郭海林 賈智明 鮑星奇 謝華 陳方

長期以來，供體緊缺和移植排斥反應(yīng)是阻礙器官移植發(fā)展的兩大瓶頸。組織工程學(xué)概念的提出為解決上述難題提供了新思路。組織工程學(xué)是基于細胞生物學(xué)、材料科學(xué)及生物工程學(xué)的原理在體外構(gòu)建具有生物活性的組織類似物以替代、修復(fù)、改善或再生人體受損或病變的各種組織器官[1-2]。傳統(tǒng)組織工程技術(shù)主要為細胞懸液注射和支架材料復(fù)合細胞技術(shù)，兩種技術(shù)各有其優(yōu)勢及缺陷：細胞懸液注射操作方便，創(chuàng)傷小，但單次注射細胞數(shù)量有限，難以定位，注射后細胞易流失，無法實現(xiàn)均勻分布，為了滿足細胞數(shù)目要求，常需反復(fù)多次注射[3]；支架材料復(fù)合細胞負載細胞數(shù)目相對較高，亦可將細胞移植至特定部位，但支架材料復(fù)合細胞需胰酶消化，胰酶會破壞細胞的表面蛋白、胞間連接及細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM），對細胞損傷較大，且支架材料在移植至組織修復(fù)部位后會因自身降解而產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，從而不利于細胞的存活和生長[4-5]。

近年興起的細胞膜片技術(shù)可有效避免傳統(tǒng)組織工程技術(shù)的相關(guān)不足，它無需胰酶消化，細胞通過其自身分泌的ECM而自發(fā)地形成致密膜片樣組織，其不僅可避免外源性支架材料所引起的移植排斥反應(yīng)，而且與細胞懸液注射相比膜片內(nèi)細胞數(shù)目多，存活時間長，是進行組織修復(fù)和改善器官功能的良好移植物[3-6]。目前細胞膜片技術(shù)已成為組織工程領(lǐng)域的研究熱點，并已被成功應(yīng)用到包括角膜、軟骨、牙周韌帶、食管及心臟等各種組織器官修復(fù)中[1,7-10]。本文將對細胞膜片技術(shù)在組織工程中的研究現(xiàn)狀及最新進展做一綜述。

一、細胞膜片的收獲

細胞膜片可通過多種方法收獲，如通過Vitamin C刺激ECM分泌而形成細胞膜片，通過溫度敏感材料、光敏感材料、電敏感材料或聚合人纖維蛋白等包被培養(yǎng)皿而收獲細胞膜片[1,11-12]。由日本學(xué)者Okano等[1,9,13]提出的利用溫度敏感型培養(yǎng)皿獲得細胞膜片是目前被應(yīng)用最廣的方法。溫度敏感型培養(yǎng)皿主要由特殊的溫度敏感材料聚N-異丙基丙烯酰胺（poly N-isopropylacrylamide，PIPAAm）經(jīng)電子束照射而共價結(jié)合于普通培養(yǎng)皿底部。此溫度敏感材料可根據(jù)外在環(huán)境溫度變化而改變其親水及疏水性能，在37 ℃細胞培養(yǎng)環(huán)境中，此溫度敏感材料為疏水性，可使接種細胞正常貼壁增殖，當環(huán)境溫度低于臨界溫度32 ℃時，此溫度敏感材料變?yōu)橛H水性。因此待37 ℃環(huán)境下培養(yǎng)的細胞長滿培養(yǎng)皿底部時，通過降溫而使溫度敏感材料由疏水性變?yōu)橛H水性，此時貼滿培養(yǎng)皿底部的細胞即可自動脫壁并依靠其自身分泌的ECM而形成具有二維結(jié)構(gòu)（two dimensional，2D）的單張細胞膜片[6,9-10]。這種在溫度敏感型培養(yǎng)皿內(nèi)收獲細胞膜片的方法避免了胰酶及分散酶的消化，細胞的表面蛋白、胞間連接、ECM、細胞與細胞及細胞與ECM間的相互作用可以被很好地保留，因此基于溫度敏感型培養(yǎng)皿獲得的細胞膜片可能蘊含了更多的生物學(xué)信息[6,10]。然而，應(yīng)用溫度敏感型培養(yǎng)皿獲得細胞膜片亦具有諸多不足：首先，這種由PIPAAm包被的溫度敏感型培養(yǎng)皿至少需要40 min的20 ℃低溫環(huán)境來獲取細胞膜片，相對較費時；其次，對一些較敏感的細胞系來說，通過溫度變化來獲取細胞膜片可能會對細胞的基因表達及細胞功能產(chǎn)生一定影響；再者，制備PIPAAm包被的溫度敏感型培養(yǎng)皿需要電子束輻射設(shè)備或氣相聚合裝置，而這些設(shè)備在一些生物實驗室中并不常用，且包被過程復(fù)雜，需要特殊的材料，因而不利于其大規(guī)模普及[12-13]。因此，目前有研究者正嘗試通過對PIPAAm修飾改性以期可更快、更高效地收獲細胞膜片[14]。

