低的成功率等弊端限制了其推廣應(yīng)用［17-18］。

5 前景展望

雙足鼠相比于傳統(tǒng)的四肢動(dòng)物模型，更貼近人類脊柱活動(dòng)的生物形態(tài)，更符合人類退變性脊柱疾病的發(fā)展規(guī)律，是一種可行性較高的造模方法。但漫長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)周期及在此期間產(chǎn)生的巨大投入，較其他造模方案并無明顯優(yōu)勢(shì)，這也在一定程度上限制其推廣應(yīng)用。另外，雙足鼠直立姿勢(shì)的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)還存在差異。因此，探索能夠延長(zhǎng)雙足鼠的站立時(shí)間的新方法，縮短實(shí)驗(yàn)周期以及制定統(tǒng)一的直立姿勢(shì)評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，這將是脊柱外科動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究的新方向。

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310053 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院（陶其杰）

310007 杭州市中醫(yī)院（朱杭 潘浩）