吳高松，王知斌，楊春娟，劉華，王秋紅，楊炳友，匡海學

(黑龍江中醫(yī)藥大學，教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點實驗室/黑龍江省中藥天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040)

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HPLC-ELSD法同時測定無梗五加果中3種3,4-裂環(huán)羽扇豆烷型三萜化合物的含量

吳高松，王知斌，楊春娟，劉華，王秋紅，楊炳友，匡海學*

(黑龍江中醫(yī)藥大學，教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點實驗室/黑龍江省中藥天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：建立HPLC-ELSD法同時測定無梗五加果中22-α-hydroxychiisanogenin(1)、chiisanogenin(2)和(1R, 11α)1, 4-epoxy-11-hydroxy-3, 4-secolupane-20(30)-ene-3, 28-dioic acid(3)的含量方法測定。方法：采用Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，流動相為甲醇-0.2%(V/V)乙酸水溶液梯度洗脫，流速1.0 mL/min，柱溫為25℃，使用蒸發(fā)光散射檢測氣(載氣流速1.60 L/min，蒸發(fā)溫度60℃，漂移管溫度45℃)。結(jié)果：在70 min內(nèi)，無梗五加果中上述3個成分完全分離，峰面積的對數(shù)與進樣量的對數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(r=0.999 5～0.999 7)；平均加樣回收率(n=6)分別為102.9%(RSD=1.9%)、95.4%(RSD=3.0%)、98.7%(RSD=2.3%)。樣品中化合物1～3的含量分別為9.37～9.61、2.03～2.18、0.39～0.45 mg/g。結(jié)論：該方法簡單、快速、結(jié)果可靠，可用于同時測定無梗五加果中化合物1～3的含量。

無梗五加果；高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測；含量測定

無梗五加[Acanthopanaxsessiliflorus(Rupr.et Maxim.) Seem.]為五加科五加屬植物，又稱短梗五加。主要分布在中國東北地區(qū)，河北、山西、內(nèi)蒙古等地亦有分布。無梗五加中含有豐富的黃酮類、有機酸類、香豆素類、萜類以及糖類化合物[1-4]?！吨腥A本草》記載，無梗五加的根莖具有祛風濕、補肝腎、強筋骨、活血脈的作用[5]。三萜類成分為無梗五加果中主要的活性成分之一，裂環(huán)羽扇豆烷型三萜化合物是無梗五加果中的特征成分，本課題組首次采用HPLC-ELSD測定這3種成分的含量，可為無梗五加果的質(zhì)量控制提供實驗依據(jù)。

1 儀器與材料

Agilent 1260高效液相色譜儀(包括四元泵、自動進樣器、柱溫箱、Agilent 1290蒸發(fā)光散射檢測器)；KQ-500DB超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；AK2140電子天平(上海奧豪斯公司)。

HPLC流動相甲醇為色譜純(美國Fisher公司)，醋酸為色譜純(美國Fisher公司);其余試劑均為分析。

對照品22-α-hydroxychiisanogenin(化合物1)、chiisanogenin(化合物2)、(1R,11α)1,4-epoxy-11-hydroxy-3, 4-secolupane-20(30)-ene-3,28-dioic acid (化合物3)(圖1)為實驗室從無梗五加果中分離得到，通過MS、NMR鑒定其結(jié)構(gòu)，HPLC測得其純度均≥98%(峰面積歸一化法)；無梗五加果于2014年12月購買于黑龍江省三棵樹藥材市場，產(chǎn)地為黑龍江省，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學王振月教授鑒定為無梗五加[Acanthopanaxsessiliflorus(Rupr. et Maxim.)Seem.]的果實。

圖1 化合物1～3的結(jié)構(gòu)式

2 方法與結(jié)果

2.1 混合對照品儲備溶液制備

精密稱取各對照品適量，加甲醇配制成每1 mL含0.751 mg的化合物1、0.227 mg的化合物2、0.336 mg的化合物3的混合溶液，即得。

2.2 供試品溶液制備

精密稱取1.0 g無梗五加果干燥成熟果實粉末，料液比1∶20，甲醇-乙腈(1∶2，V/V)回流提取3次，合并3次濾液減壓濃縮，制得浸膏，加10 mL水超聲混懸，用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯層，減壓濃縮得浸膏，甲醇定容至50 mL，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件

色譜柱Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)，流動相A為甲醇，B為0.2%(V/V)乙酸水；梯度洗脫程序：0 min，55% A，20 min，68% A，35 min，80% A，60 min，85% A，流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃；ELSD參數(shù)：蒸發(fā)溫度60 ℃，漂移管溫度45 ℃，氮氣流速1.60 L/min，進樣量20 μL。對照品及樣品色譜圖見圖2。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.1”項下的混合對照品儲備液0.5 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL分別置于10 mL容量瓶中，定容至刻度，按“2.3”項下色譜條件進樣測定，以進樣量的對數(shù)和對應(yīng)峰面積的對數(shù)計算回歸方程?；衔?～3的回歸方程分別為Y=16.41X-484.1(r=0.999 5)，線性范圍37.55～751.0 μg/mL；Y=23.78X-201.9(r=0.999 6)，線性范圍11.35～227.0 μg/mL；Y=27.54X-32.44(r=0.999 7)，線性范圍4.000～336.0 μg/mL。

圖2 混合對照品(A)、樣品(B)的HPLC色譜圖

2.5 儀器精密度考察

取“2.1”項下的混合對照品儲備液，按照“2.3”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，化合物1～3的峰面積RSD分別為0.36%、0.56%、1.1%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復性考察