二、細胞膜片與3D組織構(gòu)建

目前應(yīng)用溫度敏感型培養(yǎng)皿只可獲得單張2D的細胞膜片。2D的細胞膜片在少部分組織器官（如角膜）修復(fù)中具有較大優(yōu)勢，而對于大多數(shù)組織器官特別是富細胞的組織器官（如心臟、肝、膀胱和腎臟等）常需要應(yīng)用3D組織來修復(fù)。細胞膜片因含有豐富的ECM、層粘連蛋白及纖連蛋白，故而無需縫合便可緊密貼附在其他細胞膜片、器官組織及生物醫(yī)學(xué)材料表面，且膜片內(nèi)細胞可被其自身分泌的ECM固定很少流失，以上特性為多張細胞膜片復(fù)合而形成富細胞的3D組織提供了良好基礎(chǔ)[10,15]。且基于細胞膜片疊加形成的3D組織與單張2D的細胞膜片相比，3D組織可更好地模擬體內(nèi)組織的生長條件，應(yīng)用3D組織行組織修復(fù)可更有效地促進組織再生，提高組織功能及治療效果[4,10,16]。此外，由不同細胞分別形成的細胞膜片可按預(yù)設(shè)的結(jié)構(gòu)層次先后完成疊加有望實現(xiàn)組織器官的仿生構(gòu)建和修復(fù)。如Zhou等[16]分別將脂肪干誘導(dǎo)成肌膜片、成纖維細胞膜片及口腔黏膜上皮細胞膜片依次疊加而構(gòu)建了具有黏膜層、黏膜下層及平滑肌層的3D仿生尿道組織，將其用于犬尿道的修復(fù)重建獲得良好效果，實現(xiàn)了組織器官的仿生修復(fù)。因此，基于細胞膜片疊加形成的3D仿生組織在組織工程中具有更大的應(yīng)用潛能。

通過細胞膜片疊加雖可形成3D組織，但如何在疊加形成的3D組織內(nèi)構(gòu)建血管網(wǎng)絡(luò)以促使其在植入體內(nèi)后可盡快地與宿主的血管系統(tǒng)建立血運聯(lián)系而不影響其存活是基于細胞膜片技術(shù)構(gòu)建3D組織面臨的重要挑戰(zhàn)[1,17]。通常單純細胞膜片不會自行生成血管，內(nèi)皮細胞（endothelial cell，EC）對于促進3D組織中新血管再生起著關(guān)鍵作用[18-19]。Sasagawa等[19]應(yīng)用“三明治法”將人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）間置在5層成肌細胞膜片間，在體外培養(yǎng)環(huán)境中，HUVECs會以出芽方式在組織內(nèi)形成血管網(wǎng)絡(luò)。將5層成肌細胞膜片植入裸鼠皮下發(fā)現(xiàn)，成肌細胞膜片內(nèi)的內(nèi)皮血管網(wǎng)絡(luò)會與宿主的血管建立血運聯(lián)系進而支持體外構(gòu)建的3D組織的存活。此外，心肌細胞與EC共培養(yǎng)形成膜片后再疊加或成纖維細胞與EC分別形成膜片后再疊加也可構(gòu)建血管化的3D組織[10,20]。結(jié)合細胞膜片技術(shù)構(gòu)建血管化的3D組織，是一項具有巨大潛力的組織工程血管化新策略[17-18,21]，更有利于其在植入體內(nèi)后的早期存活，促進組織器官修復(fù)和改善器官功能。

