莊金秋，梅建國，張 穎，楊麗梅，李 峰，沈志強(qiáng)

（山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

豬腺病毒的病原學(xué)特征及檢測技術(shù)研究進(jìn)展

莊金秋，梅建國，張 穎，楊麗梅，李 峰，沈志強(qiáng)

（山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

豬 腺 病 毒（Porcine adenovirus，PADV）屬于腺病毒科哺乳動(dòng)物腺病毒屬成員。Haig等（1964）首次從英格蘭腹瀉仔豬的直腸拭子中分離到該病毒。PADV在豬群中廣泛存在，能引起豬腹瀉以及呼吸道疾病，且易與其他病毒混合感染。PADV感染，雖然不像牛、犬和雞等腺病毒感染危害那么嚴(yán)重，但其卻是廣泛存在于豬群的一種潛在的病毒性傳染病，豬多數(shù)情況下表現(xiàn)為隱性感染，少數(shù)毒株能引起豬腦炎、腹瀉、肺炎及腎病變。本文綜述了豬腺病毒的病原學(xué)特征及檢測技術(shù)研究進(jìn)展，以期為廣大科研工作者及養(yǎng)殖場戶對(duì)豬腺病毒的研究和疾病防控提供參考。

1 腺病毒的由來和分類

PADV于1964年首次從英格蘭的腹瀉仔豬的直腸拭子中分離獲得，1966年從患腦炎的豬中也分離得到。隨后從很多樣品中分離到該病毒，包括豬瘟病毒培養(yǎng)物、健康豬糞便和豬腎細(xì)胞等。

PADV屬于腺病毒科哺乳動(dòng)物腺病毒屬成員，迄今在豬體內(nèi)至少發(fā)現(xiàn)5個(gè)血清型，其中1、2和3型在酶切圖譜和基因組序列方面比較相近但沒有明顯的血清學(xué)交叉反應(yīng)，而4型和5型與其他型，以及這兩者之間均有很大的差異。除少數(shù)毒株能引起豬腦炎、腹瀉、肺炎及腎病變外，多數(shù)毒株對(duì)豬隱性感染，不影響豬的生長，甚至可從健康豬的內(nèi)臟器官分離得到。PADV3在細(xì)胞中增殖的滴度最高，PADV3（6618株）最早是從健康仔豬的眼拭子中分離得到的。

2 腺病毒的病原學(xué)特征

腺病毒是一類無囊膜、二十面體對(duì)稱、基因組長為30～40 kb的雙股鏈狀DNA病毒。由于PADV具有低致病性和高增殖性的特點(diǎn)，近年來國內(nèi)外學(xué)者對(duì)PADV作為表達(dá)載體進(jìn)行了探討，取得了很大進(jìn)展。目前，PADV3作為疫苗活載體已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用?；谀承┒局甑娜踔虏⌒约捌淠艽碳C(jī)體產(chǎn)生良好的黏膜免疫，研究人員將這些病毒開發(fā)成一個(gè)無致病性的活載體病毒表達(dá)外源基因，如干擾素（IFN）-γ基因、豬瘟病毒（CSFV）gp55（E2）基因、豬偽狂犬病病毒（PRV）gD基因、高致病性禽流感病毒（H5N1）HA基因、豬傳染性胃腸炎病毒（T GEV）S基因等病毒基因，這些重組病毒免疫豬后對(duì)相應(yīng)強(qiáng)毒的感染具有良好的保護(hù)率，被視為很有潛力的重組活載體疫苗。由于PADV3是嗜腸道型病毒，廣泛存在于豬群中，具有嚴(yán)格的宿主特異性，僅感染豬，并且在感染仔豬后臨床癥狀不明顯或只出現(xiàn)輕微腹瀉。較人腺病毒（HADV）而言，PADV3在豬體內(nèi)基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高，可逃逸機(jī)體存在的PADV3的抗體干擾，并且克服了常規(guī)腺病毒在宿主動(dòng)物體內(nèi)免疫效果較差的缺陷，具有較好的腸道嗜性，口服免疫效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過HADV5。PADV3作為基因表達(dá)載體不僅能提高基因轉(zhuǎn)移的效率，而且具有攜帶外源基因容量大、可表達(dá)接近翻譯后成熟水平蛋白質(zhì)等特點(diǎn)，因此在疫苗的制備和基因治療上有廣泛的應(yīng)用前景。不同動(dòng)物來源的腺病毒編碼的衣殼蛋白基因（Hexon）是病毒粒子的重要組成部分，種屬之間的Hexon基因同源性很低。該蛋白不僅是病毒的主要保護(hù)性抗原，也是同種動(dòng)物不同毒株之間血清型差異的決定性蛋白，這一點(diǎn)也被認(rèn)為是將HADV作為載體開發(fā)豬用基因工程疫苗或?qū)ADV作為人用基因治療載體的一個(gè)優(yōu)勢(shì)（宿主體內(nèi)無異源腺病毒抗體而不干擾載體疫苗效果）。汪鎮(zhèn)南等（2015）從臨床腹瀉病料分離到的PADV中克隆了其主要的Hexon基因，利用原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)制備免疫原，免疫家兔后制備抗PADV-3Hexon蛋白多克隆抗體，試驗(yàn)結(jié)果表明該多克隆抗體免疫活性良好，為進(jìn)一步開展中國PADV流行病學(xué)調(diào)查、疾病診斷和疫苗研制提供基礎(chǔ)材料。