取無梗五加果藥材粉末1.0 g/份，6份，分別按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.3”項下色譜條件進行含量測定，測得樣品中化合物1～3的RSD分別為1.1%、1.8%、2.6%，均小于<3%，表明該方法重復性好。

2.7 穩(wěn)定性考察

取同一供試品溶液于室溫下放置，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h按照上述色譜條件進樣測定，化合物1～3的峰面積RSD分別為0.92%、0.89%、0.98%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱定已經(jīng)含量的樣品0.5 g，共6份，分別精密加入低、中、高3個加入量的對照品儲備液(每個加入量3份)，按照“2.2”項下制備供試品溶液，然后按“2.3”項下色譜條件測定，計算回收率。結(jié)果化合物1～3的平均回收率分別為102.9%(RSD=2.9%)、95.4%(RSD=3.0%)、98.7%(RSD=2.3%)。表示該提取方法準確度較好，基本符合試驗要求。

2.9 含量測定

取無梗五加果粉末，精密稱定1.0 g，按照上述方法進行測定，由回歸方程計算化合物1～3的含量。結(jié)果見表1。

表1 化合物1～3在無梗五加中的含量(mg/g，n=3)

注：括號內(nèi)為RSD值。

3 討論

3.1 含量測定方法的選擇

目前無梗五加果中除三萜類成分的含量測定方法外，其他成分的含量測定相對成熟，基本采用的都是HPLC-UV法[6-10]，但是由于三萜成分的紫外吸收波長短(203 nm)，干擾成分多，故不適合三萜類成分的分析。有研究報道三萜成分主要采用的研究方法是HPLC-ELSD和UPLC-MS，但是UPLC-MS作為體外質(zhì)量控制研究而言不具有實用性，故本文采用了HPLC-ELSD來建立無梗五加果中三萜成分含量測定方法，該檢測器對揮發(fā)性高于流動相的物質(zhì)均適用，且對各種物質(zhì)的響應(yīng)度幾乎相同。

3.2 流動相系統(tǒng)及分析時間的選擇

這3種化合物屬于三萜苷元，極性較小，更易溶于甲醇-乙腈中，故本實驗采用的提取溶劑為甲醇∶乙腈(1∶2,V/V)。由于3種三萜化合物的極性較為接近，為了得到較好的分離度和縮短分析時間，選擇了梯度洗脫模式。本實驗研究了向流動相(甲醇-水體系和乙腈-水體系)加入乙酸和磷酸對樣品分離效果的改善，最終確定以甲醇-0.2%乙酸水溶液系統(tǒng)作為流動相，可以獲得樣品中待測物質(zhì)的峰和其他組分的峰有良好分離度，在70 min以內(nèi)ELSD檢測器對3種三萜化合物成分的峰與相鄰色譜峰的分離度大于1.5。

無梗五加果中三萜類成分的含量較高，對其三萜類成分的藥理活性深入研究可為無梗五加果的藥用價值的研究提供依據(jù)。

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[2] Yang CJ,Wang ZB,Song PY,et al.Monoterpenoids from Acanthopanax sessiliflorus Fruits[J].Molecules,2013,18(3):3043-3049.

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Simultaneous Determination of Three 3,4-seco-Lupane-type Triterpenoids in Acanthopanax Sessiliflorus Fruits by HPLC-ELSD

WU Gao-song, WANG Zhi-bin, YANG Chun-juan, LIU Hua, WANG Qiu-hong,YANG Bing-you, KUANG Hai-xue*

(KeyLaboratoryofChineseMateriaMedica(MinistryofEducation),HeilongjangKeyLaboratoryofTCMPharmacodynamicMaterialBases,HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

Objective: To establish a high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detection (HPLC-EISD) method for the simultaneous determination of 22-α-hydroxychiisanogenin (1), chiisanogenin (2), (1R, 11α)1, 4-epoxy-11-hydroxy-3, 4-secolupane-20(30)-ene-3, 28-dioic acid (3) in the Acanthopanax sessiliflorus fruits. Methods: The Diamonsil C18column (250 mm×4.6 mm, 5 μm) was used,using gradient elution with a mobile phase of methanol as solvent A and 0.2% (V/V) acetic acid in water as solvent B; the flow rate was 1.0 mL/min; the column temperature was maintained at 25℃. The ELSD conditions were as follows: the evaporative temperature was set at 60℃; the drift tube temperature was set at 45℃; the gas flow rate was 1.60 L/min. Results: The three compounds were completely separated within 70 min. The regression equation showed a good liner relationship between logarithm of the peak area and logarithm of the content of each compound (r=0.999 5-0.999 7). The average recoveries (n=6) were 102.9%(RSD=1.9%), 95.4%(RSD=3.0%)and 98.7%(RSD=2.3%), respectively. The contents of compounds 1-3 in samples were 9.37-9.61,2.03-2.18,0.39-0.45 mg/g, respectively. Conclusion: The method is simple, fast and reliable, which can be used to determine the contents of compounds 1-3 in A. sessiliflorus fruit.

Acanthopanax sessiliflorus fruit; HPLC-ELSD; Determination

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃-973計劃(No.2013CB531801)；黑龍江中醫(yī)藥大學“優(yōu)秀創(chuàng)新人才”支持項目(No.2012RCD05)；黑龍江中醫(yī)藥大學“杰出人才培養(yǎng)”基金項目(No.2012cj02)

吳高松(1989-)，男，碩士研究生，主要從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究工作。

匡海學*(1955-)，男，教授，博士研究生導師，主要從事中藥性味理論和中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究工作。

2016-07-13

R284

A

1002-2406(2017)01-0036-03

修回日期：2016-08-04