三、細胞膜片技術(shù)在組織修復(fù)中的應(yīng)用

目前細胞膜片技術(shù)較多地被應(yīng)用于角膜、食管、牙周韌帶及心臟等組織修復(fù)中，且單張細胞膜片已被臨床應(yīng)用于角膜、食管的修復(fù)，多張細胞膜片亦被應(yīng)用到心肌、牙周及軟骨組織的修復(fù)，證實了細胞膜片技術(shù)在組織修復(fù)中的潛在臨床應(yīng)用價值。

當單側(cè)眼角膜緣干細胞出現(xiàn)病變時，另一側(cè)的角膜緣干細胞可用于病變側(cè)眼的修復(fù)，但存在對健側(cè)眼角膜緣干細胞造成損傷的風(fēng)險。當雙側(cè)眼角膜緣干細胞均出現(xiàn)病變時，可采用口腔黏膜上皮細胞膜片進行修復(fù)?？谇火つど掀ぜ毎て懈杉毎蜃婕毎麡蛹毎?，可抑制角膜內(nèi)的炎癥反應(yīng)，恢復(fù)角膜的清潔和平滑[1]。在臨床應(yīng)用中，Nishida等[22]將自體的口腔黏膜上皮細胞膜片用于4例雙側(cè)眼角膜緣干細胞缺陷的患者獲得了良好的治療效果。臨床試驗的成功正促使細胞膜片的產(chǎn)品化獲得市場授權(quán)[23]。

細胞膜片技術(shù)在擴張性心肌病及缺血性心肌病導(dǎo)致的嚴重心衰中亦具有重要的應(yīng)用價值。Sawa等[24]報道了1例應(yīng)用成肌細胞膜片治療擴張性心肌病需左室輔助系統(tǒng)（left ventricular assist system，LVAS）支持的患者，他們將20張成肌細胞膜片分5處貼附（每處貼附4張疊加的成肌細胞膜片）在左心室的前壁和側(cè)壁上，3個月后發(fā)現(xiàn)成肌細胞膜片提高了心臟功能，使心衰導(dǎo)致的癥狀完全消失，患者亦無需LVAS支持。在一項同樣應(yīng)用成肌細胞膜片修復(fù)鼠心肌梗死模型的研究中發(fā)現(xiàn)，成肌細胞膜片可通過旁分泌多種生長因子來提高病變心臟的功能，并減少缺血性心肌纖維化[25]。據(jù)此推測，成肌細胞膜片在臨床應(yīng)用中改善擴張性心肌病患者心臟功能的機制應(yīng)該也與成肌細胞膜片的旁分泌效應(yīng)相關(guān)[1]。

內(nèi)鏡下黏膜切除（endoscopic submucosal dissection，ESD）是治療早期淺表性食管癌的有效措施，然而在食管黏膜切除范圍較大時可出現(xiàn)炎癥反應(yīng)和食管狹窄等并發(fā)癥。經(jīng)基礎(chǔ)研究證實，口腔黏膜上皮細胞膜片貼附在行ESD術(shù)后的基底組織創(chuàng)面上可有效減少食管狹窄的發(fā)生[26]。Ohki等[7]將口腔黏膜上皮細胞膜片貼附在10例行ESD患者的基底組織創(chuàng)面上證實了同樣的結(jié)果。新近研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用皮膚表皮細胞膜片同樣可有效減少術(shù)后食管狹窄的發(fā)生，為防止ESD術(shù)后食管狹窄的發(fā)生提供了新的組織來源[27]。