3 腺病毒的流行病學(xué)特點(diǎn)

PADV感染極其普遍，豬場感染率很高，研究表明，英國西南部地區(qū)26%～53%的豬群具有種群特異性抗體，加拿大魁北克市PADV4感染率高達(dá)18．3%。在自然條件下，PADV主要通過糞口途徑或者氣溶膠暴露進(jìn)行水平傳播，豬是目前已知的唯一易感動(dòng)物。感染PADV后的最常見的臨床表現(xiàn)是以水樣或糊狀樣糞便為特征的胃腸道疾病，也有呼吸道系統(tǒng)性、神經(jīng)性病癥與PADV感染相關(guān)的報(bào)道。初乳缺乏的仔豬在口鼻接種PADV 3～4 d后可見典型腹瀉，能夠持續(xù)3～6 d，并出現(xiàn)脫水和體重減輕現(xiàn)象，但死亡率很低。

4 腺病毒檢測技術(shù)研究進(jìn)展

PADV感染的診斷方法主要為電鏡觀察、免疫過氧化酶技術(shù)等。但是此類方法較昂貴，耗時(shí)長，不適用于臨床上對(duì)大量樣品的檢測。國內(nèi)李瑞江等（2006）為了解PADV在國內(nèi)感染狀況，從廣西各地送檢的具呼吸道病癥的仔豬收集氣管分泌物，用套式PCR方法，首次擴(kuò)增出PADV3和PADV5，證實(shí)發(fā)病仔豬呼吸道存在PADV的感染，為PADV的分離鑒定以及表達(dá)載體的構(gòu)建打下基礎(chǔ)。陳穎杰（2010）也根據(jù)PADV保守區(qū)六鄰體基因設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，建立了套式PCR的檢測方法，對(duì)病豬的氣管分泌物作檢測。檢測51份病料，只有1份為豬腺病毒陽性，而分離病毒時(shí)卻能從13份“陰性”病料中分離出10株P(guān)ADV，而且為不同的毒株，病毒分離的陽性率達(dá)76．9%。這說明PADV在豬群中的感染是普遍的，套式PCR的方法盡管靈敏度很高，但是它受很多因素的影響，比如在核酸抽提過程中受到人為因素的影響而使核酸丟失或者帶有太多的雜蛋白而影響酶的作用。試驗(yàn)用PK-15細(xì)胞分離到的10株P(guān)ADV，其中有4份能引起細(xì)胞病變（CPE），其余6份不引起CPE，隨機(jī)抽取引起CPE的GXTL株和不引起CPE的GXHP株克隆與測序，經(jīng)序列比較發(fā)現(xiàn)GXTL株與PADV5的同源性最高，達(dá)97．4%，屬于PADV5，GXHP株與PADV3的同源性最高，達(dá)95．3%屬于PADV3。李海錦（2015）建立了血清1、3、4、5型的多重PCR方法，并對(duì)豬場收集的318份豬肛門拭子，80份豬肺臟，173份豬鼻拭子，180份豬血清進(jìn)行檢測。結(jié)果肛門拭子的PADV檢測陽性率為20．75%，鼻拭子的陽性率為10．4%，血清的陽性率為1．66%，肺臟陽性率為7．5%，為PADV感染的調(diào)查和診斷提供了重要的技術(shù)支持。方和俊等（2015）根據(jù)PADV3 E1B基因保守序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物，建立了檢測PADV3的SYBR GreenⅡ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR方法，可實(shí)時(shí)定量分析病毒核酸在動(dòng)物體內(nèi)各器官的含量，對(duì)采自四川省眉山、遂寧、樂山、成都、瀘州、綿陽地區(qū)規(guī)?