綜上所述，細胞膜片技術(shù)自誕生以來獲得了突飛猛進的發(fā)展，而且在心臟、食管和角膜修復(fù)方面已經(jīng)積累了相應(yīng)臨床經(jīng)驗。除此以外，應(yīng)用牙周組織細胞膜片促進牙周組織再生及應(yīng)用軟骨細胞膜片修復(fù)骨關(guān)節(jié)炎導(dǎo)致的軟骨缺損的臨床試驗亦在進行中[1,8]。隨著細胞膜片技術(shù)研究的深入，越來越多的器官病變或組織缺損可應(yīng)用細胞膜片技術(shù)進行修復(fù)，細胞膜片技術(shù)在修復(fù)組織缺損或改善器官功能方面具有巨大的臨床應(yīng)用潛能。

四、細胞膜片技術(shù)應(yīng)用新領(lǐng)域

目前細胞膜片技術(shù)在心臟、食管、角膜、牙周及軟骨等組織工程領(lǐng)域報道較多。隨著細胞膜片技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域的不斷拓展，近年來一些較少見組織器官的病變亦開始應(yīng)用細胞膜片技術(shù)來修復(fù)。

中耳炎術(shù)后導(dǎo)致的中耳黏膜缺損會導(dǎo)致鼓膜回縮和粘連的復(fù)發(fā)，如果可在骨的表面盡快地使上皮再生，可有效防止術(shù)后鼓膜粘連。Yaguchi等[28]采用自體中耳黏膜細胞膜片修補新西蘭大白兔中耳炎手術(shù)后造成的黏膜缺損和骨暴露，不僅可恢復(fù)中耳黏膜連續(xù)性，還可有效抑制術(shù)后肉芽組織生長和骨質(zhì)增生，減少手術(shù)并發(fā)癥。然而中耳黏膜取材相對較難，且在臨床工作中不宜將健側(cè)耳黏膜切除去修復(fù)患側(cè)耳黏膜缺損。Yamamoto等[29]研究發(fā)現(xiàn)將鼻黏膜上皮細胞膜片覆蓋在中耳炎術(shù)后導(dǎo)致的骨暴露處同樣可抑制骨質(zhì)增生，增大鼓室容積，促進中耳上皮恢復(fù)，為鼻黏膜上皮細胞膜片在中耳炎手術(shù)中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。與中耳黏膜相比，鼻黏膜取材創(chuàng)傷對機體功能影響較小，且鼻黏膜上皮特點與中耳黏膜上皮類似，更適于臨床推廣，因此鼻黏膜上皮細胞膜片在中耳炎術(shù)后防止鼓膜粘連方面具有更大的應(yīng)用潛能。細胞膜片除了可防止中耳炎術(shù)后導(dǎo)致的鼓膜粘連，其在防止宮腔粘連及腹腔粘連方面亦有相關(guān)報道[30-31]。

近年來細胞膜片在治療胸膜瘺方面亦有相關(guān)報道。如Kanzaki等[32]將豬皮膚成纖維細胞膜片貼附在臟胸膜破損處可使胸膜瘺立即關(guān)閉。4周后發(fā)現(xiàn)成纖維細胞膜片仍貼附在胸膜表面，并可隨著肺通氣造成的肺容量變化而發(fā)生擴張和收縮，從而為胸膜缺損提供了新的有效閉合措施。另外，有學(xué)者證明成肌細胞膜片在胰瘺及胃穿孔閉合方面亦有潛在的應(yīng)用價值[33-34]。

除可修復(fù)組織缺損外，細胞膜片技術(shù)在促血管化構(gòu)建、疾病機制研究及腫瘤模型構(gòu)建方面亦有相關(guān)報道。如Kato等[35]將脂肪干細胞膜片貼附在2型糖尿病大鼠頭部全厚皮膚缺損創(chuàng)面上，脂肪干細胞膜片可通過分泌多種促血管生成因子來促進創(chuàng)面組織的血管化進而促進人造皮膚的存活。Chen等[36]發(fā)現(xiàn)將臍靜脈內(nèi)皮細胞以20 000/cm2密度種植在人間充質(zhì)干細胞膜片上并在常氧環(huán)境下（20% O2）培養(yǎng)1周可獲得預(yù)血管化的間充質(zhì)干細胞膜片，與單純間充質(zhì)干細胞膜片相比，其分泌生長因子更多，促缺損組織創(chuàng)面血管床優(yōu)化更明顯，進而也可使貼附其上的自體中厚皮片攣縮更少。Sekine等[37]將新生大鼠的心肌細胞膜片環(huán)形包繞在切除下來的成年大鼠胸主動脈，使其黏附并形成心肌管道，再將該心肌管道替代裸鼠的腹主動脈。4周后發(fā)現(xiàn)該心肌管道可自發(fā)地節(jié)律性搏動，使心肌管道內(nèi)產(chǎn)生約（5.9 ±1.7） mmHg的壓力（1 mm Hg = 0.133 kPa），并且血流的機械壓力會使血管外的心肌細胞發(fā)生肥大和增生。這種體外細胞膜片技術(shù)構(gòu)建的心肌管道不僅可為心衰的機制研究提供幫助，更為心臟支持設(shè)備研究提供了一種新的途徑。另外，細胞膜片技術(shù)在腫瘤模型構(gòu)建方面亦有相關(guān)應(yīng)用。如Suzuki等[38]發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)的單純癌細胞懸液皮下注射成瘤相比，腫瘤細胞膜片移植成瘤速度更快，且同等時間內(nèi)成瘤體積更大，因而可為腫瘤模型構(gòu)建、新藥研發(fā)及抗腫瘤治療研究提供新思路。

五、總結(jié)

盡管細胞膜片技術(shù)在保留細胞表面蛋白、胞間連接、ECM、細胞與細胞間及細胞與ECM間相互作用方面具有較多優(yōu)勢，但目前仍存在一些不足之處：第一，單張細胞膜片相對薄，易碎，機械性能欠佳，易卷縮，轉(zhuǎn)移和運輸較困難，難以直接移植，常需使用一定的運載輔助工具完成移植；第二，細胞膜片培養(yǎng)周期較長，文獻報道7 ～ 28 d不等，培養(yǎng)成本較高，且在培養(yǎng)過程中只換液不傳代，細胞狀態(tài)難以質(zhì)量控制，難以滿足大規(guī)模生產(chǎn)滿足臨床應(yīng)用；第三，單純細胞膜片通常不會自行生成血管，對于多層細胞膜片用于修復(fù)較大的富細胞的組織缺損時，常需構(gòu)建預(yù)血管化的組織并采用多次手術(shù)的方式以保證其移植修復(fù)后的營養(yǎng)供給，多次手術(shù)創(chuàng)傷較大，不利于臨床應(yīng)用推廣；第四，細胞膜片難以塑形，如需修復(fù)特定形態(tài)的組織缺損常需將細胞膜片技術(shù)與支架材料相結(jié)合，而支架材料的降解不利于細胞的存活及移植修復(fù)部位的組織學(xué)優(yōu)化，如何將細胞膜片有效塑形亦是其在組織工程研究中面臨的又一挑戰(zhàn)。

細胞膜片技術(shù)在組織工程中的應(yīng)用研究方興未艾，且有些研究已經(jīng)進入到臨床階段。與傳統(tǒng)組織工程技術(shù)相比，基于細胞膜片技術(shù)構(gòu)建的組織保留了更多的生物學(xué)信息，因此新的組織器官模型及腫瘤模型亦開始結(jié)合細胞膜片技術(shù)來進行構(gòu)建。但應(yīng)用細胞膜片技術(shù)構(gòu)建血管化的大塊組織及基于細胞膜片技術(shù)進行全器官的替代移植仍是非常遙遠的事情，其需要細胞生物學(xué)、生物工程學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)及商業(yè)部門的共同參與才有望早日實現(xiàn)其工業(yè)化進程。期待能有更多的創(chuàng)新性手段融入到細胞膜片技術(shù)上來，以實現(xiàn)其工業(yè)化進程及全器官的替代移植。

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