；i場的56份腹瀉糞便進(jìn)行檢測，其中11份檢測呈陽性，陽性率為19．64%；常規(guī)PCR檢測結(jié)果有8份呈陽性，陽性率為14．29%，表明實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢出率高于常規(guī)PCR，并且陽性符合率為100%。為PADV3感染的早期診斷、分子流行病學(xué)調(diào)查奠定了基礎(chǔ)。應(yīng)用該方法對(duì)我國四川省23個(gè)規(guī)模化豬場進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果顯示PADV3陽性率達(dá)到14．72%，在腹瀉豬群中陽性率為17．34%，并且顯著高于非腹瀉豬群（6．41%），PADV3在保育豬群中感染率最高（26．32 %），表明PADV3在我國四川省豬群中廣泛流行。丁彥彬等（2016）對(duì)屠宰場肥豬及豬場發(fā)病豬采集的65份肺臟樣本，不同規(guī)模豬場35～45日齡保育豬采集的55份肛門拭子進(jìn)行了PADV4的PCR檢測。所檢測的13份陽性樣本序列與PADV4 fiber蛋白基因序列的同源性達(dá)96．4%～99．6%，說明由生豬肺臟及肛門拭子樣本中擴(kuò)增得到PADV4基因。提示PADV4可能在生豬呼吸道疾病體系中發(fā)揮一定作用。PADV感染后主要以腹瀉為臨床癥狀，仔豬口服接種PADV4后，3～4 d發(fā)生水樣腹瀉，并持續(xù)到感染后3～6 d。試驗(yàn)所檢測到的5份陽性肛門拭子樣本，有3份來自于腹瀉癥狀豬只，2份來自于健康仔豬，證明在有腹瀉癥狀和健康的豬只中，都能夠檢測到PADV4。表明PADV4不一定是導(dǎo)致生豬腹瀉的主要病原，但其可能作為條件性病原加重生豬的腹瀉癥狀，同時(shí)也可能與其他腹瀉病原發(fā)生混合感染。

5 小結(jié)

目前對(duì)于PADV感染尚無特效治療藥物。對(duì)PADV的防治主要是加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、增強(qiáng)豬群體質(zhì)、減少應(yīng)激、做好環(huán)境衛(wèi)生等工作。盡管PADV在腹瀉疫情中占據(jù)重要作用，但并不能排除其他病原混合感染、協(xié)同感染的可能。由于PADV對(duì)于豬的危害不是很明顯，一般都是亞臨床癥狀，因此關(guān)于本病毒的研究人們著力集中在PADV作為表達(dá)載體廣泛應(yīng)用于基因治療和基因疫苗方面。

2017-01-06）

山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2015GSF121027）；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（SDAIT-08-17）

莊金秋（1978-），女，山東濰坊人，獸醫(yī)碩士，副研究員，主要從事細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物用病毒疫苗研制